この作品は、ロズウェルパークがん研究所に研究所アレルギー感染症のグラントR01AI079253（BHS）は、国立がん研究所がんセンターによる支援助成CA016056によってサポートされていました。

本研究では、動物で実行されたすべての手順は、ロズウェルパークがん研究所で動物実験委員会によって承認され、すべての状態を遵守し、連邦政府及び保健規則の国立研究所れた。 1。 インビボマクロファージのラベリング注：PHK26（iv）は、静脈内投与された場合、循環中および組織中の両方食細胞によって取り込まれる親油性染料である。 PKH26は、マクロファージの収穫後の操作量を最小限にするためにin vivo標識のために使用した。 PKH-26を安定して長期間にわたって肺胞マクロファージに蓄積するという利点を有する。行政だけ肺胞マクロファージを安定PKH26 8、9で標識したまま循環からすべての標識細胞の排除を可能にした後10日を待っています。 PKH26は、互換性の励起（551 nm）を照射（567 nm）の特性を持つ赤の蛍光色素であるローダミンまたはフィコエリス検出システムと。いずれの標識操作は、生存率の低下を含め、アーティファクトを導入することができます。我々は（NADPHオキシダーゼ欠損対例えば 、WT）異なるマウスの遺伝子型におけるマクロファージの標識に同じアプローチを使用するので、これらのアーチファクトの影響は均一になります。 <ol><li> PKH26の原液（エタノール中1×10 -3 M）メーカーが提供する希釈剤Cの1:5に希釈する。 </li><li>各マウス1/2ミリリットルのインスリンシリンジ（29 G×1/2 &quot;）に希釈したPKH26の負荷を100μl。 </li><li>収穫するには、少なくとも10日前までに静脈内注射（尾静脈または眼窩のいずれか）によりマウスに投与する。 </li></ol>気管支肺胞洗浄による2。収穫肺胞マクロファージ（BAL） 実験に使用するマウスの数は変えることができる。刺激されていないマウスからの典型的な収率は1〜2×10 5肺胞マクロファージの範囲であるが、この数は大幅に浅を変えることができこのようなマウスのサイズ、洗浄を行った人の経験、洗浄液や肺から引き出されたボリュームの点滴の数などの要因に編このプロトコルでは肺洗浄を繰り返した1mlの洗浄液と共に細胞収率を高めるために役立つ閉鎖胸腔を用いて行われる。 <ol><li>滅菌溶液を維持するために、無菌状態を使用してアベルチン麻酔薬の致死量（12.5 mg）を腹腔内（IP）を投与することにより、マウスを安楽死させる。 </li><li> 70％エタノールで徹底的にマウスをスプレーします。 </li><li>胸部を露出させた動物の頭蓋終わり（ 図1A）から肌を削除します。 <ol><li>ただ、ダイヤフラムの下の皮膚の小さなカットを行います。 </li><li>カットに指を挿入し、離れて動物（ 図1A）の頭蓋端から肌を引き出します。 </li><li>首（ 図1A）の腹側を拡張し、頭の上にわずかに押し上げます。 </li></ol></li><li>胸郭を通して小さな穴をカット胸部の右側に肺を収縮させると、次のステップの間に、肺の可視化を可能にする。 </li><li>気管を見つけて、慎重に周囲の組織を離れて解剖。 <ol><li>湾曲したピンセットで唾液腺、胸骨舌骨筋および喉頭などを削除します。 </li><li>慎重に湾曲したピンセットで持ち上げて、ハサミで基盤となる環状軟骨構造を明らかにし、気管（外膜）を覆う薄い組織を切り取る。 </li></ol></li><li>気管にカテーテルを挿入します。 <ol><li>湾曲したピンセットを用いて、気管（背側に）背後に縫合糸を配置し、開口部を通って10cmの長さを引き出します。 </li><li>輪状（軟骨の肥厚したリング）上に起動すると、慎重に気管が胸骨の後ろに消え気管停止まで22のGカテーテルを導く。 </li><li>しっかりとぴったりフィットするため、気管およびカテーテルの周りに縫合糸を結ぶ。カテーテルから針を外します。 </li></ol></li><li> 4方活栓を組み立てます。 <ol><li>埋めるオン6 mlのDPBS、1％FBSでシリンジ及び図1Bに示すように、4方コックに取り付けられる。 </li><li> 4方コック（ 図1B）に示される位置に空の6ミリリットルの注射器を取り付けます。 </li><li>カテーテル4方コック（ 図1B）上で開いているポートを接続します。気管からカテーテルを取り除くしないように注意してください。 </li></ol></li><li>肺から洗浄液を収集します。 注：研究者は、組織への損傷の可能性を最小限にする洗浄液の低いボリュームを使用することを選ぶことができる。それは、同じアプローチが一貫してすべてのマウスのグループに適用されることが重要である。 <ol><li>空のシリンジが閉じているので、ストップコックのハンドルを回して、 ゆっくりと肺を膨らませるために〜1ミリリットルのDPBS、1％FBSを注入します。ステップ2.4​​の穴のカットを通じて肺インフレを観察します。 </li><li>肺をover​​inflateないように注意してください。 </li><li>フルシリンジが閉じているように、ストップコックのハンドルを回して、慎重にインフルエンザを撤回<html>肺からのID。 </li><li>肺はステップ1.4の穴のカットを通じて収縮を観察。カテーテルは、良いドローを得るために、わずかに前後に移動させる必要があります。気管内カテーテルを維持するために、特別な予防措置をとる。 </li><li>すべてのDPBS、1％FBSを肺から注入され、撤回されるまで繰り返します2.8.1-2.8.4 5-6Xを繰り返します。注：肺液の回収が注入される流体の100パーセントではありません。 </li></ol></li><li>を50mlコニカルチューブに洗浄液を持つ空のシリンジ。室温で細胞を維持する。 </li><li>室温で5分間、300×gで遠心分離して細胞をペレットにし、上清を捨てる。所望の場合、これは、サイトカイン分析のために保存することができる。 </li><li> 10％FBSを1〜5ミリリットルRPMI1640中で細胞を再懸濁し、血球計数器でカウントされます。刺激されていないマウスでは、BALによって採取された細胞の&gt; 95％が細胞学によって確認することができるマクロファージであることが期待される。 </li></ol> 3。培養および収穫菌&gt; アスペルギルスフミがライフサイクルの全段階を通して、GFPを発現し、このプロトコルで使用される&quot;：胞子、germlingsと菌糸この菌株は、博士のマーゴ·ムーア、サイモンフレーザー大学、バーナビー、BC州、カナダから提供された。 <ol><li>クロラムフェニコール（0.05グラム/ L）およびゲンタマイシン（0.5 g / L）とを有する斜面寒天サブローブレインハートインフュージョン（BHI）上にGFPを発現するアスペルギルス·フミガタス株の分生子板。 </li><li>緩く室温で7〜10日間頂いた暗闇の中でインキュベートする。 </li><li> DPBS中0.01％のTween20を10mlで洗浄傾斜による収穫生子。軽く緩めstripetteで真菌をこすり。収率を高めるために傾斜を数回すすいでください。 </li><li> 50ミリリットルコニカルに100μmのセルストレーナーを通して生子懸濁物を渡す。 </li><li> 10分間400×gで遠心分離してペレット生子。 </li><li> 50ミリリットルのDPBSに再懸濁分生子と血球計数器を用いてカウントします。 </li><li> DPBSで二回洗浄し、希望concenに希釈するtration。 </li></ol> 4。真菌チャレンジおよび共焦点顕微鏡宿主防御におけるマクロファージNADPHオキシダーゼの役割を調査するために、貪食アスペルギルス胞子の成長を制御するための3つの遺伝子型のマウスからの単離された肺胞マクロファージの能力を評価した。本研究で用いた遺伝子型が含まれる。 / 1）は、野生型マウスは、2）NCF1 * / *マンガンマウス自然発生NCF1変異を有する（NCF1は彼らにNADPHオキシダーゼ欠損を残しP47のphoxの 、食細胞NADPHオキシダーゼの必須コンポーネント）をコードし、3）NCF1 * NADPHオキシダーゼ活性は、単球/マクロファージ集団10,11で再構成された*のMn +トランスジェニックマウス（MNは、ヒトCD68プロモーターの制御下で野生型NCF1を保有するトランスジーンを示す）。 共焦点顕微鏡は、存在のために、このアッセイに最適ですそして、スライド上の非貪食分生子の成長。共焦点顕微鏡は、Z軸内の個々の面の可視化を可能にし、周囲に成長しているのではなく、マクロファージ内部の菌との区別が可能になります。すべての共焦点画像を、63X油浸対物レンズを用いて取得される。 Zスタックは、2.5の電子ズーム倍率で取得されています。 Zスタックの厚さは、視野の上部と下部を見つけるためにDAPIおよび明視野画像を用いて決定される。 Zスタックは、〜1μmの厚さの個々のスライスを14から24ミクロンの範囲であった。マクロファージの定量化のために、1X電子ズームの単一スキャンは遺伝子型につき10視野で行った。無傷のマクロファージはそれぞれPKH26および膜および核のDAPI染色に基づいて同定した。分生子は、FITC発現と明視野像に基づいて同定した。 <ol><li>無菌カバーグラス、プレートを準備します<ol><li>生物学的安全キャビネットの下で、70％のエタノで22×22ミリメートルのカバーガラスを浸す5〜10分間リットル。 </li><li>滅菌PBSでカバーグラスをすすぐ。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、穏やかに無菌充填単独で6ウェルプレートの各ウェルの底に単一のカバースリップを置く。 </li></ol></li><li>シード〜1×10 6個の収穫PKH26は、各カバースリップ上に300μlのRPMI 1640、10％FBSに懸濁し、肺胞マクロファージを標識した。正確な数は、収穫量に応じて変えることができる。 </li><li>マクロファージは、一晩で5％CO 2、37℃でインキュベートすることにより接着させる。 </li><li>翌朝、〜1×10 7 GFP発現Aを追加フミガーツス分生子を100μlの予め温めた（37℃）RPMI 1640、10％FBSに懸濁した。 </li><li> 5％CO 2で37℃のインキュベーターにプレートを返します。 </li><li>細胞を室温で2時間、最低固定または4℃で一晩されるべきである3,7、および14時間の修正セルの各ウェル（最終濃度1％ホルムアルデヒド）、2％ホルムアルデヒドの等容量を添加することによって。ための場所プレート一晩4℃での初期の時点。最終時点（14時間）の場合は、2時間室温で細胞を固定。 </li><li>固定後、静かにピンセットを用いてカバースリップを削除し、DPBSですすぐ。 </li><li>折り畳まれたキムワイプにカバースリップの端を配置することで余分な水分を取り除きます。 </li><li>ガラス顕微鏡スライドにDAPIで6μlの蛍光封入剤を適用します。 </li><li>スライドにカバーガラスの一端を置き、ゆっくりと封入剤に分解セル側にドロップします。メディアをマウントすると、拡散し、カバーグラスの下に均一な層を形成することになる。カバースリップ上に押す必要がない。 </li><li>明確なマニキュアでカバースリップの端をシールし、空気乾燥させ。 </li><li>ストアは、共焦点顕微鏡によって分析することができる状態になるまで、室温で（遮光して）スライドボックススライドを用意しました。 </li></ol>

<ol>
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Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li><li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates.">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li><li>Cornish, E. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+polarization+of+alveolar+macrophages+and+bone+marrow-derived+monocytes+following+chemically+and+pathogen-induced+chronic+lung+inflammation.">Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation.</a> J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+spores+depends+on+the+anatomical+source+of+the+macrophage.">Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage.</a> Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).</li><li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells.">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

一緒にin vivoで真菌のチャレンジでマクロファージの抗真菌活性のex vivo分析のためにこのアプローチを使用して、我々は以前に、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼはA.に対する防御において重要な役割を果たしていることが実証されフミ4。孤立した肺胞マクロファージの使用は、生体内でのアスペルギルスに対する防御他の免疫細胞（ 例?...

肺胞マクロファージは、吸入微生物が発生した最初の行の貪食細胞である。マクロファージは、病原体認識受容体によってアスペルギルスモチーフを認識し摂取および吸入胞子（分生子）の成長を制限し、炎症反応を開始する。食細胞NADPHオキシダーゼは、スーパーオキシドアニオンおよび下流の活性酸素中間体（ROIを）への分子状酸素に変換します。慢性肉芽腫症（CGD）は、重度の細菌および真菌感染により、過度の炎症反応によって特徴づけられるNADPHオキシダーゼの遺伝性疾患である。 NADPHオキシダーゼが重要ではあるが、好中球媒介宿主防御のための1から3は 、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの重要性は十分に定義されていない。以前の研究では好中球が主に菌糸のステージ5をターゲットに対し、肺胞マクロファージは、 アスペルギルス胞子を摂取し、殺すことが示されている。しかし、矛盾するresulがあったA.の成長を制御するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの役割としてのts フミ胞子 6、7。 このメソッドの目的は、A.に対する宿主防御を仲介するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの特定の役割を描写することであったフミ胞子 。私たちは、肺胞マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼが貪食Aの成長を制御していることがわかっフミは 4胞子。最も密接に吸入菌類に対する宿主応答をモデル化するために、我々はすぐに犠牲を次の刺激されていないマウスから気管支肺胞洗浄により収穫肺胞マクロファージを使用していました。孤立した肺胞マクロファージの使用は、生体内でのアスペルギルスに対する防御他の免疫細胞（ 例えば 、好中球を募集）が存在しない場合に、その抗真菌活性に焦点を当てることができました。この方法では、肺胞マクロファージは、収穫後の操作の量を最小にするように収穫する前にインビボで染色した。&lt;/ pの&gt; この議定書のもう一つの利点は、GFPを発現するAの使用でフミ株 。この菌は菌糸のステージを通じて生子段階からのGFPを発現し、さらに染色の必要がありません。さらに詳細な画像を得るために、我々は得られた画像から3次元構造の再構築を可能にし、共焦点顕微鏡を選びました。三次元再構成は、菌糸がマクロファージやを通じて周囲に成長しているのではなく、区別できるようになります。分生子はまた、細胞外に対する細胞内のように正確に区別することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PKH26GL-1KT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,2,2 Tribromoethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T48402</td>
			<td>Used to make AvertinAnesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A-1685</td>
			<td>Used to make AvertinAnesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4CL</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A0171</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">KHCO3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P91444</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter</td>
			<td style="width:71px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">381523</td>
			<td>Insyte Autoguard Winged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 ml syringes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4-way stopcock</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-700-077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">suture thread</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gauze sponges (4 inch square)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30396.03</td>
			<td>heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hema 3 Stain Set</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-122-911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytoseal 60</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td>
			<td style="width:71px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">297252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 micron Cell Strainers</td>
			<td style="width:71px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">64753-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scissors</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leica DM1000 light microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytospin 2 centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37 &#176;C, 5%&#160; CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">22X22 mm micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366-227</td>
			<td>glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0502-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vectashield Mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica TCS SP2 system with a laser point scanner</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy

肺は、宿主細胞は日常的に微生物および微生物産物に曝露されるインターフェースである。肺胞マクロファージは、吸入真菌および他の微生物が発生した最初の行の貪食細胞である。マクロファージおよび他の免疫細胞が病原体認識受容体によってアスペルギルスモチーフを認識し、下流の炎症反応を開始する。食細胞NADPHオキシダーゼは、活性酸素中間体（ROIを）を生成し、宿主防御のために重要である。 NADPHオキシダーゼが重要ではあるが、好中球媒介宿主防御のための1から3は 、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの重要性は十分に定義されていない。本研究の目的は、A.に対する宿主防御を仲介するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの特定の役割を描写することであったフミ 。私たちは、肺胞マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼが貪食Aの成長を制御していることがわかっフミは 4胞子。ここでは、マウスαの能力を評価するための方法を記載貪食アスペルギルス胞子 （分生子）の成長を制御するためlveolarマクロファージ（AM）。肺胞マクロファージは、 インビボで染色し、10日後に気管支肺胞洗浄（BAL）マウスから単離される。マクロファージは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するA.を播種し、次いで、カバーガラス上に播種するフミ胞子 。特定の時間に、細胞を固定し、貪食された胞子を有する無傷マクロファージの数を、共焦点顕微鏡法によって評価される。

<html>刺激されていないマウスからBALによる肺胞マクロファージの収集は、細胞診に基づいて&gt; 95％純粋な集団になります。 3と7時（ 図2）の時点では、真菌増殖の菌糸段階に先行し、遺伝子型間生子の貪食効率の比較を可能にします。遺伝子型は、組織浸潤性菌糸のステージ（ 図3）に貪食された分生子の転移を阻害する能力に関して比較することができる場合に14?...

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Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K ビュー.  Roswell Park Cancer Institute. 共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。 

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

免疫・感染学

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング<em&gt;のApc<sup&gt;最小/ +</sup</em&gt;腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...