この方法は、感染によって最も影響を受けた2つの器官内のウイルス感染および病因の決定要因の同定など、HIV分野の主要な質問に答えるのに役立つ。実際、重要な高度な運転疾患の進行は組織で起こる。感染の特徴と複雑さは、循環中の細胞によって十分に反映されていないか、体外で単離され、感染している。
HIVの病因を研究するex vivo組織培養の主な利点は、2〜3週間の間、細胞間の元の容量および機能的関係を保持することです。まず、100ミル×20ミリメートルのペトリ皿に20〜30ミリリットルのCMTを充填します。
両側のスポンジを濡らし、スポンジが1分間中程度に浸るようにします。滅菌ヘラを使用して、ペトリ皿の底にスポンジを約2分間押し付けます。無菌はさみを使用して、水分補給されたゼラチンスポンジを約1平方センチメートルの等しいサイズの部分にカットします。
その後、鉗子を使用して、培養プレートの各ウェルに1つのスポンジピースを転送します。扁桃腺用の6ウェルプレートの各ウェルに3〜4ミリリットル、子宮頸部用の12ウェルプレートに1つの井戸あたり1ミリリットルを加えます。プレートをインキュベーターに入れ、37°C、5%CO2、および90%以上の湿度に設定して、組織の外植物をスポンジに積み込む準備が整います。
無菌鉗子を使用して、輸送容器から100ミリメートルのペトリ皿にCMTの10〜20ミリリットルを含むトンシルを移します。ペトリ皿の蓋を切断面として使用して組織を解剖します。鉗子で組織を穏やかに保持し、滅菌メスとブレードを使用して、各扁桃腺を異なる大きな部分に切断します。
鉗子とメスを使用して、焼灼、血まみれ、筋腫組織、扁桃色または緑褐色を含む部品を除去します。各組織片を厚さ約2ミリメートルのスライスに切ります。前の手順のように、不要なパーツを削除します。
その後、組織スライスを2ミリメートルの厚さのストリップにカットします。最後に、組織ストリップを2ミリメートルの厚さのブロックに切ります。外植を10~20ミリリットルのCMTを含む新しい100ミリメートルのペトリ皿に移し、解剖を進めながら組織乾燥を避けます。
解剖の終わりに、外植分布をランダム化するためにプレートを旋回する。鉗子を使用して6ウェルプレートの各ゼラチンスポンジの上に9つの組織外植物を置き、それらの間にスペースを可能にします。プレートをインキュベーターに戻します。
典型的には、外植は一晩培養される。HIVによる接種は翌日に行われる。これは、細菌や真菌の汚染が培養中に発生していないことを確認することです。
また、細胞は解剖直後に組織外植を退行する傾向がある。ピペットで6ウェルプレートに培地を吸引し、消毒液を入れた容器に捨てます。プレートを傾け、ゼラチンスポンジをウェルの上部にそっと押し込み、底に媒体を集めます。
吸引し、培地を廃棄する。その後、各ウェルにCMTの3〜4ミリリットルを追加します。今、摂氏37度で水浴中のHIV-1ウイルス製剤を解凍します。
ゼラチンスポンジ上の9つの外植木の上に直接ウイルス接種をピペット。プレートをインキュベーターに戻します。ペトリ皿の蓋を切断面として使用して組織を解剖します。
組織を鉗子で穏やかに保持し、外細胞および/または子宮内膜の粘膜をメスと刃で下の間質および粘膜から分離し、粘膜のストリップを得る。粘膜を2ミリメートル幅のストリップに切ります。できるだけ多くの粘膜下層を取り除いて捨て、厚さ2ミリメートルの組織のみを残します。
その後、ストリップを2ミリメートルの厚さのブロックにカットします。組織外植物を新しい100ミリペトリ皿に移し、10〜20ミリリットルのCMTを含み、解剖を進めながら組織乾燥を避ける。解剖の終わりに、外植分布をランダム化するためにプレートを旋回する。
無菌鉗子で、無菌1.5ミリリットル円錐形の管に外植を移す。ピペットを使用してチューブ内の任意の媒体を取り除く。最適な結果を得るには、子宮頸部の外植体を手術後できるだけ早く処理し、感染させる必要があります。
あるいは、組織は一晩4度でCMTに水没して、解剖直後に感染して保存することができる。37°Cの水浴でHIV-1調製物を解凍します。解凍したら、外植を含むチューブにウイルスを移します。
チューブをサーモシェーカーに移し、300rpmで摂氏37度で2時間インキュベートします。30~60分に数回、チューブを軽く反転させます。一方、滅菌リン酸緩衝生理食塩水のウェルあたり3〜4ミリリットルで6ウェルプレートを充填します。
HIV-1でのインキュベーションの終わりに、ピペットを使用して、外植物を含むチューブ内のすべてのウイルス製剤を消毒液を含む容器に捨てます。次に鉗子とピペットを使用して、外植物をPBSを含む6ウェルプレートに移します。外植木を室温で1分間PBSで休ませた後、PBSを井戸に2〜3回軽くピペットで洗います。
次いで、ピペットを用いて殺菌液を含む容器にPBSを捨てます。各井戸に新しいPBSの3〜4ミリリットルを追加します。合計3回の打ち上がりにはさらに2回繰り返します。
組織乾燥を避けるためにスポンジに外植を移す直前にPBSを捨てます。今、各ゼラチンスポンジの上に5〜8つの外植木を12ウェルプレートに移すために鉗子を使用してください。プレートをインキュベーターに戻します。
培養培地のサンプルをピペットで採取し、無菌1.5または2ミリリットルのスクリューキャップチューブに移してマイナス80°Cで貯蔵します。滅菌鉗子で組織外植を収穫し、無菌1.5または2ミリリットルのスクリューキャップチューブに外植体を移す。実験で必要に応じて組織サンプルを処理または保存します。
残存培養液をピペットでウェルに吸引し、殺菌液で容器に捨てる。プレートを傾け、ゼラチンスポンジをウェルの上部にそっと押して、培地を底に集め、吸引して捨てます。次に、各井戸に3〜4ミリリットルの培養培地を加えます。
滅菌鉗子を使用して、プレートをインキュベーターに戻す前に、培地に落とされた組織外植物をゼラチンスポンジに戻す。培養の最後に、危険な生物学的処理に関する研究所の規制と特定のリスク評価に従って、アポサイト容器内のすべての生物学的廃棄物を処分する。ドナー間変動は、同じウイルス接種に感染した3つの異なるドナーからの子宮頸組織について示されるように、組織外植培養上清におけるHIVコアタンパク質p24 gagの濃度によって測定されるHIV-1複製に影響を及ぼす可能性がある。
最初のドナーにとって、HIV-1 BaL単独で感染した外植物の培養培地におけるp24ギャグの蓄積は、製品感染を明確に示す。HIV複製を完全にアブロゲートする抗レトロウイルス薬3TCを陰性対照として用いた。3TC処理された外植物の培養培地で測定されたp24ギャグの量は、培養中に組織外植物によって特異的に吸収され放出されるウイルス接種の割合を明らかにする。
第二のドナーからの組織外植物では、HIV-1腸感染は、p24 gagの濃度が時間の経過とともに着実に減少し、p24ギャグ定量によって感染の中止または検出不能を示す。これは、同様のHIV複製動態を示す3TC処理されたコントロール外植によって確認される。第3のドナーからの組織外植物の感染は、ウイルスの量をほとんど得ない。
この場合、デノボウイルス産生による感染の存在を確かめるために、陰性対照として3TC治療を含める必要がある。この手順に従って、フローサイトメトリーまたは免疫染色のような分析方法は、目的の細胞集団の表現型、割合、または組織位置に関する質問に答えるために異なる時点で行うことができる。実験を設計する際には、選択した実験読み出しに対するドナー間変動の影響を推定することが重要である。
ドナー間変動は、厳格な臨床的および、おそらく実験的包含および排除基準を設定することによって部分的に制御することができる。ヒト組織培養は、ワクシニアウイルスやヘルペスウイルスなどHIV以外の微生物の病因を研究するために使用できる。彼らはまた、抗菌毒性と倫理研究のための前臨床プラットフォームとして使用されています。
健康な人からでも、すべてのヒト標本は感染因子を収容することができることに注意してください。適切な教育、訓練、保護は、あなたとあなたの同僚の安全を確保するために、人間の組織を処理するために必要とされます。
