パート1。外科領域を準備します。 <ol><li>バイオハザード試薬（例えば、レトロウイルスベクター）を扱う場合、手術はバイオセーフティIIキャビネット（BSC）の内部で実行する必要があります。超音波後方散乱顕微鏡（UBM）は、BSC内部のトランスデューサで、BSCの隣に座って、そして特別に設計された外科的ステージ上でのモータ制御のサポートにより、所定の位置に保持する必要があります。ビデオに示されているステージを構築するために必要なコンポーネントは、行に記載されています。このリストは、一緒にいくつかの角度からステージの画像（リクエスト制）で、建設を許可する必要があります。 </li><li>開腹の開閉（腹腔の内臓へのアクセスを許可するために、オープンカットされている外科手術）は、通常、プラスチック製のバッキングと吸収パッド上で実行されます。手術前に必要なツール（autoclipアプライヤをロードした例剃刀、外科用ハサミ、鉗子、、など）、および材料のすべて（例えばPBS、縫合糸、麻酔、マウスホルダーとを覆うプレート、など）滅菌とに配置されるべきである外科領域。切開が開いている時間の量を制限することで、手術の成功のチャンスを最大化するために重要です。すべての動物の処理は、MB - 10のソリューション、またはそれに相当するとされ、駆除された手袋で実行する必要があります。手袋は滅菌であることを保証するために、必要に応じて繰り返し消毒を実施すべきである。 </li></ol>パート2。マウスの麻酔<ol><li> 1部ネンブタール（50 mg / mlのペントバルビタール）PBSで25 mg / mlの硫酸マグネシウムを滅菌フィルター処理の4つの部分にを含む麻酔液で1 ccシリンジを埋める。これは、10 mg / mlのペントバルビタールおよび20 mg / mlの硫酸マグネシウムであるソリューションになります。各マウスは個別に重み付けし、体重のペントバルビタールkg当り90mgの（例えば28グラムのマウスが250μLを注入される）を注入する必要があります。 </li><li>皮膚や腹部の筋肉の両方を貫通して（必要に応じて他の年齢層を使用することができます）胎生（E）9.5で、妊娠マウスの腹部（腹腔内、IP）に注入する。マウスの8月12日分が応答しなくなることができます。適切な麻酔は、リラックスした動物の姿勢、および尾とつま先ピンチに応答する運動の欠如によって確認されるべきである。そっと指の爪の間に挟みは、非常に敏感であり、そしてそのようなピンチへの応答の欠如は、動物が十分に麻酔であることを示します。尾とつま先ピンチに完全に応答しなくなる動物は、いくつかの回が最初の外科的切開に反応してわずかにけいれん場合でも注意してください。しかし、これは反射的反応であり、不十分な麻酔を示すものではありません。石油ベースの眼科バームは、手術中に乾燥を避けるために、マウスの眼に適用する必要があります。 </li><li>マウスの麻酔になることを待っている間に外科領域と超音波の機械を設定する。レトロウイルスやレンチウイルスの使用が必要なため、ウイルスの注射上述したようBSL2封じ込めは、バイオセーフティIIの内閣で実行する必要があります。さらに、ウイルスと接触するすべてのソリューションと使い捨ての材料を10％漂白剤溶液で除染する必要があります。手術器具と超音波機器は、MB - 10（のような消毒液で治療されるべきである<a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ）、または、当該施設で使用される同等の。 </li></ol>第3部。胚の曝露<ol><li>可能な場合（特定の動物施設と利用可能なスペースの制約に応じて）それは外科の領域とは別の場所に手術の準備の面積を有することが好ましい。これは動物の間のクロスコンタミネーションの可能性を最小限に抑えることができます。手術を開始するには、無菌の吸収面に背の上に動物を配置し、70％エタノールで十分に腹部を洗う。より広範な術前の治療は（Betadineの例、連続するラウンドと70％エタノールで洗浄）を採用し、しかし、我々の経験でこれはげっ歯類の生存の手術のこのタイプの必要はありませんすることができます。ダブルエッジのカミソリを使用して、約1インチ幅と1.5インチ長の領域では腹部から毛を剃る。約45 °の角度でカミソリで短く迅速な動きを使用してください。それは外科領域が適切に扱われることが重要であるが、過剰な濡れを受けていない、これは動物の不必要な身も凍るにつながることができるように、そして可能性も低体温。 </li><li>細かい外科はさみを使用すると、動物（第二切開を助けるの結合組織を切断筋肉に皮膚を保持している）の腹部の筋肉を通して、最初の皮膚を通して1&quot;縦切開を行い、注をそのプロシージャのケアを通じてすべき手術器具の滅菌のまま、およびツールヒントが非ステレオに触れた場合は、必要に応じて消毒剤による治療が行われるべき（すなわちように注意する）材料を波立たせる。 </li><li>鉗子を使用すると、慎重に子宮角を引き出す、とそれぞれの側の胚の数を記録。 （選択する2つのそれぞれの側の構成に依存するが）公開される2つの隣接した胚を残したまま、戻って動物に子宮角の大部分を置きます。母親が彼女の背中にしたまま、この文脈では、2つの胚が所定の時間にさらされるとPBSに浸し。 </li><li>それは手術中になる、そのバックプレキシガラスのホルダーに（図1a）に動物を配置*次に、緑のシラスティック膜（L RTVシリコーンゴムベースを使用して作られた、とを通じてわずかに置かれたピンセットで、ダウン母親以上（使用前にMB - 10で消毒する必要がある）10cmの組織培養皿**を下げる硬化剤、ダウコーニングの製品番号をそれぞれ3142761と2156946）。あなたが動物を介してプレートを下に下げるように、注入されるには2つの胚の間に子宮組織を把持する鉗子を使用して、そして穏やかに膜を介してそれらを引き出します。それと同時に、プレートをホルダーの上に完全にダウンして低下する、と画鋲が所定の位置に保持するためにプッシュされます。予め温めておいた（37℃）PBSは、完全に胚をカバーするために皿に追加されます。 </li><li>動物を含有する注射剤の段階を置き、子宮の壁（Figure1B）を通じて公開さ胚のリアルタイムイメージングを作成するために超音波プローブ（図1a）の下で胚を露出。プローブを直接に撮像される胚にわたってPBS浴中に（モーターコントロールを使用して）低下する。プローブは約2〜3 mm離れた胚からの場合に画像を得ることができます。それは画像を収集するために前後に振動するようにプローブヘッドは、胚をヒットしていないことを確認することが非常に重要です。 </li></ol>母親が手術中にかかっ*ホルダーは簡単に機械工場で行うことができます。それは上に接着されたtwoプレキシガラスの側面を持つ幅広いプレキシガラスのベース、そしてそれらの間の空間を（十分な幅がマウスの背中に横たわっている間に収まるように）を含んでいる必要があります。双方は、黒のワックス（解剖トレイからなど）で満たされ、それらの谷のゴロでのアウトを、持つ必要があります。そのワックスは、画鋲が胚を注入中に浴びていることをPBSのプレートを保持するために押さ先となる物質としての役割を果たします。 ：** 10センチメートル細菌の料理は、底部の中心からパンチ穴（直径約2センチメートル）（これはヘビーデューティポータブルパンチと16分の13 番インチの円形ダイを使ってできることが必要です<a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ）。さらに、中央の穴のいずれかの側（離れて約1.5cm）の2つの小さい穴は、火炎加熱針（またはそれらが当然のドリルを作ることができる）に焼き付いていることがあります。次に、これらのセキュリティホールは、真空グリースで覆われており、ホルダーの上にプレートを保持する画鋲は、黒のワックスに強行場所になります。真空グリースは漏れからPBSを防ぐためです。 パート4。マイクロインジェクションニードルにウイルスをロードする<ol><li> 1mmを（内径）ベベルのファッションマイクロインジェクションの針は、ガラスキャピラリーを引っ張った。針の鋭さが重要であり、十分に鋭い針での作業は、真剣に子宮壁と羊膜嚢の浸透が損なわれる可能性があります、そして実験的な故障につながることができます。シャープ針は、マニュアル注入/撤退ポンプにマウントされている（他のデバイスが針のローディングと放電を調節するために使用することができますが、これは何であるかを25μLをマイクロにチューブを介して接続されたピペットホルダー、に配置され、 ）ビデオに示す。最適な応答性（空気満たされたシステムに関連付けられている拡張と圧縮を避けるため）の場合は、マイクロシリンジ、チューブ、針は鉱物油で埋めなくてはなりません。 </li><li>前に針を読み込むためには、注射器からシステム内に気泡が針の先端までのすべての方法がないことを確認します。その後、ウイル​​スをロードするために開始する前に針に小さな気泡（長さ1〜2 mm）を引く。このエアポケットは、ウイルスや鉱物油との間の分離を維持するのに役立ちます。注入されるウイルス株は0.08 mg / mlの最終濃度（ウイルス産生の詳細については文献1、2を参照してください）​​にポリブレンが含まれている必要があります。力価の10倍ドロップする - 集中レトロウイルス株は、一般的に感染性物質の大部分が含まれている粒子状物質、かなりの量が含まれている、など5せずに除外することはできないことに注意してください。また、準備に応じて、ウイルスストックは、溶解したパッケージング細胞のゲノムDNA（特に真MLV / VSV偽型ウイルスを生成するために293細胞を使用している場合）から粘性のある可能性があります。ウイルス液の一部は、DNアーゼ少量の粘性が高い場合は、私はとすべき株式を緩めるに追加することができます、またはニードルをロードすることは極めて困難になります。 A<html>ウイルスストック（8-10μL）の液滴が針のロードの準備のためにパラフィルムの滅菌部分に配置する必要があります。その後、撤退のポンプを使用して、慎重に目詰まりを避けるために針払う注意を読み込みます。胚の針、または超音波プローブを壊さないように注意しながら、注入領域のマイクロマニピュレータの位置にロードされた針を置きます。インジェクションが発生することになる前に何らかの理由で針が大幅にロードされている場合、それは注射を開始する前に排出することができる先端、中に少量の空気を描くのに役立つ可能性があることに注意してください。このエアポケットは、針の先端（ほとんどの場合そのロードされた針が使い物になるの発生）での乾燥のウイルス株に対して保護することができます。 </li></ol>第5部。超音波ガイドウイルス注入<ol><li>超音波プローブによって作成されたリアルタイム画像は、ビデオモニタ上で可視化、および胚にマイクロインジェクションの針を導くために使用することができます。このシステムのウイルスを使用することE8.5またはいずれかの羊膜嚢またはE9.5 - E11.5（Figure1B）から脳室系で羊膜嚢に注入することができます。これは、プロシージャの中で最も難しい部分であり、マスター（捜査官に応じて50〜20時間程度）の経験上の手のかなりの量を必要とします。針の先端が画面上で最も明るいスポットとして超音波画像で明らかである、とyとz平面に電動のコントロールを使用してプローブの位置の調整（準拠で動い見られるべきである、とxの手動制御平面）。それは、プローブの振動方向は、針の長さに平行になることが非常に重要です。これは、針の先端が胚への注入のためにそれを配置するために運動中に、画像面に残っていることが保証されます。 </li><li>胚は、ターゲット領域が（この場合は前脳脳室で）容易に表示されていると注入経路における子宮材料の少ない針にアクセス可能になるように配置する必要があります。さらに、それは胎盤を介して注入することではないが重要です。ターゲットの脳領域は針の進歩の方向（マイクロマニピュレータのノブを使用して）と並んでされると、針はちょうど子宮壁に触れるはずですし、短い速いジャブは前方に組織に浸透してください。同様のアプローチは、羊膜嚢し、脳に浸透するために使用されます。針が鋭くなっている場合は特にいくつかのケースでは、と経験豊かな研究者は、一つの動きで心室を打つことができます。プローブ、針、そして胚を（ステージ上で母を移動して）移動の力学は、実際にハンズオンマスターする必要があります。 </li><li>胚の希望数が注入されると、5.0絹縫合糸で腹壁を閉じてください。縫合の力学は、手術のこのタイプに固有のものではありません。最後に、腹部の筋肉に針を介して一緒に主食肌に獣医オートクリップを使用してください。マウスがステッチをかむするので皮膚を縫合することは推奨されません。鎮痛は、それが目覚めて、マウスが経験する苦痛の量を減らすために切開の領域に適用する必要があります。それは皮下ごとに数ミリの切開部位に沿って（0.8 ml / kgを、または2 mg / kg体重）0.25％ブピバカイン液を注入することをお勧めします。 </li><li>マウスが回復しながらゆっくりとゲルのパックを（餌と水和を促進するために）含まれている清潔なケージで吸収紙で動物を置く。体温を維持するために37スライドウォーマーセット° Cの上にケージを置きます。起こされたら、清潔なケージにマウスとジェルパックを配置し、動物のラックに戻ります。 </li><li>次の日は、中絶を示すすべてがあらゆる膣からの出血、腹部収縮、および/または全体的に困っているように見える、のためにマウスを確認してください。このような場合は、すぐにマウスを安楽死させる。よく整備された髪と全体的な健康な外観は、手術からの正常な回復を示している。注入された胚は、さらなる分析のためembryonicallyまたは出生後に犠牲にすることができます。ウイルスがヒトアルカリホスファターゼ（PLAP）またはGFPなどのレポーター遺伝子を発現する場合、染色は、正のウイルス感染（Figure1C）の領域を明らかにする。 </li></ol>代表的な結果注入された胚は、成人するまで1〜2日後の注入を完全に犠牲にすることができます。ウイルスがそのようなPLAPやGFPなどのレポーター遺伝子を発現する場合には、レポーターの発現は、これらの細胞のウイルス感染した細胞やクローンを識別するのに役立ちます。例えば、レトロウイルスベクターを発現PLAPとE9.5で子宮内で感染していた生後の脳の組織切片である図1Cに示す。感染細胞は、組織化学的染色後の紫のクラスターとして視覚化されます。ウイルスに感染した細胞を識別することに加え、レポーターの発現は1つが、細胞の形態や位置だけでなく、遺伝子発現の状態を調べることができます。 NT&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。E9.5マウス前脳の脳室へのウイルスの注射。 A.麻酔動物は、注入のステージに配置されます。二つの胚（矢印）示されている超音波プローブの下にさらされて位置決めされる。ウイルスで満たされたマイクロインジェクションの針は、胚の近くに位置し、超音波プローブをラインアップしています。 E9.5のマウス胚からのリアルタイム超音波画像のB.のスクリーンキャプチャー。 V、心室、AS、羊膜嚢、UW、子宮壁。 C.胚はE10.5でPLAP発現ウイルスを注入した。 PLAPのための組織化学的染色では、ウイルス感染のイベントの場所を明らかにする。

<ol>
	<li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range.">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li><li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

超音波ガイドを使用してウイルスの注射は、羊膜嚢と脳室系の両方がE9.5 - E11.5から注入することができますが唯一の羊膜嚢は、E8.5で注入することができますE8.5 - E11.5、から行うことができる。正しく実行するときに、超音波ガイドを使って脳室系に注入されたウイルス粒子は、従って、前脳（大脳新皮質、大脳基底核、間脳、目、など）、中脳の様々な構造に感染する可能性が、脳室系を覆う細胞へのアクセス権を持っていると、と後脳（Figure1C）。羊膜嚢に注入されたウイルスは、胚​​の外側のセルへのアクセス権を持っています。ウイルスに加えて、超音波ガイダンスはまた、発展途上胚に細胞を注入することができます。したがって、この手法は、実験を設計するときに（発育期間、構造、ウイルス/細胞）から選択する複数のオプションが用意されています。 それは、注入されたウイルスまたは細胞が感染/注入された細胞の容易に識別するためのレポーターを発現することが重要です。歴史的に、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（PLAP）またはGFPが使用されている。経験から、我々は両方PLAP組織化学的および免疫組織化学的染色は、一細胞の形態や位置を分析し、そしてクローン分析ができるようにするために、その染色シャープと明確な単一のセルをもたらすので、PLAPは非常に有用なレポーター遺伝子であることができる発見した。ウイルスのGFPの発現がかすかにすることができるので、GFPレポーターは、組織を染色するための理想的ではないかもしれませんが、いずれかの蛍光活性化細胞選別（FACS）によって、単一のセルを取得したい場合に便利です。

&quot;次の超音波後方散乱顕微鏡の一つは、この手順のために使用することができます。ビデオでパラダイム医療からP40が使用されていますが、P40は、もはや市販されていない、と同様に価格とできることですP60、に置換されている同じアプリケーションで使用される。期工事で説明した追加の材料は、パラダイム - メディカルデバイス（複数可）で使用するためです。VEVO 2100は、小動物イメージングのための装置が付属しています。 <ol><li>パラダイム-医療からP60超音波生体顕微鏡 （UBM） （ <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ）。 </li><li> VisualSonicsからVEVO 2100（ <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ） </li></ol>麻酔と鎮痛ネンブタール溶液（ペントバルビタール50 mg / mLの注射ナトリウム、アボットラボラトリーズ社製）バルターシャインアニマルヘルスから得ることができる。これはスケジュールII規制薬物であると麻薬取締局（DEA）を取得するためにライセンスが必要であることに注意してください。 ブピバカイン液（0.25％、その他の間でホスピーラ、株式会社、製）ムーア医療を含む代理店の数、から得ることができる。

ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at e9.5

マウスの子宮内生存の手術では 、開発中の遺伝子発現の分子操作を可能にします。子宮壁は、初期胚発生の間に不透明であるため、しかし、、マイクロインジェクションのための胚の特定の部分を対象にする機能が大幅に制限されています。幸いにも、高周波数の超音波イメージングでは、関心の胚領域にマイクロインジェクションの針を導くために、リアルタイムで使用できる画像の生成を可能にする。ここでは、胎生（E）9.5でマウスの前脳の脳室系にレトロウイルスベクターの注入を導くためにそのような画像の使用について説明します。このメソッドは、子宮角、そしてそれらを撮影し、注入される間に生理食塩水を浴びれる宿主胚を許可する特別に設計されたプレートへのアクセスを許可するように開腹術を使用しています。成功する手術は、しばしば最もまたは関心の後続の時点（embryonicallyまたは出生後）に生存注入胚のすべてになります。ここで説明する原理は、E8.5胚（それによってはまだ閉じていない神経管の前部後部の範囲に沿って感染を認める）の羊水に、またはの脳室系に注入を行うためにわずかな変更で使用することができますE10.5/11.5で脳。さらに、中期神経年齢層（〜E13.5）で、超音波撮像は、ウイルス感染や細胞移植のための特定の脳領域に直接注入を使用することができます。マウスでは子宮内注射に導くための超音波イメージングの使用は不可能ではない場合そうでない場合は非常に困難な方法で、マウスの胚の分子や細胞の操作を可能にする非常に強力な手法です。

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

マウスの子宮内生存の手術では 、開発中の遺伝子発現の分子操作を可能にします。ここでは、胎生（E）9.5でのマウスの脳にレトロウイルスベクターの注入を導くために高周波数超音波イメージングの使用を説明しています。

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

18.0K ビュー.  Johns Hopkins University School of Medicine. マウスの子宮内生存の手術では 、開発中の遺伝子発現の分子操作を可能にします。ここでは、胎生（E）9.5でのマウスの脳にレトロウイルスベクターの注入を導くために高周波数超音波イメージングの使用を説明しています。

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

神経科学

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

海馬のインスリンおよびマイクロインジェクション<emインビボ&gt;</em空間記憶テスト中&gt;マイクロダイアリシス

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

要約

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