この作品は、NIHから115347 - RSG - 08 - 271 - 01 - GMC ACSから、とCA138631からの助成金によって支えられている。

プロトコルは、もともとB.漣、2001年から適応されました。それは、オドムらによるプロトコルのわずかな修正を表します。で見つけることができる5 <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1。事前にブロックし、磁気ビーズへの抗体の結合は、（次のステップの前に夜を実行する必要があります） <ol><li>新鮮BSA / PBS溶液（50 mgを10 mLのBSA PBS -このソリューションは、一週間続く）。1mLにダイナビーズプロテインGを100μLを（IPごとに、複数のIPに対して結合）ウォッシュ</li><li>磁気スタンドを使用してビーズを収集し、洗浄操作をさらに2回繰り返す。 </li><li>次に、PBS / BSA溶液中でのビーズのスラリー（IP毎）の250μlのために抗体10μgを追加し、4℃で回転プラットフォーム上で一晩インキュベート℃の</li><li>完了すると、PBS / BSA溶液1mlにビーズを3回洗浄し、PBS / BSA溶液（IP毎）10μlに再懸濁します。 </li></ol> 2。細胞架橋<ol><li>この手順を開始するには、各免疫沈降、またはIPのために約10 8細胞を成長させる。ここでは、びまん性組織球性リンパ腫U937細胞を96時間のTPAによる単球分化のために使用され、誘導されています。 </li><li>細胞増殖に続いて、1％の最終濃度に直接メディアにホルムアルデヒド溶液を加える。その後、スワールフラスコの簡潔にし、それらを室温で10分間座ってすることができます。その後、培地を吸引除去し、氷冷PBS 15 mLで細胞をリンス。一度この洗浄を繰り返します。 </li><li>次に、それぞれに溶解バッファー1（プロテアーゼ阻害剤を含む50mM HEPES - KOH、pH7.5の、140mMのNaCl、1mMのEDTA、10％グリセロール、0.5％NP - 40、0.25％トリトンX - 100、）6 mLを加え氷の上にフラスコの。その後、4℃で20分間フラスコを揺らし℃に</li><li>最後に、セルスクレーパーを用いて細胞を収穫し、15 mLコニカルチューブに移す。この時点で、細胞は-80℃で保存することができます</li></ol> 3。細胞の超音波処理<ol><li>細胞が凍結されていた場合、それらを解凍。融解後、4℃で10分間、3,000 rpmで細胞をスピンダウンし、上清を捨てる。その後、溶解バッファー2（10mMトリス- HCl、pH8.0の、200 mMのNaCl、1mMのEDTA、0.5mMのEGTA、プロテアーゼ阻害剤を含む）の6 mLで細胞を懸濁します。室温で10分間穏やかにチューブを揺らし。 </li><li>遠心分離を繰り返して、溶解バッファー3（10mMトリス- HCl、pH8.0の、100mMのNaCl、1mMのEDTA、0.5mMのEGTA、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、0.5％N -ラウロイルサルコシン、プロテアーゼ阻害剤を含む）2.5 mLで細胞を再懸濁。 </li><li>次に、50〜60％の振幅の間に設定さブランソン450超音波処理のマイクロチップを氷水のビーカーに置くことで超音波処理のために懸濁液を調製。 </li><li> 1分間氷上で30秒間一定バーストと涼しいのためのソリューションを超音波処理してください。これらのパルスを10〜15回繰り返します。その後、上下チューブの内容物をピペットで新しいチューブに移す。さらに5回パルスソリューションを冷却し続ける。 </li><li>超音波処理後、溶液の体積のトリトンX - 100〜1 / 10 10％を追加。 1.5 mLの遠心チューブにライセートを移し、マイクロ遠心機でゴミをスピンアウト。次に、新しいチューブに細胞溶解液を移す。 </li></ol> 4。クロマチン免疫沈降<ol><li>前のクロマチン免疫沈降法、またはチップに、入力のサンプルとして、細胞溶解物50μLを保存します。その後、ダイナビーズ上述のように事前に準備されている抗体に事前にバインドされて清澄化細胞ライセートを組み合わせる。 4℃で一晩、50μLの入力サンプルに加えて、混合物を揺らし。 </li><li>洗浄緩衝液1 mL（50mMのHEPES - KOH、pHは7.6、0.5 M塩化リチウム、1mMのEDTA、0.7％デオキシコール酸ナトリウム、1％NP - 40）でビーズを洗浄する。その後、ビーズを収集し、上清を除去する磁気スタンドを使用してください。この洗浄を6〜8回を繰り返します。 </li><li> 1 mLのTE -プラス50mMのNaCl（10mMトリス- HCl、pH8.0の、50mMのNaCl、1mMのEDTA）で最終洗浄を行います。 4℃で2分間3000rpmで遠心でビーズをスピン℃に遠心分離に続いて、任意の残留TEバッファーを吸引除去する。 </li><li>その後、試料に溶出バッファーを100μL（50mMのTris - HCl、pH8.0の、10mMのEDTA、1％SDS）を追加します。直後に、65でサンプルをインキュベート℃で10分間から15分間。懸濁液中にビーズを保つために1.5 mlチューブをラックごとに2分に対して、チューブに傷を付けない。 </li><li>遠心分離と磁気スタンドを使用してビーズを収集し、そしてPCRチューブに上清を移す。その後、以前に保存した入力サンプルを取得し、溶出バッファーの3つのボリュームを追加します。 </li><li>最後に、65℃一晩サーマルサイクラーにIPと入力サンプルを配置° Cにクロスリンケージを逆。 </li><li>翌日、試料をTE緩衝液の1ボリュームを追加します。その後、0.2μg/μLの終濃度にRNase Aを追加。 37℃で1〜2時間サーマルサイクラーにサンプルをインキュベート℃に</li><li>インキュベーション後、0.2μg/μLの終濃度にプロテイナーゼKを追加します。その後、2時間55℃でサーマルサイクラーにサンプルをインキュベートする。 </li><li>次に、フェノールの一冊で一回のサンプルを抽出する。クロロホルム：イソアミルアルコール、フェノールの一冊でサンプルをもう一度抽出する。イソアミルアルコール：最後に、クロロホルムの一冊で一回より多くのサンプルを抽出する。 </li><li>その後、各サンプルにグリコーゲンの30μgのを追加。また、サンプルにエタノールの0.2モルと2つのボリュームの最終濃度にNaClを加える。 -80 30分のためにそれらをインキュベート℃にインキュベーション後、サンプルをスピンし、上清をデカントする。 75％エタノール500μLでペレットを洗浄してください。その後、ペレットを乾燥し、それらは水40μLで再懸濁する。 </li><li>超音波処理の手順によって生成されるDNA断片のサイズを確認するには、1.8％アガロースゲルで精製された入力サンプルの5μgをロードし、ゲルを実行します。超音波処理の手順は、150から350塩基対の範囲内でフラグメントを生成する必要があります。フラグメントがこの範囲に該当しない場合は、、超音波処理の手順は、バーストと振幅の数を変えることによって調整されるべきである。 </li><li> IPサンプルと入力サンプルの希釈系列の1μlと遺伝子特異的PCRを行うことにより、制御結合領域の濃縮は、チップの堅牢性と特異性を確認するには。 2〜3&quot;バウンド&quot;の領域と非連結コントロールの領域は、IPと入力サンプルの品質をテストするために選択する必要があります。 </li></ol> 5。ゲノムDNAの増幅<ol><li>ゲノムDNAサンプル調製キットを使用してDNA断片へのアダプターの&#39;テールに加え、ライゲーション、最後の修復を実行、IPサンプル34μlまたは、入力サンプルの200 ngのを皮切りに<a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/をgenome_analyzer.ilmn</a> （イルミナ社、サンディエゴ、CA）。 </li><li>アプライPCR精製キットを用いてDNAを精製し、その後50℃にあらかじめ温めておいたれているバッファEB（10 mMトリスClを、pH8.5）にそれを溶出させる例えば、それぞれ、IPと入力のDNAサンプルの最終的な溶出に23μLと46μLを使用してください。 </li><li>アダプタを搭載したDNAの23μL、およびキットから25μLPhusion DNAポリメラーゼ、20μMのSol_PCR_1、および20μMSol_PCR_2の1μLの1μLを用いてPCR反応を行う。次のようにPCR反応実行：、2）10秒98℃、3）65 ° Cで30秒、℃、98℃1）30秒4）30秒、72℃で、繰り返しのステップステップ2-4 18最終的に4℃で保持して時間と72℃で5分° C、° C. </li><li> PCR増幅に続いて、QIAGENアプライPCR精製キットでDNAを精製。 50〜バッファのEBのプレ暖かい15μL℃、DNAを溶出する。サンプル1:4の0.5μLを希釈し、光度計の読み取りを行います。 </li></ol> 6。増幅産物のゲル精製<ol><li>増幅産物を精製するために、HPLCグレードの水を用いて50 mLの1.8％アガロースゲルを準備する。アガロースが溶解した後、TAEとエチジウムブロマイドを追加。その後、ゲルを注ぐ。入力とIPサンプルにローディングバッファーの4μLを追加した後ゲルをロードします。その後、45分間120ボルトで泳動する。 </li><li>それが実行された後のゲルを解析する。ゲルは、150および350塩基対の間の範囲のフラグメントが生成されていることを明らかにする必要があります。彼らは長さと、アダプタで50〜250塩基対の間のゲノムDNA断片を表しています。 </li><li>メスを持つ150 350塩基対の範囲内の物質を含むゲルの物品の領域。約120塩基対で動作するアダプタ - アダプタのバンドを、切り出すように注意してください。メーカーの指示ごとQIAクイックゲル抽出キットを用いてDNAを回収する。具体的には、400 mgまたは以下のゲルスライスのQIAクイックゲル抽出キットから1つの列を使用してください。抽出プロセスを開始するには、ゲルの1ボリュームにQGバッファの3つのボリュームを追加します。イソプロパノールの1ボリュームを追加し、カラムに混合物をロードする。キット取扱説明書に記載されている標準の手順に続いて、カラムを洗浄するQGを0.5 mlのを使用してください。 H 2 Oを使用して、予め温めておいた50℃DNAを溶出する。それをスピンダウンする前に37℃で5分間、H 2 O30μlの° Cでカラムをインキュベートします。 </li><li>熱のないSpeed​​vacでダウン正確に11μLのサンプルを乾燥させる。サンプルの1μLを削除し、光度計分光光度計を用いてDNA濃度を測定する。 </li><li>最後に、で説明したイルミナGenome AnalyzerIIe使用して濃縮された遺伝子産物を識別<a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/supplを</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6。 </li></ol> 7。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="図1" /> 図1は、次の実験の全体的な目標は、KDM5A/JARID1A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素のゲノム標的を同定することです。 （P1）これは、適当な大きさのDNA断片を生成するために超音波処理され、クロスリンクされたクロマチンの調製により達成されます。 （P2）第2段階として、RBP2結合したDNA断片は、RBP2抗体で免疫沈降されています。 （P3）次に、回収したDNA断片は、両端に修復され、アダプタは、イルミナClusterの駅でフローセルに分析のためにゲノムDNAのライブラリーを準備するためにゲノムDNAの末端に連結されている。 DNAライブラリーは、サイクル数が少ないを使用してPCRにより増幅されています。 （P4）最後に、イルミナシーケンス短いが一意にヒトゲノムに整列されている読み取り、有意なピークがRBP2濃縮領域を識別するために、同定され、最も近い遺伝子にアノテートされています。 （P5）の結果はRBP2濃縮領域のゲノムワイドな同定に基づくRBP2標的遺伝子と関連分子の機能を示すことが得られる。 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。超音波処理の手順によって生成されるDNA断片のサイズを確認するにはクロマチン超音波処理の結果をチェックし 、精製された入力サンプルの5μgの（1 / 10）1.8％アガロースゲルにロードされました。予想通り、私たちの超音波処理の手順は、150から350 bpの範囲内のフラグメントを作り出した。フラグメントがこの範囲に該当しない場合は、、超音波処理の手順は、バーストと振幅の数を変えることによって、それに応じて調整する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。増幅産物のゲル精製。PCR産物は、アダプタを削除し、クラスタ生成プラットフォーム用のテンプレートのサイズ範囲を選択するにはゲル上で実行されています。このゲルは、150および350塩基対の間の範囲内のフラグメントが作り出されたことを示しています。彼らは長さと、アダプタで50〜250塩基対の間のゲノムDNA断片を表しています。メスを用いてゲルの我々は、物品税、選択された地域。ケアは、約120塩基対で動作するアダプタ - アダプタのバンドを、避けるように注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。アイソフォーム特異的抗体は、RBP2の大小のアイソフォームを区別することができます。RBP2タンパク質の構造がドメインのビューで提供される。触媒ヒストン脱メチル化JmjCドメインと関連付けられているJmjNドメイン、配列特異的DNA結合、潜在的にDNAや他のタンパク質と相互作用する可能性C5HC2ジンクフィンガー、および複数のPHDドメインが可能な乾燥ドメイン：RBP2は、いくつかのドメインが含まれています。 RBP2アイソフォームを区別するための2つの抗RBP2抗体は太い線で示されるRBP2断片に対して誘導された。 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="図5a" /> 図5a。 （全てのアイソフォームと大きなアイソフォーム）濃縮RBP2を識別結合領域の染色体とEnsemblの遺伝子と一緒にRBP2結合領域の概要。ゲノム座標は、染色体が賢明表示されます。 Ensemblの遺伝子のOccupances（バージョン54、HG18）染色体では（この写真では10番染色体）、黒いバー（上部パネル）として表示されます。各RBP2結合領域は、中央のパネルはすべてRBP2アイソフォームの10番染色体、および底部パネルの結合領域を示す垂直線として表されますRBP2大きなアイソフォームの結合領域を示しています。中央と下部のパネルは、10番染色体上の重複やRBP2アイソフォームの特異的占有の概要を示します。 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="図5b" /> 図5b。 RBP2標的遺伝子の機能的な濃縮分析。ヒートマップFDRが大幅に修正を示す（p値≤0.05）濃縮はRBP2（すべてと大きなアイソフォーム）で（RBP2結合領域に最も近い遺伝子）バインドされた遺伝子の中で分子機能のカテゴリを移動します。赤色に向かって色が高い統計的有意性を示すため、黄色は低い統計的有意性を示し、灰色は統計的有意性がないことを示します。濃縮分析はRBP2標的遺伝子の重複とアイソフォーム特異的な分子の機能を示しています。

<ol>
	<li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger.">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation.">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li><li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation.">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation.">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li><li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li><li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia.">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

RBP2アイソフォームの機能的な違いが決定されていない。我々はRBP2アイソフォームがバインドされているゲノム領域を特定し、これらの地域が表す​​機能的なカテゴリを定義する包括的なアプローチを使用している。これは、得られた配列を読み取るのバイオインフォマティクス解析に続いてのChIP - seqの分析によって達成されました。 RBP2はヒストンテール上のメチル化リジン残基を変更します。我々はRBP2大きなアイソフォームは、ヒトゲノムのさまざまな地域（図5A）に、このモジュールのバインドを欠いているメチル化ヒストンリジンとRBP2小さなアイソフォームの認識モジュールが含まれていることがわかった。重要なのは、アイソフォーム固有の領域と重複する領域が異なる分子の機能（図5B）を持つ遺伝子に属します。例えば、&quot;クロマチン結合&quot;と&quot;転写因子結合&quot;関数がRBP2小さなアイソフォームの遺伝子標的に帰することができますが、ないのRBP2大きなアイソフォーム（図5B）。実際の遺伝子を比較することによって、すべてのアイソフォームとRBP2大きなアイソフォーム（データは示さず）に対して生成されたセットに大きなアイソフォームは、特に、特定の遺伝子に募集されている場合、我々はまた、定義することができます。

オリゴヌクレオチド配列2006イルミナ株式会社すべての権利を保有。 <ul><li> Sol_PCR_1 配列5&#39; - AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T - 3&#39; </li><li> Sol_PCR_2 配列5&#39; - CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T - 3&#39; </li></ul>

genome-wide analysis using chip to identify isoform-specific gene targets

彼らのターゲットへの転写やエピジェネティックな要因の採用は、彼らの調節に重要なステップです。目立つように特定のヒストン修飾に結合するタンパク質のドメインは、募集に掲載。そのようなドメインは、いくつかのクロマチン結合タンパク質に見られる植物のホメオドメイン（PHD）、です。エピジェネティックな因子RBP2が複数のPHDドメインがある、しかし、彼らはさまざまな機能（図4）がある。特に、ヒト白血病におけるRBP2発癌性の融合に見られるC末端PHDドメインは、ヒストンH3のトリメチル化リシン4（H3K4me3）1に結合する。 C末端PHDを含むRBP2のアイソフォームに対応する転写産物は、単球2にpromonocytic、リンパ腫由来、U937細胞の分化の間に蓄積されます。両方のデータセットと一致し、ゲノムワイドな解析は、分化したU937細胞では、RBP2タンパク質が非常にH3K4me3 3に富むゲノム領域に局在化されることを示した。そのターゲットにRBP2の局在はRBP2ヒストン脱メチル化酵素活性と転写活性の減少により、H3K4me3の減少と相関している。対照的に、RBP2の二つの博士号は、H3K4me3をバインドすることはできません。特に、RBP2のC末端ドメインPHDは小さなRBP2アイソフォーム4の不在である。それはH3K4me3との相互作用を欠いているRBP2、、の小さなアイソフォームは、ゲノムの位置に大きなアイソフォームとは異なることが考えられる。 RBP2アイソフォームの遺伝子位置の違いはRBP2機能で観測された多様性を占める可能性があります。具体的には、RBP2は、網膜芽細胞腫タンパク質（pR​​Bの）により媒介される細胞の分化において重要なプレーヤーです。これらのデータ、以前のゲノムワイドな解析と一致し、アイソフォームを区別することなく、RBP2標的遺伝子の2つのグループ識別：1）差別化とは独立した方法でRBP2に拘束される遺伝子;でRBP2に拘束される2）遺伝子の分化依存的。 アイソフォーム間で局在の違いを識別するために我々はChIP - seqでゲノムワイド位置解析を行った。我々はすべてのRBP2のターゲットの位置を確認したRBP2アイソフォームの両方を検出する抗体を使用する。さらに我々は唯一の大規模な、そして小さなはなくRBP2アイソフォーム（図4）に結合する抗体を持っている。大規模なアイソフォームのターゲットを特定した後、一つは、小さなアイソフォームのターゲットを明らかにするために、すべてのRBP2ターゲットからそれらを差し引くことができます。これらのデータは、ゲノム中のその結合部位へのタンパク質補充にクロマチンと相互作用するドメインの寄与を示しています。

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Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

ここでは、ヒストン結合ドメインが異なるタンパク質アイソフォームのゲノムワイド位置解析のためのクロマチン免疫沈降（ChIP）の手順を提示している。我々はKDM5A/JARID1A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素の標的を同定するためのChIP - seqの分析に適用しています。

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.4K ビュー.  University of Illinois Chicago - UIC. ここでは、ヒストン結合ドメインが異なるタンパク質アイソフォームのゲノムワイド位置解析のためのクロマチン免疫沈降（ChIP）の手順を提示している。我々はKDM5A/JARID1A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素の標的を同定するためのChIP - seqの分析に適用しています。

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

生物学

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

マイクロアレイを用いたtRNAのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

多様ChIPseqデータ型のゲノムワイドな解析のための新規ベイジアン変化点アルゴリズム

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of limited use in exploring bacterial two component regulatory systems with uncharacterized activation conditions. Such systems regulate transcription only when activated in the presence of unique signals. Since these signals are often unknown, the in vitro microarray based method described in this video article can be used to determine gene targets and binding sites for response regulators. This DNA-affinity-purified-chip method may be used for any purified regulator in any organism with a sequenced genome. The protocol involves allowing the purified tagged protein to bind to sheared genomic DNA and then affinity purifying the protein-bound DNA, followed by fluorescent labeling of the DNA and hybridization to a custom tiling array. Preceding steps that may be used to optimize the assay for specific regulators are also described. The peaks generated by the array data analysis are used to predict binding site motifs, which are then experimentally validated. The motif predictions can be further used to determine gene targets of orthologous response regulators in closely related species. We demonstrate the applicability of this method by determining the gene targets and binding site motifs and thus predicting the function for a sigma54-dependent response regulator DVU3023 in the environmental bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

This video article describes an in vitro microarray based method to determine the gene targets and binding sites for two component system response regulators.

細菌のための2つの成分​​規制システムを遺伝子標的を決定するために、DNA親和性精製チップ（DAP-チップ）方法

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).