私たちは 、APC 最小/ +マウスのジェノタイピングのための英ゆうに感謝したいと思います。この研究は、INSERMと国立衛生研究所からの助成金（CA057621およびAI053194）からの資金によってサポートされていました。

注：すべての動物実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）、UCSFによって承認された手順に従って行った。すべての画像化実験は、非生存手順た動物を、画像取得の終了の直後に安楽死させた。 マウスの1世代注：Apcの最小/ +マウス、APC遺伝子上の変異を有する、自然に小腸で50-100腺腫を開発しています。 <ol><li>クロスApcのアクチンプロモーター下にECFPを表現ACTB-ECFPラインと最小/ +マウス、および骨髄細胞を検出するために、C-FMSプロモーター下にEGFPを発現するのc-FMS-EGFPライン、とのさらなる。 ACTB-ECFPおよびc-fmsの-EGFPについてヘテロ接合性の動物を、蛍​​光を検出するために使用される。 </li><li>画像明らかに検出腺腫に生後3〜4ヶ月でマウスを使用してください。 </li></ol> Mの調製手術前aterials NOTE：顕微鏡セットアップの詳細は、以前に6,7に記載されている。 <ol><li>顕微鏡<ol><li>加熱ブランケットをオンにします。 488nmの励起固体を405nm、561 nmの波長は640nmレーザ用のアルゴンレーザーをオンにします。顕微鏡をオンにし、回転するディスク制御部と、AOTF、レーザ制御部と、カメラコントローラ。 </li><li>赤色LEDを点灯顕微鏡シャッターを開きます。コンピュータとカメラのソフトウェアの電源をオンにします。 </li></ol></li><li>イメージングプラットフォーム<ol><li>ステージインサートが汚れていないことを確認してください。それ以外の場合は、石鹸と水、次いで、乾燥した清潔な。 </li><li> 2カバースリップを取り、挿入時に、それらを保護するためにラボのテープを使用しています。ステージ上でインサートを置き、アルコールワイプで清掃してください。 </li><li>ラボのテープを使用して、ステージの右側に加熱ブランケットを添付します。 </li><li>ノーズコーンにゴム製のダイヤフラムの整合性を確認し、necessarに応じて変更しますyを。ガーゼとラボテープを用いて動物にイソフルラン麻酔送達用ノーズコーンを置き、固定します。 </li></ol></li><li>イソフルラン麻酔システム<ol><li>イソフルランタンクを補充。 </li><li>真空をオンにして、/分1.2リットルに調整します。 </li><li>噴霧器に蒸留水を追加し、イソフルランシステムにネブライザーを接続してください。 </li><li>酸素分析計の電源を入れ、イソフルランシステムに接続します。酸素タンクをオンにして、酸素濃度計が100％を示していることを確認してください。 /分0.2リットルのO 2流量を調整します。 </li><li>窒素タンクをオンにして/分0.8 Lの流れを調整します。酸素濃度計は21％を示していることを確認してください。 </li></ol></li><li>手術ツールとプラットフォームの準備<ol><li>石鹸と水で切開鉗子と鋏の2ペアを清掃してください。 </li><li>ホットビーズ滅菌器の電源を入れ、250℃に到達しましょう​​。 30秒間の手術ツールを滅菌する。彼らは冷やすましょう。 </li><li>手術台にラボおむつカバーを置きます。 </li><li>外科的プラットフォームとして発泡スチロールの蓋を使用します。ラボおむつカバー片で覆う。マウスを剃毛した後に変更するためにラボおむつカバー2枚目を準備します。 </li><li>覆われた発泡スチロールの蓋の上麻酔のラインにノーズコーンを置き、いくつかのテープで発泡スチロールの蓋（しないラボおむつカバー上）に添付して所定の位置に維持するためにノーズコーンの両側に2本の針を使用しています。 </li><li>ベタジン、アルコール綿、滅菌ガーゼ、スーパー接着剤、顕微鏡用スライド、電気シェーバー、とラボテープの4個を組み立てます。 </li></ol></li></ol>注射剤の調製<ol><li>水面下では、2000 kDaのローダミン - デキストラン（4 mg / mlの100μlの中にストック·AF647共役のLy-6G（群Gr1）抗体（1 mg / ml）を、7μlのインスリン注射器（28 Gのx½中）を調製）後眼窩注射のため。これらの動物に発症する貧血は、尾静脈のdifficuを作るので、後眼窩注射は、Apcの最小/ +マウスで推奨されているLTは、皮膚を通して検出する。 </li><li>腸の蠕動運動を減衰させるために画像化する前に、1mg / kgの皮下（sc）を150μlのPBS中に希釈アトロピン注射して第二のインスリン注射器を準備します。 </li></ol>イメージングのための腸の4。準備<ol><li>誘導室に麻酔ラインが開放されており、手術台や顕微鏡へのラインが閉鎖されていることを確認します。 </li><li>麻酔室に動物を転送します。麻酔チャンバーを閉じ、（21％O 2で）4％にイソフルランをオンにします。 </li><li>マウスは（5-6分後に）深くゆっくりと呼吸すると、その腹部に外科的ステージに転送し、群Gr1抗体溶液および/またはデキストラン溶液の眼窩を注入。 </li><li>外科プラットフォームにリンク麻酔ラインを開きます。麻酔室にラインを閉じ、麻酔コーンでの鼻との背中の上でマウスを置く。 </li><li>イソフルランを削減2.5％4％の濃度。 </li><li>マウスは十分にそのフットパッドをつまんで角膜反射をテストすることによって麻酔をかけていることを確認します。 </li><li>麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に眼科潤滑軟膏を追加します。 </li><li>ラボテープを追加することにより、外科的ステージにマウスの手足を固定します。 </li><li>電気シェーバーを使用して、腹面から髪を削除します。また、買収前に酸素濃度計を配置するために、左後肢から毛を取り除く。外科段階から研究室のおむつカバーを外し、髪の汚染を避けるためクリーンなものと交換してください。 </li><li>アルコールワイプとベタジンで腹面を消毒する。 </li><li>マウスのワン脇腹に皮下 （3.2）アトロピン液を注入。 </li><li>皮膚やハサミを使用して、腹膜や鉗子の1対を介して1センチメートル腹側正中切開を行います。慎重に腸3-4センチ引き出し、イメージにつまたは複数の腫瘍を同定。 </li><li>ガラスMICRを取るoscopeスライド位置上部の腫瘍を、その上に、腸のループ。 </li><li>スライドに付加する腸に沿っていくつかの場所にいくつかのスーパー接着剤を追加します。接着剤が乾燥するために1つの分待ちます。共焦点とその局在を容易にするために、腫瘍を指してスライド上に線を描画するためにマーカーを使用してください。 </li></ol> 5。位置決めステージ上のマウスと準備画像取得のための<ol><li>手足からラボテープを外します。 </li><li>顕微鏡ステージへの麻酔ラインを開き、外科プラットフォームに1を閉じます。 </li><li>下にその腹側とノーズコーンでの鼻顕微鏡ステージに慎重にマウスを転送します。いくつかの研究室テープで麻酔ラインを固定します。 </li><li>再位置マウスおよび/またはカバースリップをウィンドウのいずれかの中心に腸を持っているためにスライド。そっとラボテープでスライドを下テープで固定します。 </li><li>マウスの左肢に酸素濃度計プローブを取り付けますその心臓および呼吸数に従い、酸素飽和レベル動脈。 </li><li>低体温症を避けるために、加熱ブランケットマウスをカバー。 </li><li>イメージングのために1から1.5パーセント、2.5％からイソフルラン濃度を下げます。 </li></ol>マイクロマネージャーソフトウェアを使用して画像の取得6。 <ol><li>構成設定での画質を向上させるために2,500 rpmまでCSUX速度を上げます。 </li><li> 10X 0.5 NAまたは20X 0.75 NA Fluarレンズ目標を選択することが目的のドロップダウンメニューを使用します。 </li><li>カラードロップダウンメニューからのレーザは405nmを選択してください。 </li><li>ライブをクリックして、顕微鏡でピントを調整します。 </li><li>自動的に画像の極端な画素値に基づいて、表示画像の最大値と最小ピクセル強度を調整する自動クリックしてください。表示画像のピクセル強度のヒストグラムは、メインウィンドウの下部のグラフに示されている。 </li><li>パイパー[コントロールパネル]ウィンドウで、カメラの露出を調整することによりクロック数を（1クロックは33.333ミリ秒）に変更する。 </li><li>信号が最低の暴露と明るすぎる場合には、顕微鏡制御部を用いてレーザ強度​​を低下させる。 </li><li> 488nmで、561 nmおよび640 nmのレーザーライン用の信号強度を確認してください。レーザ自身の制御ユニット（488 nmおよび561 nm）以下顕微鏡制御部と、レーザ強度​​を調整します。 </li><li>マルチDアクイジション·ウィンドウで、タイムポイントボックスをチェックし、時点の数と所望の時間間隔を入力します。 </li><li> Z-スタックボックスをチェックし、「相対Z &quot;を選択し、現在の位置までのZの開始およびZエンド相対を定義します。 注：10Xまたは20X客観的には、離れてそれぞれ3 Z平面、8μm以上4μmで始まります。 </li><li>いくつかの場所を撮像するための複数の位置（XY）ボックスをチェックし、その後、編集位置リストをクリックして4から6の異なる位置をマークします。 </li><li>チャンネルボックスをチェックし、ドロップダウンメニューと標準の[新規]を選択レーザーラインからチャネルを追加（33.333ミリ秒の倍数）各チャンネルの露光の電子。 </li><li> 「マルチD取得」ウィンドウで[保存画像を確認してください。 </li><li>フォルダを選択し、取得したすべての画像は、自動的に指定された名前の接頭辞で、このフォルダに保存されます。 注：各連続取得は、各時点での各色の各Zスライスの個別のTIFFファイルとして個別のサブフォルダに保存されます。 </li><li>マルチDアクイジション·ウィンドウで設定の保存]をクリックしてすべての設定を保存します。 </li><li>取得を開始するために多次元の取得]ウィンドウに取得]をクリックします。 </li><li>オキシメータプローブが使用されていないか、うまく動作しなくなった場合（パルスが安定または検出が困難でない場合）、フットパッドをつまんと角膜反射をチェックすることにより、麻酔の効率化を画像化手順の間に15分ごとに確認してください。マウスはこれらの刺激に応答する場合は、麻酔を調整します。 </li><li>買収後、イソフルランコンセントを増やすことによって、マウスを安楽死させる5％配給。全く呼吸の動きが検出されない場合には、段階からマウスを削除し、頸椎脱臼を行います。 </li></ol> Imarisソフトウェアを利用した画像の解析7。 <ol><li>ファイル（ 補足図1A）.imsへの変換<ol><li>カメラのソフトウェアを開き、[ファイルにバッチコンバーターをクリックします。 </li><li>追加のファイルをクリックして、最初の位置の最初のファイルを選択します。各位置について、この手順を繰り返します。 </li><li>アップロードされたファイルごとに、[設定]をクリックすると、Zスタックのための時間チャンネルについては、「C」および「Z」の設定「t」がこの順序で表示されていることを確認します。 </li><li>任意のフォルダに保存します。ブラウズし、変換されたように、新しいファイルを作成します。 </li><li>すべてのセットをクリックして起動します。 </li></ol></li><li>調整（ 補足図1B） <ol><li>具体的な変換されたフォルダに移動し、最初のファイルを開きます。 </li><li>表示調整ウィンドウでは、背景を調整必要に応じて各チャンネル毎に最小番号を変更することにより、信号遮断。 </li><li>必要であれば、最大数（下位最大数、より高い信号の強度）を変更することにより、信号強度を調整する。 注：信号強度/コントラストの調整は、よりよい視覚化を持つために細胞の挙動または区画のハイライトを有効にしてください。それは、結果自体は変更されません。 </li><li>編集と画像のプロパティをクリックします。 </li><li> x、y、およびzの値に変更し（10×対物レンズ、xとy = 0.712、zは=8μmのために、20X対物レンズ用：xとy = 0.36、zは= 4）を形成した。 </li><li>時間点を調整するためにすべての等距離をクリックします。開始日を追加して、買収の開始時刻。買収（ 補足図1C）の終了日と終了時刻を追加します。 </li><li>映画を見て、再生ボタンをクリックします。 </li><li> [編集]をクリックし、ぼやけた画像を削除するには、時間点を削除します。 </li><li>つの別個の買収峠に参加するにはTHER 1ムービーに、最初の映画の最後の時点に移動し、[編集]をクリックしてください&gt; 2番目のファイルを追加した時点を追加します。 </li></ol></li><li>ムービーとして保存する（ 補足図1D） <ol><li>録音をクリックして、のMOV拡張子と0の圧縮率を選択します。 </li><li> [保存]をクリックします。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. 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J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), e50088 (2013).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Walther, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+prognostic+and+predictive+markers+in+colorectal+cancer.">Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).</li><li>Fearon, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+oncogenic+K-Ras+and+N-Ras+on+proliferation,+differentiation+and+tumor+progression+in+the+colon.">Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon.</a> Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).</li><li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo.">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li><li>Janssen, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+and+oncogenic+KRAS+are+synergistic+in+enhancing+Wnt+signaling+in+intestinal+tumor+formation+and+progression.">APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).</li><li>Takaku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+in+compound+mutant+mice+of+both+Dpc4+(Smad4)+and+Apc+genes.">Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes.</a> Cell. 92 (5), 645-656 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

本論文では、詳細なプロトコルは、腸の漿膜側から撮像生きた動物での数時間のために腸腫瘍における骨髄細胞動態のディスク共焦点画像を回転させる方法が記載されている。 炎症を避けるために、最適な生理学的条件を持つように、腸の画像化は、無傷の器官に行われなければならない。光が上皮に到達する前にそのような平滑筋などの異なる組織層を通過する必要?...

圧倒的な証拠が、腫瘍の微小環境は、線維芽細胞、内皮細胞、免疫および炎症細胞、細胞外マトリックスおよび可溶性因子を含む不均一な細胞集団からなる、ほぼすべてのに寄与することによって、固形腫瘍の開始と進行に重要な役割を果たしていることを示している癌1の特徴。実際、腫瘍進行中に、悪性2に有利な微小環境を生成するために進化し、形質転換癌細胞と間質細胞との間の一定の動的相互作用が存在する。腫瘍微小環境に浸潤する免疫細胞の中では、骨髄細胞を3で最も豊富である。 （TAM）腫瘍関連マクロファージから成る、骨髄由来サプレッサー細胞（MDSCを）、樹状細胞（DC）及び好中球（PMN）、骨髄細胞は骨髄から動員されると次第にサイトカイン、増殖因子及びプロテアーゼ放出、腫瘍に浸潤する促進することができます腫瘍増殖および4を広げる。がん細胞および骨髄細胞間のクロストークが複雑で動的である。従って、それらの相互作用の性質を理解することは、これらの細胞ではなく、抗腫瘍免疫応答に関与する癌の進行を促進する理由を決定するために重要であり、それを制御するための新しい目標を発見するのに役立つ。 生体顕微鏡による直接観察が生きたマウス5の組織内細胞動態に関する情報を提供します。四色は、多領域は、マイクロレンズ付きスピニングディスク共焦点システムは、乳腺腫瘍6内の間質細胞を研究するために設計された。このアプローチは、長期の連続撮影を可能にし、そのような運動アーチファクトを最小化するためには、（a）迅速な画像の取得、（b）は、長期の麻酔、（c）は、異なる細胞型に追従す​​る4色の取得、（d）の蛍光標識のようないくつかの利点を含む異なる腫瘍コンポーネント、および異なる腫瘍微小環境のウィットの（e）の観察マウス変動7-9にマウスを避けるために、同じマウスヒン。この技術により、異なる細胞行動が腫瘍形成の進行段階を表示する乳癌ウイルス（MMTV）プロモーター駆動オーマミドルT癌遺伝子（PyMT）モデルで報告されている。制御性Tリンパ球（Foxp3のEGFP導入遺伝子によって可視化Tregは、）のDC（CD11cの-DTR-EGFP）、癌関連線維芽細胞（FSP1 + / + -EGFP）および骨髄細胞（C-FMSのに対して、血管に近接して優先的に移行-EGFP）は、腫瘍塊内でよりも腫瘍周辺で高い運動性を示す。急性の全身性の低酸素状態において、細胞は、異なっ移行：Tregは6を移動し続ける骨髄細胞とは対照的に移行停止。また、同じマウスモデルでは、腫瘍段階とドキソルビシン感受性の変化を示したが、薬物分布は、薬物反応、およびドキソルビシンに関連している治療は、腫瘍への骨髄細胞のCCR2依存動員につながる。したがって、ライブイメージングはまた、その場および化学療法抵抗10,11の生物学における薬物応答への洞察を得るために使用することができる。 大腸腺腫様ポリポーシス（APC）遺伝子変異は、一般的にヒト結腸直腸腺腫および癌腫12および大腸癌13に非常に高いリスクを与える家族性大腸腺腫症（FAP）、中APC遺伝子結果の単一コピーの変異で起こる。マウス系統のApc 最小 / + は、APC 遺伝子のコドン850での切断変異を運び、自発的にすべての小腸14〜16を介して複数の腸腺腫を開発しています。腹膜腔を開くと、腸へのアクセスのために必要があるため、腸の長期生体内イメージングは​​、原因処置の侵襲性の挑戦である。短期ライブイメージングSTudiesは、以前に健康な腸17,18上で公開されているが、腸腫瘍の長期の直接観測が報告されていない。外科的処置は、以前に画像乳房腫瘍6,10に使用される生体スピニングディスク顕微鏡システムを使用して、腸の漿膜表面を介して腫瘍を可視化するために設計され、洗練されている。本論文では、プロトコルは、1 は 、APC 最小 / +マウスを使用することにより、小腸の腫瘍内の骨髄細胞の挙動に追従することを可能に記載されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of Material/ Equipment</a></td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:141px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ApcMin/+ mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td>2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ACTB-ECFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:141px;">3773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">cfms-EGFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratory</td>
			<td align="right">18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">D7139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:107px;">Butler Animal Health Supply</td>
			<td style="width:141px;">29450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oxygen</td>
			<td style="width:107px;">UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1X PBS</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Saline Buffer</td>
			<td style="width:107px;">UCSF cell culture facility</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td>
			<td style="width:107px;">UCSF Monoclonal antibody core</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Atropine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Use at 1mg/Kg mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol wipes</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">28G1/2 insulin syringe</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:141px;">329465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Remium cover glass</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-548-5M</td>
			<td>24x50-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Superfrost plus microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">12-550-15</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Krazy glue</td>
			<td style="width:107px;">Office Max</td>
			<td align="right">7111555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Betadine</td>
			<td style="width:107px;">LARC UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heat blanket</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar Industries</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:107px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">18000-45</td>
			<td>Turn ON 30min before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cotton tipped apllicators 6-inch</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">72310-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anesthesia system</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:107px;">Carl Zeiss Inc</td>
			<td style="width:141px;">Zeiss Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">stage insert</td>
			<td style="width:107px;">Applied Sientific Instrumentation</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse Ox oximeter, software and sensors</td>
			<td style="width:107px;">Starr Life Sciences</td>
			<td style="width:141px;">MouseOx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nebulizer</td>
			<td style="width:107px;">Summit Anesthesia Support</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaris</td>
			<td style="width:107px;">Bitplane</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mManager</td>
			<td style="width:107px;">Vale lab, UCSF</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>Open-source software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ICCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:141px;">XR-Mega-10EX S-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spinning disk confocal sacan-head</td>
			<td style="width:107px;">Yokogawa Corporation</td>
			<td style="width:141px;">CSU-10b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

骨髄細胞は、腫瘍内の最も豊富な免疫細胞であり、腫瘍の進行を促進することが示されている。現代の生体内イメージング技術は、臓器内部の生きた細胞挙動の観察を可能にするが、そのような腸などの臓器や腫瘍のアクセシビリティのためにいくつかのタイプの癌に挑戦することができます。腸腫瘍の直接観察は、以前に報告されていない。ここで説明する外科的処置は、トランスジェニック蛍光レポーターマウスおよび注射トレーサーまたは抗体を使用して生きたマウスにおける腸腫瘍内の骨髄細胞動態の直接観察を可能にする。この目的のために、迅速な画像取得との長期の連続撮影を可能にする四色、マルチリージョン、マイクロレンズ化スピニングディスク共焦点顕微鏡が用いられている。交差して小腸内の複数の腺腫を発症Apcの 最小 / +マウス骨髄細胞を可視化するには、c-FMS-EGFPマウスを用いたとACTB-ECFPマウスを用いた陰窩の腸上皮細胞を可視化した。そのような血管および好中球、および漿膜面を画像化するために、腫瘍を位置決めするための手順と異なる腫瘍の成分を標識するための手順も記載されている。イメージングの数時間からコンパイルタイムラプスムービーは、腸の微小環境におけるその場での骨髄細胞の挙動の分析を可能にする。

ACTB-ECFP;のc-fmsの-ECFPマウスは、漿膜面から可視化することができるスピニングディスク共焦点顕微鏡、Apcの最小/ +の小腸における非腫瘍及び腫瘍組織を使用することによって。イメージングの後、カメラのソフトウェアは、分析し、獲得（ 補足図1）を調整するために使用される。蛍光2000 kDaのデキストラン-ローダミンの静脈内（iv）注射とのLy-6G 647?...

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Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング<em&gt;のApc<sup&gt;最小/ +</sup</em&gt;腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K ビュー.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

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Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

免疫・感染学

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.