国防総省（アイデア賞W81XWH-07-0406） - ウルスAtasoyへ NIHのRO1 A1080870 - ウルスAtasoyへ NIHのR21はA1079341 - ウルスAtasoyへインスティテューショナル·ファンドミズーリ大学 - ウルスAtasoyへ

実験の準備実験を開始する前に、それはすべての試薬、容器や調理器具RNaseフリーを持っていることが重要です。 DEPC処理水ですすぎ、続いてRNaseインヒビター（RNaseZAP、Ambion社）を用いてガラス器具を扱う。すべての試薬はRNaseフリーであることが確認されていることを確認します。 1。 mRNPライセートを調製<ol><li>成長し、各RIPの総タンパク質の2-5 mgの間に生成するために指数関数的に成長している組織細胞を収穫します。 <ol class="lalpha"><li>二つP150の培養皿で十分です。 </li><li>調査されて各RBPは、総細胞数と蛋白質の量は、適切な標的mRNAとRBPの相互作用を最大化するために最適化する必要があります。 </li><li>定量RT-PCR分析のために、RIPは、特に、HuRの、AUF1、TIARとして高いアバンダンスRBPs向けの増幅及び検出方法によるより少ない細胞溶解物（約400μgの総タンパク質）が必要な場合があります。 </li></ol> &lt;/ LI&gt; <li> 4 8〜10分間、200×gで℃で遠心分離によって細胞をペレット化し、次に、氷冷PBSで3回洗浄する。 </li><li>最後の洗浄の後、静かにRNaseおよびプロテアーゼ阻害剤を用いてプリペアドポリソーム溶解バッファー（PLB）の等量チューブの底を再懸濁し、細胞ペレットをはじく。 <ol class="lalpha"><li>それは、細胞ペレットの正確な体積を測定することをお勧めします。 </li></ol></li><li>氷上で5分間インキュベートした細胞溶解物の塊を分解するために静かにピペット混合（ボルテックスしないでください）​​。 </li><li> 4℃で20分間13000×gで遠心℃の破片のライセートをクリアする。 </li><li>直ちに予冷微量遠心チューブに上清クリア移す。 </li><li> -80℃で氷とストアを続ける℃まで<ol class="lalpha"><li>即時凍結は細胞の適切な溶解が完了し、不要な結合を防ぐことができます。 RIPは直ちに次のサンプル雪解けを進め、RNAの分解を避けるために、サンプルを氷上で保管してください。&lt;/ LI&gt; <li>この溶解物を、-80℃で最大6ヶ月間℃に保存することができるこれはタンパク質および/またはmRNAの分解につながることができるように繰り返し凍結融解の繰り返しは避けてください。 </li></ol></li><li>標準Bradfordタンパク質アッセイを用いてライセート中のタンパク質濃度を定量する。 </li></ol> 2。抗体およびウォッシュ付きコートタンパク質は、セファロースビーズ<ol><li> 5％BSAでNT2バッファー（3-4巻）中で一晩プレうねりプロテインAセファロース（PAS）をビーズ。 4℃で保存する<ol class="lalpha"><li> 4℃で数ヶ月までの長期貯蔵℃の0.1％アジ化ナトリウムを補充した場合に可能です。 </li><li>プロテインAセファロースビーズをターゲットRBP抗体のアイソタイプに基づいて選択されるべきである。タンパク質は、GおよびA / Gは、すべての特定のアイソタイプの目標を持ち、目標親和性が異なります。プロテインAセファロースビーズをHuRのタンパク質抗体のアイソタイプ特異性と親和性に基づいて使用されていました。 </li></ol></li><li>ご使用の前に、そう、過剰NT2バッファを削除バッファーの比率への最終的なビーズは1:1である。 </li><li> 1.5ミリリットルRNaseフリーのマイクロチューブを使用して、PASスラリー液100μlを削除して、個々のIP反応（ すなわち 、特定のRBPとアイソタイプコントロール）に対する抗体の30μgを追加します。 </li><li>抗体ビーズミックスにNT2バッファ100〜200μlを添加する。 <ol class="lalpha"><li>混合物を4℃で数週間保存可能℃の0.1％アジ化ナトリウムを補充したとき。 </li><li>同じ種からのアイソタイプをマッチさせた抗体または全部正常血清は、バックグラウンド·RNAに対する抗体対照として並行して使用されるべきである。 </li></ol></li><li>ビーズミックスに適切な抗体を加え、一晩インキュベートし、4℃で端の上の端を、タンブリング℃に<ol class="lalpha"><li> （抗体の1、5、10または30μgの通常十分です）を調べている特定のタンパク質に対する抗体価を最適化します。 </li></ol></li><li> 1mlで洗浄することにより、使用直前に抗体被覆ビーズを準備氷冷NT2バッファー5回。 <ol class="lalpha"><li> 4℃で1〜2分℃、13,000 xgで遠心分離することによりビーズミックスを洗う</li><li>慎重に手ピペッターまたはアスピレーターでsupernantantの最大量を削除するが、ペレットの中断を回避するように注意してください。 </li><li>洗濯は、抗体混合物から未結合の抗体と同様のRNase汚染物質を除去するのに役立ちます。 </li></ol></li><li>最後の洗浄が完了した後、氷冷NT2バッファは100mMの10μlを、40 U /μLでRNaseを10μlの外を含む、標的mRNAを保護するためのさまざまなRNase阻害剤を用いた治療が続くの700μlのビーズを再懸濁DTTおよび15μlのEDTA（15 mM）を。 NT2のバッファーで1,000μlにボリュームを持ってきて。 <ol class="lalpha"><li>バナジルリボヌクレオシド複合体は、EDTAの抑制効果があるため、使用されていません。 </li></ol></li></ol> 3。免疫沈降およびRNA沈殿<ol><li>オプションのプリ·クリアーの手順：<ol class="lalpha"><li>バックグラウンドを低減するために、ビーズとコントロール抗体を事前クリアライセートに使用されるかもしれません。これにより、出力の信号を減​​少させることができる。 </li><li>このステップでは、マイクロアレイに続くIPを実行するときにバックグラウンドを低減する必要があるかもしれません。これは、一般的に定量RT-PCRに続いてIPアドレスは必要ありません。 </li><li>末に比べ30分/ 4℃タンブリングエンドのアイソタイプコントロール15μgの持つプリ·クリアー。 </li><li>ステップ2.1から抗体と非被覆予め膨潤PASビーズの50μlを添加する。 </li><li>末に比べ30分/ 4℃で回転端とをインキュベート</li><li> 4℃、10,000×gで遠心分離しますIPのための上澄み保存します。 </li></ol></li><li>調製した抗体ミックスに隔離された清澄化ライセート（約2〜5 mg）の100μlを添加する。 <ol class="lalpha"><li>ライセートを希釈して、バックグラウンドや非特異的結合を低減するのに役立ちます。 </li><li>ライセート入力の量は検出方法及びRBP oの豊富さによって異なりますステップ1.1.c.で述べたように、RBP抗体のr効率</li></ol></li><li> （オプション）直ちに静かに4℃、10,000×gで短時間の遠心分離に続いて数回タッピングしてチューブを混ぜ℃でペレットビーズへと直ちに標準RNA単離技術を用いた定量PCR解析のための総入力mRNAの表現として100μlの上清を除去します。 <ol class="lalpha"><li>このステップでは、入力ライセートRNAがIPのための最適であり、唯一のチェックステップとして、または貧しいRNAの結果でRIPは、次のトラブルシューティングの手順として実行する必要があることを確認するためのものである。 </li></ol></li><li>パラフィルムでラップ管端の上の端を、タンブリング、2から4時間、4℃で密封し、インキュベート℃を確保する。 <ol class="lalpha"><li>インキュベーション上のタイミングは、ターゲット豊富に基づいて最適化されるべきであり、複雑な転位または分解を避けるために、最小化されるべきである。一部RBPsに短いインキュベーションは、より最適かもしれません。 </li></ol></li><li> 5000 XGFでペレットビーズまたは4°Cで5分とウェスタンブロット法によって潜在的な分析のために上澄み保存。 -80℃でアリコート℃で保存し<ol class="lalpha"><li>残留標的タンパク質の多量と上清のアリコートは、セファロースビーズにより沈殿するタンパク質の障害を示すことがあります。 </li></ol></li><li>前述したように、氷冷NT2バッファと遠心分離（4℃で5分間5000 xgで℃）1mlのビーズを5回洗い、次にハンドピペッターまたはアスピレーターで上清を除去します。 <ol class="lalpha"><li>より厳格な洗浄方法はデオキシコール酸ナトリウム、尿素やSDSとNT2のバッファを補充することにより、バックグラウンドを低減するために使用されるかもしれません。 </li><li>できるだけサンプルを氷上で維持し、標的mRNAの分解を最小限に抑えるために迅速に作業。 </li></ol></li><li>オプション：ウェスタンブロット解析を用いた標的タンパク質のIP効率を確認するためのビーズミックスの少量（10％）を保存したり並列に追加のサンプルを実行します。</li></ol> 4。 DNaseおよびプロテイナーゼKトリートメント<ol><li> RNaseフリーのDNase 1（2 U /μl）を5μlのを補足したNT2の100μlの緩衝液で洗浄した後、再懸濁したビーズ。 </li><li> 5〜10分間37℃で保管してください。 NT2緩衝液1mlを加え、室温で1分間5000 xgで遠心分離します。 <ol class="lalpha"><li>ビーズの小（〜10％）のアリコートをSDS-PAGE分析することによって、IP効率を確認するために用いることができる。 </li></ol></li><li> 100μlのNT2バッファーに再懸濁し、PASペレットを、5μlのプロテ​​イナーゼK（10 mg / ml）を、および1μlの10％SDS。 </li><li>穏やかに10分ごとにフリック、55℃の水浴中で30分間再懸濁したビーズ混合物をインキュベートする。 <ol class="lalpha"><li>プロテイナーゼKは、RNPの成分の放出に役立ちます。 </li></ol></li><li>ペレットは、室温で5分間5000 xgで（RT）でビーズと（〜100μl）の上清を回収する。 </li><li>遠心、ビーズに200μlのNT2のバッファを追加室温で2分間フーガ5000 XGは、上清（約200μl）を、廃棄ビーズを収集します。 </li><li>上清（100μlと200μl）を組み合わせると酸フェノール- CHCl 3を 300μlの下位層を追加します。 </li><li>渦、1分間RT（または37℃シェーカーのC）と1分間室温で16000×gで遠心分離してください。 </li><li>上位層250μlの（インターフェイスを妨害することはありません）を採取し、pHは5.2、625μlの100％エタノールおよび5μlのglycoblueで25μlの酢酸ナトリウムを加え、よく混ぜる。 </li><li> -20℃で一晩保存する<ol class="lalpha"><li> RNAの適切な復旧を保証するために、glycoblueの添加は担体分子として作用することにより、RNAペレットの視認性を向上します。 </li></ol></li><li>反転による翌日、混合管3-5回、4で12,000 xgでスピン℃で30分間、上清を捨てる。 </li><li>青いペレットと反転またはボルテックスに70％エタノール1 mlを加える。 </li><li> 2分間4℃で12,000×gで遠心します。 </li><li> D上清をiscardと4℃で1分間、12,000×gで遠心する℃、 </li><li>室温で5分間ピペットて空気乾燥してペレットと残留し、70％EtOHを削除します。 </li><li>のRNase / DNaseフリー水または必要に応じて他の適切な体積の20〜40μlに再懸濁する。 <ol class="lalpha"><li>サンプルは現在、そのような定量RT-PCRやマイクロアレイなどのさらに下流のアプリケーションの準備ができています。 </li><li>光度計分光光度計は、試料濃度を評価する際に使用されるかもしれませんが、貴重なサンプルと、それはそれは無駄が多く、相対的に不正確になることができるようnanodroppingサンプルを回避するために有益であるかもしれません。我々は貴重なまたは低収量サンプルの純度およびIP効率を評価するために、ハウスキーピング遺伝子の転写産物に正規化サンプルを示唆している。 </li></ol></li></ol> 5。代表的な結果手順が最適化され、正しく実行されている場合は、免疫沈降は、標的mRNAの有意な富が得られるはずです。一般的に定量RT-PCRによって評価した場合、50倍に - 、RBPとそのmRNA標的（複数可）に応じて、我々は、約10の濃縮を参照してください。 RBPsの多くのターゲットは、マイクロアレイ解析を用いて一斉に発見することができます。しかし、この方法は、定量RT-PCRに比べて劣化の影響を受けやすくなります。 RBPは、ターゲットの数と反応の効率に応じて、マイクロアレイは、新規ターゲットの数百人を明らかにすることができ、または任意の場合にのみ、いくつかが明らかになることがあります。例えば、より良い特徴RNA結合タンパク質HuRのの一つは、転写後に多くの重要な生理的遺伝子1,2の発現および翻訳を調節する。乳癌細胞株において、RIP-チップ経由HuRの-ribonucleo複合体の分離は、例えば、 図1に示すように、定量RT-PCRを用いたβ-アクチンを含むいくつかの重要な既知のHuRのターゲット、の富を明らかにした。癌細胞株のβ-アクチンの両方に12を豊かにします - 15倍に。一般的に、適切に実行したとき、我々はかなりのENRを参照してください細胞株の様々なβ-アクチンのichment。 RIPは、β-アクチンの任意の有意な富を明らかにしない場合は、これは、RIPの問題を示していると手順を繰り返す必要があります。 図2 1に示されるように、さらに、これらの細胞株からの免疫沈降サンプルのマイクロアレイ解析は、異なるエストロゲン受容体におけるHuRのターゲット（ER）陽性のMCF-7癌細胞に対するER陰性のMB-231乳癌細胞株の異なる表現のサブセットを明らかにした。どちら関連や癌に関連付けられていない既知および未知のHuRのターゲット：これらのターゲットは、いくつかのカテゴリに分類されます。たとえば、CALM2とCD9は以前HuRのターゲットとして同定されなかった両方の癌遺伝子である。 HuRのタンパク質およびこれらの標的遺伝子との間に顕著な相互作用を示すHuRのペレットに富んで180倍に - マイクロアレイを使用しており、定量RT-PCRで確認し、CALM2とCD9は5であることがわかった。 <iMG SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpgの&quot; alt = &quot;図1&quot; /&gt; 図1。免疫沈降およびMB-231でRIP（ER）およびMCF-7（ER +）乳癌細胞。免疫沈降は抗HuRのモノクローナル抗体（3A2）とIgG1アイソタイプコントロールを使用して、MB-231またはMCF-7細胞ライセートから行った。 3A2によって検出されるようなフルのA. IPウエスタン予想されるサイズのバンドを明らかにした。右側のパネルには、ローディングコントロールとして、β-チューブリンと、両細胞株から使用ライセート入力でHuRの量を明らかにする。定量的RT-PCR法によるBの検証はそれぞれMB-231およびMCF-7、3A2からIPSで、β-アクチンの15と11倍濃縮、既知HuRの目標を示した。すべてΔΔCT値をGAPDHに対して標準化した。実験は（n = 2）を二重に行った。 <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 HuRのRIP-CHIPはER +とER-乳癌細胞内での個別の遺伝的プロファイルを識別します。HuRのの免疫沈降は、MB-231またはHuRの抗体とイルミナSentrixアレイ（47000遺伝子）にハイブリダイズしたIgG1アイソタイプコントロールを使用して、MCF-7細胞ライセートから行った。制御信号は差し引いた。結果は、12の異なるアレイからの累積データを表します。実験が一致するコントロールと各セルラインの三連（n = 3）の中で行った。スケールは、log2です。

<ol>
	<li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer.">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li><li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+RNA+binding+protein+HuR+impairs+tumor+growth+in+triple+negative+breast+cancer+associated+with+deficient+angiogenesis.">Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).</li><li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP-Chip:+the+isolation+and+identification+of+mRNAs,+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts.">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).</li><li>Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonomics:+identifying+mRNA+subsets+in+mRNP+complexes+using+antibodies+to+RNA-binding+proteins+and+genomic+arrays.">Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays.</a> Methods. 26, 191-198 (2002).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+regulatory+analysis+using+en+masse+nuclear+run-ons+and+ribonomic+profiling+with+autoimmune+sera.">Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.</a> Gene. 317, 79-87 (2003).</li><li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).</li><li>Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+RIP-Chip+Analysis.">Advances in RIP-Chip Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).</li><li>de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR.">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).</li><li>de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR:+post-transcriptional+paths+to+malignancy.">HuR: post-transcriptional paths to malignancy.</a> RNA Biol. 2, 11-13 (2005).</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+stability+using+transcription+inhibitors+and+microarrays+reveals+posttranscriptional+control+of+ribosome+biogenesis+factors.">Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors.</a> Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).</li><li>Hieronymus, H., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA-protein+interactions+illustrates+specificity+of+the+mRNA+export+machinery.">Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery.</a> Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).</li><li>Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mRNA+surveillance+is+coupled+to+mRNA+export.">Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export.</a> Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).</li><li>Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Regulatory+Mapping+Indicates+that+the+RNA-Binding+Protein+HuR+Couples+Pre-mRNA+Processing+and+mRNA+Stability.">Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability.</a> Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).</li></ol>

著者らは、彼らが競合する利益を持っていないことを宣言します。

この実験では、最適化と経験の性質のために正常意図した結果を取得するための唯一の保証された方法になります。この手順の多くの手順では、温度及び試薬や製品の効率的な処理が非常に重要です。適切な計画と技術の実行は、実験が推奨される最適な温度で適切な時間枠内で行われたことを保証するのに役立ちます。 RNA分離実験との大きな問題は、RNアーゼによる分解に対するRNAの感度である。全ての試薬は、RNaseフリー、RNaseフリーのコンテナで保管または使用する必要があります。これはあなたのmRNAサンプルの完全性を確保する上で重要なステップです。実験が適切に行われている場合であっても、しかし、望ましい結果はRBPとその標的mRNA間の相互作用の性質によって達成されない場合があります。 一つの潜在的な問題は、RIP-チップによって単離されたRNAからの低あるいは無信号を抱えている。全RNAからの信号があるかもしれませんが、これはビーズでプルダウンされている不適切な結合タンパク質の結果であるかもしれません。トラブルシューティングの最初のステップは、使用されている細胞溶解物は、特定のRBPの適切な表現を持っていることを確認することです。確認後、タンパク質は最終NT2洗浄後に単離することができるとLaemmli緩衝液または他の適当な変性緩衝液に再懸濁し、95℃で加熱し5分間インキュベートする。ウェスタンブロット分析を十分に関与するタンパク質のプルダウンを保証するために、入力ライセートならびに陰性コントロールと連携してこれらのサンプルで使用されるかもしれません。 さらに、細胞を溶解すると、これらのコンポーネントにアクセスする必要があるため、通常は分離されたタンパク質とmRNAの間の異常や望ましくない相互作用の可能性を導入することができる。これらの相互作用は、潜在的に結合し、非特異的な相互作用を介して標的mRNAまたは結合タンパク質を &quot;吸い取る&quot;ことができる。これらの様々な共同でさらに、タンパク質nditionsは、複数のバリエーションで折り畳むことができ、それらの結合モチーフは、それらの相互作用を防止し、それらの標的mRNAへアクセスできなくなる場合があります。これらの両方が効率的に働くだけでなく、これらの不要な相互作用を制限することが記載されている最適な温度を利用することの重要性を強化する。さらに、それぞれの特定の標的タンパク質のための条件を洗浄の最適化は、相互作用の純度を最大化するために重要になるでしょう。より厳格な洗浄条件が必要になることがあります。例えば、洗浄緩衝液を、SDSまたはあなたの信号出力に非特異的な相互作用およびバックグラウンドを低減する尿素の適切な量を補充することができる。これは、実験者のターゲットRBPと同様、独自の生理的条件下で標的mRNAに完全に依存するようになるでしょう。いくつかの条件は、試料の調製に留意すべきである特定のmRNA解析ツールには適していないでしょう。 最後に、RIPは、RNAの濃縮に成功しているものの-RBPの相互作用は、RIP（CHIP）メソッドを使用してよく知られている問題は、一時的なmRNA標的にRBPの特異的結合ドメインを同定することができないことである。いくつかの架橋技術はユニーク配列ターゲットを隔離するためにRIPに続いて使用することができるが、短波長紫外線の使用は、核酸の損傷につながる傾向があります。 PAR-CLIPとして知られている新しいメソッド、または光活性リボ架橋およびimmuoprecipitationは、安定性と過渡両方RNA相互作用からのユニークな結合部位の同定を可能にする新生RNAにチオウリジンを組み込むために長波紫外線を採用しています。 全体的に、RIP-Chipは私たちのグループだけでなく、他の多くの研究グループによってRNA結合タンパク質とその標的mRNAとの間の相互作用を分離して研究するために使用される優れたツールとして確立されている。自然と実際に敏感ですが、この手順を適切に実行するには、最近まで、inaccされているこれらのRNP複合体の単離を、得られます発見と分析のためのessible。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 1 Mジチオスレイトール</td><td>フィッシャー</td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNaseを1 </td><td>アンビオン</td><td> 2235 </td><td> RNaseフリー</td></tr><tr><td> Tetraccetic酸をエチレンジアミン</td><td>フィッシャー</td><td> BP118-500 </td><td> EDTAを</td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>アンビオン</td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td>シグマ</td><td> H3375-100G </td><td> pH 7.0の</td></tr><tr><td> IGEPALノニデットP-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KClを</td><td>フィッシャー</td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2を </td><td>フィッシャー</td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2のバッファ</td><td> *下記を参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリソーム溶解バッファー</td><td> *下記を参照</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>ロッシュ</td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td>プロテインAセファロースビーズ</td><td>シグマ</td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>フィッシャー</td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase阻害剤RNaseのアウト</td><td>インビトロジェン</td><td> 10777-019 </td><td> 40 U /μlの</td></tr><tr><td> 1MのNaCl </td><td>フィッシャー</td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td>の1M Tris-HCl </td><td>フィッシャー</td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH7.4の</td></tr><tr><td>トリゾール</td><td>インビトロジェン</td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td>リボバナジル錯体</td><td>ニューイングランド研究所</td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬精査 </td></tr><tr><td>のRNase / DNaseフリー、DEPC処理したガラス製品の試薬を準備</td></tr><tr><td> ポリソーム溶解バッファー </td></tr><tr><td> 100mMのKCl </td></tr><tr><td> 5mMのMgCl 2 </td></tr><tr><td> 10mMのHEPES（pH7.0）を</td></tr><tr><td> 0.5％NP40 </td></tr><tr><td> 1mMのDTT </td></tr><tr><td> 100単位/ mlのRNaseアウト</td></tr><tr><td> 400μMのVRC </td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td></tr><tr><td> ポリソーム溶解バッファー5mlの </td></tr><tr><td> 1MのHEPES緩衝液（pH7.0）50μlを追加</td></tr><tr><td> 1 M KClの500μlの</td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2を 25μlの</td></tr><tr><td> NP40の25μl </td></tr><tr><td> 4.7ミリリットルのRNase DNaseフリーH 2 O </td></tr><tr><td> 1 MのDTTを50μl </td></tr><tr><td> 100 U / mlのRNase12.5μlのアウト</td></tr><tr><td> 200μlのプロテ​​アーゼ阻害剤カクテル（メーカーによると溶解） </td></tr><tr><td> 10μlの200mMのVRC（使用時） </td></tr><tr><td> NT2のバッファ </td></tr><tr><td> 50mMのトリス-HCl（pH7.4） </td></tr><tr><td> 150mMのNaCl </td></tr><tr><td> 1mMのMgCl 2 </td></tr><tr><td> 0.05パーセントのNP40 </td></tr><tr><td> NT2緩衝液1L </td></tr><tr><td> 50ミリリットルトリス（pH 7.4） </td></tr><tr><td> 30ミリリットルの5 M NaCl </td></tr><tr><td> 1ミリリットルの1M塩化マグネシウム<sub&gt;の2 </td></tr><tr><td> 500μlのNP40 </td></tr><tr><td> 820ミリリットルのRNase DNaseフリーH 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

ハイスループットシーケンシングおよび効率的なマイクロアレイ解析の開発の結果として、全体的な遺伝子発現解析は、データの収集を簡単かつ容易に利用できる形になっています。しかし、多くの研究や疾患モデルでは、標的遺伝子のmRNAの定常状態レベルは常に直接定常状態タンパク質レベルと相関しない。転写後の遺伝子発現制御には、2つの間の相違の可能性のある説明です。 RNA結合タンパク質（RBP）に結合することによって駆動され、転写後調節は、標的mRNAとリボ（RNP）複合体を形成することによりmRNA局在、安定性や翻訳に影響を与えます。 RNP複合体中の細胞抽出物からこれらの未知のde novo mRNA標的を同定することはご理解のメカニズムとRBPの機能とタンパク質の出力にそれらの結果として得られた効果に極めて重要である。このプロトコルは、sの識別を可能にRNPを免疫沈降マイクロアレイRIP（チップ）と呼ばれる方法を概説さらに、個々の研究者のための実験を​​最適化するためのオプションと共にpecific mRNAは、変化の実験条件下で、リボ核タンパク質複合体に関連する。この重要な実験的なツールを使用すると、研究者らは、転写後遺伝子調節だけでなく、他のリボ核相互作用に関連する複雑なメカニズムを探索することができます。

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip at JoV

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

RIP-チップを介したRNA関連した複合体を単離および同定するためのステップバイステップのプロトコル。

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

27.4K ビュー.  University of Missouri. RIP-チップを介したRNA関連した複合体を単離および同定するためのステップバイステップのプロトコル。

ビデオ: Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

生物学

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

特定のエンド - およびエキソグリコシダーゼを用いたタンパク質のグリコシル化の同定と特性評価

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

植物抽出物からの分散粒子の除去のための凝集剤の効率を評価するための手順

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 D ページのナタネから師部 Sap サンプリング

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と同定するための方法