Parte 1. Preparare l&#39;area chirurgica <ol><li> Se si lavora con reagenti rischio biologico (ad esempio vettori retrovirali), l&#39;intervento deve essere eseguito all&#39;interno di un armadio II Biosicurezza (BSC). Il microscopio backscatter ultrasuoni (UBM) dovrebbe sedersi accanto al BSC, con il trasduttore all&#39;interno della BSC, e tenuto in posizione da un supporto motore controllato su un palco appositamente progettato chirurgica. I componenti necessari per costruire lo stadio mostrato nel video sono elencati in linea. Questo elenco, insieme ad immagini della scena da diverse angolazioni (disponibile a richiesta), dovrebbe consentire la costruzione. </li><li> L&#39;apertura e chiusura della laparotomia (procedura chirurgica in cui viene tagliata la cavità addominale aperta per consentire l&#39;accesso agli organi interni) è di solito eseguita su un tampone assorbente con supporto di plastica. Prima dell&#39;intervento tutti gli strumenti necessari (es. rasoio, forbici chirurgiche, pinze, caricato autoclip applicatore, ecc) e materiali (ad esempio PBS, suture, anestetico, il supporto per mouse e la piastra sovrastante, ecc) devono essere sterilizzati e collocato nel Area chirurgica. Limitando la quantità di tempo l&#39;incisione è aperto è importante per ottimizzare le possibilità di successo con la chirurgia. Tutti trattamento degli animali deve essere effettuata con guanti che sono stati disinfettati con MB-10 soluzione, o equivalente. Disinfezione ripetuta deve essere eseguita secondo necessità per assicurare che i guanti sono sterili. </li></ol> Parte 2. Anestesia del mouse <ol><li> Riempire una siringa da 1 cc, con la soluzione anestetica contenente 1 parte di Nembutal (50 mg / ml pentobarbital) a 4 parti filtrata sterile 25 mg / ml di solfato di magnesio in PBS. Questo si tradurrà in una soluzione che è di 10 mg / ml pentobarbital e 20 mg / ml di solfato di magnesio. Ogni mouse dovrebbe essere ponderata individualmente, e iniettati con 90 mg di pentobarbital per kg di peso corporeo (per esempio, di 28 topo gm sarebbe iniettato con 250 mL). </li><li> Iniettare nell&#39;addome (intraperitoneale, IP) di un topo in stato di gravidanza al giorno embrionale (E) 9.5 (possono usare altre età, se necessario) penetrante sia la pelle ei muscoli addominali. Lasciare 8-12 minuti per il mouse per non rispondere. Anestesia adeguata dovrebbe essere confermato dalla postura rilassata dell&#39;animale, e la mancanza di movimento in risposta a coda e pizzichi piedi. Pizzicando delicatamente tra le unghie è molto sensibile, e la mancanza di qualsiasi risposta a pizzicare tale indica che l&#39;animale sia sufficientemente anestetizzati. Si noti anche gli animali che sono completamente insensibili a pizzichi coda e punta può alcune volte contrazione leggermente in risposta alla prima incisione chirurgica. Tuttavia, questa è una risposta riflessiva e non indica l&#39;anestesia inadeguata. A base di petrolio balsamo oftalmico deve essere applicato agli occhi del mouse per evitare l&#39;essiccamento durante l&#39;intervento. </li><li> Set-up l&#39;area chirurgica e la macchina ad ultrasuoni in attesa del mouse per diventare anestetizzati. Poiché l&#39;uso di retrovirus e lentivirus richiede BSL2 di contenimento, come detto in precedenza le iniezioni virale deve essere eseguita in un gabinetto biosicurezza II. Inoltre, tutte le soluzioni e materiali usa e getta che viene a contatto con il virus dovrebbe essere decontaminate con una soluzione di candeggina al 10%. Gli strumenti chirurgici e apparecchiature ad ultrasuoni devono essere trattati con una soluzione sterilizzante come MB-10 ( <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ) o un equivalente utilizzato dalla struttura in questione. </li></ol> Parte 3. Esposizione della embrioni <ol><li> Se possibile (a seconda dei vincoli della struttura determinato animale e lo spazio disponibile), si preferisce avere l&#39;area chirurgica preparazione in un luogo separato dalla zona chirurgica. Questo ridurrà al minimo le possibilità di contaminazione incrociata tra gli animali. Per avviare l&#39;intervento, posto l&#39;animale sul dorso su una superficie sterile assorbente e lavare la zona addominale accuratamente con etanolo al 70%. Trattamenti prechirurgica più ampia può essere impiegata (ad esempio, turni successivi di Betadine e lavaggi etanolo al 70%), ma nella nostra esperienza questo non è necessario per questo tipo di chirurgia roditori sopravvivenza. Utilizzando un rasoio a doppio taglio, radere i capelli con l&#39;addome in una zona di circa 1 cm di larghezza e 1,5 centimetri di lunghezza. Utilizzare brevi movimenti rapidi con il rasoio a circa un angolo di 45 °. E &#39;importante che l&#39;area chirurgica essere opportunamente trattata, ma non sottoposto a bagnatura eccessiva, in quanto ciò può causare agghiacciante inutile degli animali, e forse anche l&#39;ipotermia. </li><li> Utilizzando bene forbici chirurgiche fare un 1 &quot;incisione longitudinale attraverso la pelle, e poi attraverso il muscolo addominale dell&#39;animale (taglio attraverso il tessuto connettivo tenendo la pelle al muscolo aiuterà con la seconda incisione). Noti che per tutta la cura procedura dovrebbe da adottare per assicurare che gli strumenti chirurgici rimangono sterili, e il trattamento con disinfettante deve essere eseguito secondo le necessità (cioè se le punte di entrare in contatto con i non-sterile materiale). </li><li> Forcipe utilizzando attentamente tirare fuori le corna uterine, e registrare il numero di embrioni da ogni lato. Pur lasciando due embrioni adiacenti esposti (selezione di cui due dipenderà dalla configurazione su ogni lato), posto la maggior parte delle corna uterine nuovamente dentro l&#39;animale. In questo contesto, due embrioni saranno esposti in un dato momento e bagnato in PBS, mentre la madre rimane sulla schiena. </li><li> Posto l&#39;animale sul dorso nel supporto in plexiglass dove sarà durante l&#39;intervento chirurgico (Figure1A) *. Successivamente, abbassare il tessuto piatto 10 centimetri cultura ** (che dovrebbe essere disinfettato con MB-10 prima dell&#39;uso) giù sopra la madre, con un paio di pinze posizionati leggermente attraverso la membrana verde silastic (realizzati con L silicone RTV base in gomma, e catalizzatore;-Dow Corning numeri di prodotto 3142761 e 2156946, rispettivamente). Mentre si abbassa il piatto sopra l&#39;animale, utilizzare la pinza per afferrare il tessuto uterino tra i due embrioni da iniettare, e delicatamente tirare attraverso la membrana. Allo stesso tempo, la lastra si abbassa completamente verso il basso sul supporto, e le puntine da disegno sono spinti per tenerlo in posizione. Pre-riscaldato (a 37 ° C) PBS viene quindi aggiunto il piatto per coprire completamente gli embrioni. </li><li> Posizionare la fase di iniezione contenente l&#39;animale e gli embrioni esposti sotto la sonda ecografica (Figure1A) per creare in tempo reale immagini degli embrioni esposti attraverso la parete uterina (Figure1B). La sonda viene quindi abbassato (utilizzando i comandi motorizzati) nel bagno di PBS direttamente sopra gli embrioni da acquisire. Le immagini possono essere ottenuti quando la sonda è di circa 2-3 mm di distanza dalla embrioni. E &#39;molto importante fare in modo che la sonda non colpisce gli embrioni in quanto oscilla avanti e indietro per raccogliere le immagini. </li></ol> * Il titolare della madre riposa in durante l&#39;intervento chirurgico può essere facilmente effettuata da un officina meccanica. Esso dovrebbe includere una larga base in plexiglass, con due lati plexiglass incollato sulla parte superiore, e uno spazio tra di loro (abbastanza largo per il mouse per adattarsi mentre giaceva sul dorso). Le parti dovrebbero avere un terreno valle fuori di essi, che viene poi riempito con cera nera (per esempio da un vassoio dissezione). Cera che serve come il materiale in cui puntine da disegno sarà premuto per tenere premuto il piatto di PBS che gli embrioni sono immersi in durante l&#39;iniezione. ** Piatti 10 centimetri batterica dovrebbe avere un foro (circa 2 centimetri di diametro) perforato dal centro del fondo (questo può essere fatto con un Heavy Duty portatile Punch e un 13/16 ° morire pollici circolare: <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). Inoltre, due piccoli fori su entrambi i lati del foro centrale (circa 1,5 centimetri di distanza) deve essere bruciato con una fiamma riscaldato ago (o potrebbero essere effettuato con un trapano, naturalmente). Questi fori vengono poi coperti di grasso per vuoto e sarà dove il puntine che tengono la piastra sul supporto nel far passare la cera nera. Il grasso è vuoto per evitare la fuoriuscita dalla PBS. Parte 4. Caricamento Virus in un ago Microiniezione <ol><li> Moda microiniezione di un ago smusso appena 1 mm (diametro interno) tirato capillare di vetro. La nitidezza dell&#39;ago è critica, e lavorando con un ago sufficientemente forte può seriamente compromettere la penetrazione della parete uterina e il sacco amniotico, e può portare al fallimento sperimentale. L&#39;ago affilato è poi inserito nel supporto pipetta, che è collegato tramite tubo a una microsiringa 25 microlitri montato in un manuale di infusione / ritiro della pompa (altri dispositivi possono essere usati per regolare il carico e lo scarico dell&#39;ago, ma questo è ciò che è mostrato nel video). Per la risposta ottimale (per evitare l&#39;espansione e la compressione associata ad un sistema ad aria piena), la microsiringa, tubi, e l&#39;ago dovrebbe essere riempita con olio minerale. </li><li> Prima di caricare l&#39;ago assicurarsi che non vi siano bolle d&#39;aria nel sistema dalla siringa fino alla punta dell&#39;ago. Poi ritiratevi una piccola bolla d&#39;aria (1-2 mm di lunghezza) nel l&#39;ago prima di iniziare a caricare virus. Questa sacca d&#39;aria aiuta a mantenere la separazione tra il virus e l&#39;olio minerale. Lo stock virale da iniettare deve contenere polibrene ad una concentrazione finale di 0,08 mg / ml (per ulteriori informazioni sulla produzione di virus si rimanda a riferimenti 1, 2). Si noti che concentra le scorte retrovirali generalmente contengono una significativa quantità di particolato, che contiene la maggior parte del materiale infetto, e quindi non possono essere filtrati senza un 5 - a goccia di 10 volte del titolo. Inoltre, a seconda della preparazione, lo stock virale può essere viscoso dal DNA genomico di cellule lisate imballaggio (particolarmente vero se si usa 293 cellule per generare MLV / VSV virus pseudotyped). Se l&#39;aliquota del virus è viscoso, una piccola quantità di DNasi I può e deve essere aggiunto per allentare lo stock, o caricando l&#39;ago sarà estremamente difficile. A<html> goccia del titolo virale (8-10 mL) deve essere collocato su un pezzo di parafilm sterile in preparazione per il carico ago. Quindi, utilizzando la pompa di recesso, accuratamente caricare l&#39;attenzione ago pagare per evitare intasamenti. Posizionare l&#39;ago caricato nella posizione micromanipolatore nella zona di iniezione, facendo attenzione a non rompere l&#39;ago sulla embrioni, o la sonda ecografica. Si noti che se per qualche motivo l&#39;ago viene caricato in maniera significativa prima che l&#39;iniezione è che si verifichi può essere utile per disegnare una piccola quantità di aria nella punta, che può essere scaricato prima di iniziare le iniezioni. Questa sacca d&#39;aria in grado di proteggere contro il calcio virale essiccazione sulla punta dell&#39;ago (un evento che sarà quasi sempre di rendering che l&#39;ago caricato inutile). </li></ol> Parte 5. Ecografia iniezione guidate Viral <ol><li> L&#39;immagine in tempo reale creato dalla sonda ecografica viene visualizzata sul monitor video, e può essere utilizzato per guidare l&#39;ago microiniezione in embrione. Utilizzando questo virus sistema può essere iniettato nel sacco amniotico a E8.5 o sia il sacco amniotico o il sistema ventricolare da E9.5-E11.5 (Figure1B). Questa è la parte più difficile della procedura e richiede una notevole quantità di mani su esperienza di padroneggiare (dell&#39;ordine di 5-20 ore a seconda del ricercatore). La punta dell&#39;ago è evidente nell&#39;immagine ultrasuoni come il punto più chiaro sullo schermo, e dovrebbe essere visto in movimento in conformità con le regolazioni della posizione della sonda (utilizzando i controlli motorizzati nelle y z e aerei, e il controllo manuale della x piano). E &#39;estremamente importante che la direzione di oscillazione della sonda essere parallela alla lunghezza dell&#39;ago. Ciò assicurerà che la punta dell&#39;ago rimane nel piano dell&#39;immagine durante i movimenti di posizione che per l&#39;iniezione in embrione. </li><li> L&#39;embrione deve essere posizionato in modo tale che la regione di destinazione (in questo caso il ventricolo proencefalo) è facilmente visibile e accessibile a l&#39;ago con la minor quantità di materiale uterina nel percorso di iniezione. Inoltre, è fondamentale non iniettare attraverso la placenta. Una volta che la regione del cervello target è allineato con la direzione di avanzamento ago (con la manopola sul micromanipolatore), l&#39;ago deve essere sfiora la parete uterina, e poi un colpo corto veloce in avanti dovrebbe penetrare il tessuto. Un approccio simile è utilizzato per penetrare il sacco amniotico e poi il cervello. In alcuni casi, ricercatore ed esperto in grado di colpire il ventricolo in un unico movimento, soprattutto se l&#39;ago è molto forte. La meccanica del movimento della sonda, l&#39;ago, e gli embrioni (spostando la madre sul palco), richiedono hands-on di pratica per padroneggiare. </li><li> Una volta che il numero desiderato di embrioni è stato iniettato, in prossimità della parete addominale con 5,0 punti di sutura di seta. La meccanica di sutura non sono specifici per questo tipo di chirurgia. Infine, l&#39;uso autoclips veterinaria di base della pelle assieme sui punti nei muscoli addominali. Sutura la pelle non è raccomandato perché il mouse masticare fuori i punti. Analgesia deve essere applicato alla zona di incisione per ridurre la quantità di dolore provato con il mouse come lo risveglia. Si consiglia una soluzione bupivacaina 0,25% da iniettare (0,8 ml / kg, o 2 mg / kg) per via sottocutanea ogni pochi millimetri lungo il sito di incisione. </li><li> Mentre il mouse recupera appoggiare delicatamente l&#39;animale su carta assorbente in una gabbia pulita contenente una confezione di gel (per facilitare l&#39;alimentazione e idratazione). Posizionare la gabbia su un set di diapositive più calda a 37 ° C per mantenere la temperatura corporea. Quando si risveglia, posizionare il mouse e la confezione di gel in una gabbia pulita e tornare al rack animale. </li><li> Il giorno successivo controllare il mouse di qualsiasi sanguinamento vaginale, contrazioni addominali, e / o uno sguardo d&#39;insieme in difficoltà, che indicano l&#39;aborto. Se questo è il caso, l&#39;eutanasia il mouse immediatamente. Capelli ben curati e un aspetto sano generale indicano recupero di successo da un intervento chirurgico. Gli embrioni iniettato può essere sacrificato embrionalmente o dopo la nascita per ulteriori analisi. Se il virus esprime un gene reporter, come la fosfatasi alcalina umana (PLAP) o GFP, una colorazione rivelerà zone di positivo infezione virale (Figure1C). </li></ol> Rappresentante Risultati Embrioni iniettato può essere sacrificato 1-2 giorni dopo l&#39;iniezione fino in fondo fino all&#39;età adulta. Se il virus esprime un gene reporter, come PLAP o GFP, allora espressione giornalista serve per identificare le cellule infettate virale e cloni di quelle cellule. Per esempio, mostrato nella Figura 1C è una sezione di tessuto di un cervello post-natale che è stato infettato in utero a E9.5 con un vettore retrovirale PLAP esprimere. Cellule infette vengono visualizzati come grappoli viola dopo la colorazione istochimica. Oltre a identificare le cellule infettate virale, espressione giornalista permette di esaminare la morfologia cellulare e la posizione, così come lo stato di espressione genica. nt &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Iniezione virale nel topo E9.5 ventricoli proencefalo. A. L&#39;animale anestetizzato è posta sulla fase di iniezione. Due embrioni sarebbe esposto e posizionato sotto la sonda ecografica dove indicato (freccia). L&#39;ago microiniezione pieno di virus si trova vicino al embrioni e allineati con la sonda ad ultrasuoni. Schermo B. cattura di un immagine in tempo reale ad ultrasuoni da un embrione di topo E9.5. V, ventricolo, AS, sacco amniotico; UW, parete uterina. Embrioni C. è stato iniettato un virus PLAP che esprimono a 10,5. Colorazione istochimica per PLAP rivela la posizione degli eventi infezione virale.

<ol>
	<li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range.">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li><li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Iniezioni virale con guida ecografica può essere condotta da E8.5-E11.5, dove solo il sacco amniotico può essere iniettato a E8.5, mentre sia il sacco amniotico e il sistema ventricolare può essere iniettato da E9.5-E11.5. Quando eseguito correttamente, particelle virali iniettato nel sistema ventricolare sotto controllo ecografico ha accesso alle cellule che rivestono il sistema ventricolare e, quindi, può infettare le varie strutture della (neocorteccia, gangli basali, diencefalo, occhio, ecc) proencefalo, mesencefalo , e romboencefalo (Figure1C). Virus iniettato nel sacco amniotico ha accesso alle celle sulla parte esterna dell&#39;embrione. Oltre a virus, guida ecografica può essere utilizzato anche per iniettare le cellule in un embrione di sviluppo. Pertanto, questa tecnica offre molteplici opzioni tra cui scegliere (periodo di sviluppo, la struttura, virus / cellule) durante la progettazione di un esperimento. E &#39;fondamentale che il virus iniettato o cellule esprimono un reporter per una facile identificazione delle cellule infette / iniettato. Storicamente, umano fosfatasi alcalina placentare (PLAP) o GFP sono stati utilizzati. Per esperienza, abbiamo trovato PLAP può essere un gene reporter molto utile perché sia ​​PLAP istochimica e immunoistochimica produce una cellula netta e distinta singola macchia che permette di analizzare la morfologia delle cellule e la posizione, e per realizzare una analisi clonale. Dal momento che l&#39;espressione GFP virale può essere debole, un reporter GFP può non essere ideale per la colorazione dei tessuti, ma è utile se si vuole ottenere singole cellule ordinando fluorescenza delle cellule attivate (FACS).

&quot;Uno dei microscopi seguenti backscatter ultrasuoni possono essere usati per questa procedura. Anche se nel video del P40 da Paradigm-medica è utilizzato, il P40 non è più disponibile in commercio, ed è stato sostituito dal P60, che è allo stesso prezzo e può essere utilizzato per la stessa applicazione. I materiali aggiuntivi descritti per la costruzione fase sono per l&#39;uso con Paradigma-Medical device (s). Vevo Il 2100 è dotato di attrezzature per l&#39;imaging di piccoli animali. <ol><li> P60 biomicroscopio ultrasuoni (UBM) da Paradigma-Medical ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> Vevo 2100 da VisualSonics ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> Anestetici e analgesici La soluzione Nembutal (50 mg / mL di sodio pentobarbital iniettabili; prodotto da Abbott Laboratories) può essere ottenuto da Bulter Salute Animale Schein. Si noti che questa è una sostanza elenco II controllato e richiede un Drug Enforcement Agency (DEA) che autorizza ad ottenere. La soluzione di bupivacaina (0,25%, prodotta da Hospira, Inc., tra gli altri) può essere ottenuto da una serie di distributori, tra cui Moore Medical.

ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at e9.5

Nella chirurgia in utero sopravvivenza in topi permette la manipolazione molecolare dell&#39;espressione genica durante lo sviluppo. Tuttavia, poiché la parete uterina è opaco durante l&#39;embriogenesi precoce, la possibilità di individuare specifiche parti dell&#39;embrione per microiniezione è molto limitata. Fortunatamente, ad alta frequenza ecografia permette la generazione di immagini che possono essere utilizzati in tempo reale per guidare un ago microiniezione nella regione embrionale di interesse. Qui si descrive l&#39;uso di imaging, per guidare l&#39;iniezione di vettori retrovirali nel sistema ventricolare del prosencefalo topo al giorno embrionale (E) 9.5. Questo metodo utilizza una laparotomia per consentire l&#39;accesso ai corni uterini, e un piatto appositamente progettato che permette di ospitare gli embrioni di essere immerso in soluzione salina mentre sono ripreso e iniettata. Interventi chirurgici di successo spesso sfociano in tutti o quasi tutti gli embrioni iniettati sopravvivere a qualsiasi momento successivo punto di interesse (embrionalmente o dopo la nascita). I principi qui descritto può essere usato con lievi modifiche per eseguire le iniezioni nel liquido amniotico di E8.5 embrioni (permettendo così l&#39;estensione dell&#39;infezione lungo anteriore posteriore del tubo neurale, che non è ancora chiuso), o nel sistema ventricolare del cervello E10.5/11.5. Inoltre, a metà neurogeno età (~ E13.5), ecografia può essere usata l&#39;iniezione diretta in regioni specifiche del cervello per infezione virale o trapianto di cellule. L&#39;uso di ecografia per guidare in utero iniezioni nei topi è una tecnica molto potente che permette la manipolazione molecolare e cellulare di embrioni di topo in un modo che sarebbe altrimenti estremamente difficile se non impossibile.

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5 at JoVE.com

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Nella chirurgia in utero sopravvivenza in topi permette la manipolazione molecolare dell&#39;espressione genica durante lo sviluppo. Qui si descrive l&#39;utilizzo di alta frequenza ecografia per guidare l&#39;iniezione di vettori retrovirali nel cervello di topo al giorno embrionale (E) 9.5.

Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

17.9K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. Nella chirurgia in utero sopravvivenza in topi permette la manipolazione molecolare dell'espressione genica durante lo sviluppo. Qui si descrive l'utilizzo di alta frequenza ecografia per guidare l'iniezione di vettori retrovirali nel cervello di topo al giorno embrionale (E) 9.5.

Video: Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Ricerca

Neuroscienze

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Insulina Microiniezione ippocampale e<em&gt; In vivo</emMicrodialisi&gt; Durante il test di memoria spaziale

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Proencefalo registrazione elettrofisiologica in larvale Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizzando metodologie combinati per definire il ruolo della membrana plasmatica di consegna Durante Axon ramificazione e neuronale morfogenesi

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...