Parte 1. Prepare a área cirúrgica <ol><li> Se trabalhar com reagentes de risco biológico (por exemplo, vetores retrovirais), a cirurgia deve ser realizada dentro de um armário de Biossegurança II (BSC). O microscópio backscatter ultra-som (UBM) deve sentar-se junto ao BSC, com o transdutor dentro do BSC, e mantida no lugar por um suporte de motor controlado em um palco especialmente projetado cirúrgico. Os componentes necessários para construir o estágio mostrado no vídeo estão listados na linha. Esta lista, juntamente com imagens do palco de vários ângulos (disponível a pedido), deve permitir a construção. </li><li> A abertura e fechamento da laparotomia (procedimento cirúrgico no qual a cavidade abdominal é cortado para permitir o acesso aos órgãos internos) é geralmente realizada em um pano absorvente com suporte plástico. Antes da cirurgia todas as ferramentas necessárias (por exemplo, de barbear, tesouras cirúrgicas, fórceps, carregado autoclip aplicador, etc) e materiais (por exemplo, PBS, suturas, anestésicos, o titular do mouse e placa sobrejacente, etc) devem ser esterilizados e colocados no área cirúrgica. Limitando a quantidade de tempo que a incisão é aberto é importante para maximizar as chances de sucesso com a cirurgia. Toda a manipulação de animais deve ser realizada com luvas que foram desinfectados com solução de MB-10, ou o equivalente. Desinfecção repetida deve ser realizado conforme necessário para garantir que as luvas são estéreis. </li></ol> Parte 2. Anestesia do mouse <ol><li> Encher uma seringa cc 1 com a solução anestésica contendo 1 parte Nembutal (50 mg / ml pentobarbital) a 4 partes filtrado esterilizado 25 mg / ml de sulfato de magnésio em PBS. Isso resultará em uma solução que é de 10 mg / ml pentobarbital e 20 mg / ml de sulfato de magnésio. Cada rato deve ser ponderada individualmente, e injetado com 90 mg de pentobarbital kg de peso corporal por (por exemplo, um rato 28 gm seria injetado com 250 mL). </li><li> Injetar no abdômen (IP, intraperitoneal) de um rato grávidas no dia embrionário (E) 9,5 (pode usar outras idades conforme necessário) penetrando a pele e músculo abdominal. Aguarde 8-12 minutos para que o mouse para se tornar não-responsivos. Anestesia adequada deve ser confirmada pela postura relaxada do animal, e falta de movimento em resposta a cauda e pitadas dedo do pé. Suavemente beliscar entre as unhas é altamente sensível, ea falta de qualquer resposta a tais beliscar indica que os animais é suficientemente anestesiados. Nota mesmo os animais que são completamente insensível à pitadas cauda e pés podem algumas vezes se contorcer um pouco, em resposta à incisão cirúrgica inicial. No entanto, esta é uma resposta reflexa e não indica a anestesia inadequada. À base de petróleo bálsamo oftálmica devem ser aplicados para os olhos do mouse para evitar a secagem durante a cirurgia. </li><li> Set-up da área cirúrgica e da máquina de ultra-som enquanto se espera para o mouse para se tornar anestesiados. Como o uso de retrovírus ou lentivírus requer BSL2 de contenção, como dito acima as injeções viral deve ser realizada em um gabinete II Biossegurança. Além disso, todas as soluções e materiais descartáveis ​​que entra em contato com o vírus devem ser descontaminados com uma solução de lixívia a 10%. Os instrumentos cirúrgicos e equipamentos de ultra-som deve ser tratada com uma solução de esterilização, tais como MB-10 ( <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ), ou equivalente utilizado pelo estabelecimento em causa. </li></ol> Parte 3. Exposição dos embriões <ol><li> Se possível (dependendo das restrições da instalação determinado animal e do espaço disponível) é preferível ter a área de preparação cirúrgica em um local separado da área cirúrgica. Isso irá minimizar as chances de contaminação cruzada entre animais. Para iniciar a cirurgia, colocar o animal em sua parte traseira em uma superfície estéril absorvente e lavar a área abdominal completamente com álcool 70%. Tratamentos pré-cirúrgico mais extenso pode ser empregada (por exemplo, sucessivas rodadas de Betadine e lavagens de etanol 70%), mas em nossa experiência isso não é necessário para este tipo de cirurgia a sobrevivência de roedores. Usando uma navalha ponta dupla, raspar o cabelo do abdômen, em uma área de aproximadamente 1 polegada de largura e 1,5 centímetros de comprimento. Use curto movimentos rápidos com a navalha em aproximadamente um ângulo de 45. É importante que a área cirúrgica ser adequadamente tratados, mas não sujeito a molhar em excesso, pois isso pode resultar em refrigeração desnecessário do animal, e, possivelmente, até mesmo a hipotermia. </li><li> Usando muito bem fazer uma tesoura cirúrgica uma incisão &quot;longitudinal através da pele primeiro, e depois através do músculo abdominal do animal (cortando tecido conjuntivo segurando a pele ao músculo vai ajudar com a segunda incisão). Note-se que todo o cuidado procedimento deve ser tomadas para garantir que os instrumentos cirúrgicos permanecem estéreis, eo tratamento com desinfetantes devem ser realizados conforme a necessidade (ou seja, se as dicas de ferramentas entrar em contato com os não-sterile material). </li><li> Forceps usando cuidadosamente tirar cornos uterinos, e registrar o número de embriões em cada lado. Deixando dois embriões expostos adjacentes (seleção dos quais dois dependerá da configuração de cada lado), coloque a maior parte dos cornos uterinos de volta para o animal. Neste contexto, dois embriões serão expostos em um determinado momento e banhado em PBS, enquanto a mãe permanece em suas costas. </li><li> Coloque o animal à sua volta no suporte de acrílico onde será durante a cirurgia (Figura 1A) *. Em seguida, 10 centímetros menor do prato de cultura de tecido ** (que deve ser desinfetado com MB-10 antes de usar) para baixo sobre a mãe, com um par de fórceps colocado um pouco através da membrana verde silastic (feitas usando L RTV silicone base de borracha, e agente de cura; números Dow-Corning produto 3142761 e 2156946, respectivamente). Como você abaixar a placa para baixo sobre o animal, use a pinça para segurar o tecido uterino entre os dois embriões a ser injetado, e puxe-los através da membrana. Ao mesmo tempo, a placa é abaixada até o fim para o titular, e os percevejos são empurrados para segurá-la no lugar. Pré-aquecido (a 37 ° C) PBS é então adicionado ao prato para cobrir completamente os embriões. </li><li> Lugar a fase de injeção contendo o animal e embriões expostos sob a sonda de ultra-som (Figura 1A) para criar imagens em tempo real dos embriões expostos através da parede uterina (Figura 1B). A sonda é então abaixada (usando os controles do motor) para o banho de PBS diretamente sobre os embriões a ser trabalhada. Imagens podem ser obtidas quando a sonda é de aproximadamente 2-3 mm de distância da embriões. É muito importante certificar-se que a sonda não atingiu os embriões, uma vez que oscila para trás e para recolher imagens. </li></ol> * O titular da mãe descansa em durante a cirurgia pode ser facilmente feita por uma oficina mecânica. Ela deve incluir uma base de plexiglass de largura, com dois lados plexiglass colado no topo, e um espaço entre eles (largura suficiente para o mouse para ajustar enquanto deitado de costas). As laterais devem ter um terreno vale fora delas, que é então preenchido com cera negra (por exemplo, a partir de uma bandeja de dissecação). Cera que serve como o material em que thumbtacks será pressionado para segurar o prato de PBS que os embriões são banhadas em durante a injeção. Pratos ** 10 centímetros bacteriana deve ter um buraco (cerca de 2cm de diâmetro) socou para fora do centro da parte inferior (isto pode ser feito com um Heavy Duty perfurador portátil e um dia morrer 13/16 pol circular: <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). Além disso, dois pequenos furos de cada lado do orifício central (cerca de 1,5 cm de distância) deve ser queimado com uma agulha chama-aquecido (ou poderiam ser feitos com uma broca, é claro). Estes buracos são então cobertas com graxa de vácuo e será onde os percevejos que prendem a placa no suporte em empurrar com a cera negra. A graxa de vácuo é evitar que o PBS vaze. Parte 4. Carregando Virus em um Needle microinjeção <ol><li> Forma de uma agulha microinjeção por chanfradura uma 1mm (diâmetro interno) puxou capilar de vidro. A nitidez da agulha é fundamental, e trabalhar com uma agulha afiada insuficiente pode comprometer seriamente a penetração da parede uterina e do saco amniótico, e pode levar ao fracasso experimental. A agulha afiada é então colocado no porta-pipeta, que é ligado através de tubulação para uma micro 25 mL montado em uma bomba de infusão / retirada manual (outros dispositivos podem ser usados ​​para regular a carga e descarga da agulha, mas isso é o que é mostrado no vídeo). Para a capacidade de resposta ideal (para evitar a expansão e compressão associada a um sistema de ar cheia), a micro, tubos e agulhas devem ser preenchidos com óleo mineral. </li><li> Antes de carregar a agulha certifique-se que não há bolhas de ar no sistema da seringa todo o caminho até a ponta da agulha. Em seguida, chamar de volta uma pequena bolha de ar (1-2 mm de comprimento) para dentro da agulha antes de iniciar a carga viral. Esta bolsa de ar ajuda a manter a separação entre o vírus eo óleo mineral. O estoque viral a ser injetado deve conter polibrene na concentração final de 0,08 mg / ml (para mais informações sobre a produção de vírus, por favor consulte as referências 1, 2). Note-se que concentra ações retroviral geralmente contêm uma quantidade significativa de material particulado, que contém a maioria do material infeccioso, e por isso não podem ser filtrados sem a 5 - a queda de 10 vezes no título. Além disso, dependendo da preparação, o estoque viral pode ser viscoso a partir do DNA genômico de células lisadas embalagem (especialmente verdadeiro se utilizando 293 células para gerar MLV / VSV vírus pseudotyped). Se a alíquota de vírus é viscoso, uma pequena quantidade de DNAse I pode e deve ser adicionado ao soltar o estoque, ou carregar a agulha será extremamente difícil. A<html> gota do estoque viral (80-10 mL) deve ser colocado em um pedaço estéril de parafilme em preparação para o carregamento da agulha. Então, usando a bomba de retirada, cuidadosamente carregar a atenção agulha pagar para evitar obstruções. Coloque a agulha carregado na posição micromanipulador na área de injeção, com cuidado para não quebrar a agulha sobre os embriões, ou a sonda de ultra-som. Note que, se por algum motivo a agulha é carregado de forma significativa antes da injeção é a ocorrer, pode ser útil para desenhar uma pequena quantidade de ar na ponta, que pode ser descarregada antes de iniciar as injeções. Esta bolsa de ar pode proteger contra a ação viral de secagem na ponta da agulha (uma ocorrência que quase sempre tornam a agulha carregada inútil). </li></ol> Parte 5. Injeção de ultra-som guiada Viral <ol><li> A imagem em tempo real, criado pela sonda de ultra-som é visualizado no monitor de vídeo, e pode ser usado para guiar a agulha microinjeção no embrião. Usando este sistema de vírus pode ser injetada na bolsa amniótica em E8.5 ou seja o saco amniótico ou o sistema ventricular de E9.5-E11.5 (Figura 1B). Esta é a parte mais difícil do processo e exige uma quantidade significativa de experiência prática para dominar (da ordem de 50-20 horas, dependendo do investigador). A ponta da agulha é evidente na imagem de ultra-som como o ponto mais brilhante na tela, e devem ser vistos se movendo de acordo com os ajustes da posição da sonda (usando os controles do motor no y e z aviões eo controle manual no x plano). É extremamente importante que a direção de oscilação da sonda ser paralela ao comprimento da agulha. Isto irá assegurar que a ponta da agulha permanece no plano de imagem durante os movimentos para posicioná-la para injecção no embrião. </li><li> O embrião deve ser posicionada de tal forma que a região-alvo (neste caso o ventrículo cérebro) é facilmente visível e acessível à agulha com a menor quantidade de material uterino no caminho de injeção. Além disso, é fundamental não para injectar através da placenta. Uma vez que a região do cérebro-alvo é alinhada com a direção de avanço da agulha (usando o botão na micromanipulador), a agulha deve ser apenas tocando a parede uterina, e depois um soco curto rápida para a frente deve penetrar no tecido. Uma abordagem semelhante é usado para penetrar no saco amniótico e depois o cérebro. Em alguns casos, investigador experiente e pode bater o ventrículo em um movimento, especialmente se a agulha é muito afiada. A mecânica do movimento da sonda, a agulha, e os embriões (movendo a mãe no palco), exigem exercícios práticos para dominar. </li><li> Uma vez que o número desejado de embriões foi injetado, perto da parede abdominal com 5,0 suturas de seda. A mecânica de sutura não são específicos para este tipo de cirurgia. Finalmente, use autoclips veterinária para a pele o grampo juntos ao longo dos pontos no músculo abdominal. Sutura da pele não é recomendado porque o rato vai mastigar os pontos. Analgesia deve ser aplicado para a área de incisão para reduzir a quantidade de dor experimentada pelo mouse, uma vez que desperta. Recomenda-se que uma solução de bupivacaína a 0,25% ser injetado (0,8 ml / kg, ou 2 mg / kg) por via subcutânea a cada poucos milímetros ao longo do local da incisão. </li><li> Enquanto o mouse recupera o animal deite cuidadosamente em papel absorvente em uma gaiola limpa contendo um pacote de gel (para facilitar a alimentação e hidratação). Coloque a gaiola em um conjunto de slides mais quente a 37 ° C para manter a temperatura corporal. Quando despertou, coloque o mouse eo pacote de gel em uma gaiola limpa e retornar ao rack animal. </li><li> No dia seguinte, verifique o mouse para qualquer sangramento vaginal, contrações abdominais, e / ou uma olhada geral em dificuldades, todos os quais indicam o aborto. Se este for o caso, euthanize o mouse imediatamente. Cabelos bem arrumados e uma aparência saudável indicam recuperação bem sucedida de uma cirurgia. Os embriões injetados pode ser sacrificado embrionariamente ou após o nascimento para análise posterior. Se o vírus expressa um gene repórter, como a fosfatase alcalina humano (PLAP), ou GFP, a coloração irá revelar as áreas de infecção viral positiva (Figure1C). </li></ol> Resultados representante Embriões injetado pode ser sacrificada 1-2 dias após a injecção todo o caminho até à idade adulta. Se o vírus expressa um gene repórter, como PLAP ou GFP, então repórter expressão serve para identificar células infectadas por vírus e clones dessas células. Por exemplo, mostrado na Figura 1C é uma secção de tecido do cérebro pós-natal que foi infectada no útero em E9.5 com um vetor retroviral PLAP expressar. Células infectadas são visualizados como clusters roxo após coloração histoquímica. Além de identificar células infectadas por vírus, expressão repórter permite analisar a morfologia das células e posição, bem como o status de expressão gênica. nt &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Viral injeção nos ventrículos do cérebro anterior E9.5 do mouse. A. O animal anestesiado é colocado no palco da injeção. Dois embriões seriam expostos e colocados sob a sonda de ultra-som no local indicado (seta). A agulha microinjeção cheio de vírus está localizado perto da embriões e alinhados com a sonda de ultra-som. Tela B. captura de uma imagem de ultra-som em tempo real a partir de um embrião de rato E9.5. V, ventrículo; AS, saco amniótico; UW, parede uterina. Os embriões foram injetados C. com um vírus expressando-PLAP em E10.5. Coloração histoquímica para PLAP revela a localização de eventos de infecção viral.

<ol>
	<li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range.">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li><li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Injeções viral usando a orientação de ultra-som pode ser realizado de E8.5-E11.5, onde apenas o saco amniótico pode ser injetado em E8.5, enquanto ambos o saco amniótico e do sistema ventricular pode ser injetado de E9.5-E11.5. Quando realizada corretamente, partículas virais injetada no sistema ventricular usando a orientação de ultra-som têm acesso a as células que revestem o sistema ventricular e, portanto, podem infectar as várias estruturas do (neocórtex, gânglio basal, diencéfalo, olhos, etc) prosencéfalo mesencéfalo, , e rombencéfalo (Figure1C). Vírus injetada no saco amniótico tem acesso às células no exterior do embrião. Além de vírus, a orientação de ultra-som também pode ser usada para injetar as células no embrião em desenvolvimento. Portanto, essa técnica proporciona várias opções para escolher (período de tempo de desenvolvimento, a estrutura do vírus, / células) ao projetar um experimento. É fundamental que o vírus injetado ou células expressam um repórter para uma fácil identificação de células infectadas / injetado. Historicamente, a fosfatase alcalina da placenta humana (PLAP), ou GFP têm sido utilizados. Da experiência, temos encontrado PLAP pode ser um gene repórter muito útil, pois ambos PLAP histoquímica e imunohistoquímica rende uma célula nítida e distinta única mancha que permite analisar a morfologia das células e posição, e realizar uma análise clonal. Já que a expressão GFP viral pode ser fraco, um repórter GFP pode não ser ideal para a coloração dos tecidos, mas é útil quando se quer obter uma única célula por fluorescência separação de células ativadas (FACS).

&quot;Um dos microscópios backscatter seguintes ultra-som pode ser usado para este procedimento. Embora no vídeo a P40 da Paradigm-Medical é usado, o P40 já não é disponível comercialmente, e tem sido substituído pelo P60, que é mesma faixa de preço e pode ser usado para a mesma aplicação. Os materiais adicionais descritos para a construção estágio são para uso com Paradigma Médico-dispositivo (s). O Vevo 2100 vem com equipamentos para geração de imagens de pequenos animais. <ol><li> P60 biomicroscópio ultra-som (UBM) de Paradigma Médico- ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> Vevo 2100 de VisualSonics ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> Anestésico e analgésico A solução Nembutal (50 mg de sódio / mL injetável pentobarbital; produzido pelo Laboratório Abbott) podem ser obtidos a partir Bulter Saúde Animal Schein. Note que esta é uma substância controlada II e requer uma Drug Enforcement Agency (DEA) para obter licença. A solução de bupivacaína (0,25%; produzido pela Hospira, Inc., entre outros) podem ser obtidos a partir de um número de distribuidores, incluindo Moore Médica.

ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at e9.5

Cirurgia no útero de sobrevivência em camundongos permite a manipulação molecular de expressão de genes durante o desenvolvimento. No entanto, porque a parede uterina é opaco durante a embriogênese inicial, a capacidade de direcionar partes específicas do embrião para a microinjeção é muito limitada. Felizmente, a alta freqüência ultra-sonografia permite a geração de imagens que podem ser utilizados em tempo real para guiar uma agulha na região microinjeção embrionária de interesse. Aqui nós descrevemos o uso de imagem, para guiar a injeção de vetores retrovirais no sistema ventricular do prosencéfalo mouse no dia embrionário (E) 9.5. Este método usa uma laparotomia para permitir o acesso aos cornos uterinos, e um prato especialmente concebido que permite que embriões de acolhimento para ser banhado em solução salina, enquanto eles são gravadas e injectada. Cirurgias bem sucedidas muitas vezes resultam na maioria ou todos os embriões injetados sobreviver a qualquer ponto do tempo subsequente de juros (embrionariamente ou após o nascimento). Os princípios descritos aqui podem ser usados ​​com pequenas modificações para realizar injeções no líquido amniótico de E8.5 embriões (permitindo assim a infecção ao longo da extensão ântero-posterior do tubo neural, que ainda não tenha fechado), ou no sistema ventricular do cérebro em E10.5/11.5. Além disso, em meados do neurogênica idades (~ E13.5), ultra-sonografia pode ser utilizada injeção direta em regiões específicas do cérebro para a infecção viral ou transplante de células. O uso de ultra-sonografia para guiar em injecções intra-útero em camundongos é uma técnica muito poderosa que permite a manipulação molecular e celular de embriões de ratos de uma forma que de outra forma seria extremamente difícil, senão impossível.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Cirurgia no útero de sobrevivência em camundongos permite a manipulação molecular de expressão de genes durante o desenvolvimento. Aqui nós descrevemos o uso de alta freqüência ultra-sonografia para guiar a injeção de vetores retrovirais para o cérebro do rato no dia embrionário (E) 9.5.

Ultra-som guiada microinjeção em parte frontal do cérebro do rato In Utero Em E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

17.8K visualizações.  Johns Hopkins University School of Medicine. Cirurgia no útero de sobrevivência em camundongos permite a manipulação molecular de expressão de genes durante o desenvolvimento. Aqui nós descrevemos o uso de alta freqüência ultra-sonografia para guiar a injeção de vetores retrovirais para o cérebro do rato no dia embrionário (E) 9.5.