NIH / NIDCDとRPへのシュミット財団の助成金によってサポートされている動作。

このプロトコルは、以前は脳組織1-7に、1つまたは2つの転写産物の種を検出するために私達と他の人によって開発された標準的な放射性および非放射性in situハイブリダイゼーション法をベースに開発し、精製した。以下に記述されているプロトコルは、エンドユーザーによって選択された手続きの中断の数に応じて、2または3日間の合計の長さを持っています。以下に詳述するすべてのステップは、リボプローブのハイブリダイゼーション工程と後のハイブリダイゼーションの洗浄を除いて、室温で実施されるべきである。この方法に関係するすべてのステップのために必要な溶液とバッファーは、このプロトコルの終わりに見つけることができます。 1。組織の準備とセクショニング<ol><li>首を切ると急速に被験者の脳を抽出し、適切なサイズのプラスチック金型に入れてください。 </li><li>ティッシュ- Tek製の包埋媒体と脳をカバーし、急速に急速凍結するためのdry-ice/alcoholバスでプラスチック金型を置きます。凍結組織を-80℃で使用時まで保存することができます。 </li><li>クライオスタットを用いて、荷電Superfrostプラススラ​​イドにスライドあたり2つまたは3つの脳切片を収集する。セクションの厚さは10-12μmのはずです。スライドは、-80℃で使用時まで保存することができます。 </li></ol> 2。プローブの精製のためのセファデックスG50カラムの調製 &quot;セファデックスカラムは商業的供給源から購入することができます、しかし、我々は、プローブの精製のために必要とされる列の生成については、以下の低コストの代替手段を提供しています。 <ol><li>セファデックスG50過剰沈殿にRNaseフリー、DEPC処理水（例えば、DEPC処理水100mlに粉末2g）、室温で混合溶液の簡潔にし、店舗とのセファデックスG50粉体の水和物十分な量。 </li><li>セファデックスG50降水量は、次の（水の上位レイヤ）上清を取り除く。 </li><li> 5回 - 3上記プロセスを繰り返します。 </li><li>最終洗浄後、使用するまで4℃でセファデックスG50 TEバッファー（1:1の比率）のソリューション、およびストア° Cを再サスペンド。 </li><li>場所は、無菌1mlのシリンジにグラスウールをオートクレーブし、下部のコンパクトな層を作るためにプランジャーで圧縮し、次いで15 mlのFalconチューブに注射器を配置。 </li><li>よくTEにおけるセファデックスG50の溶液を混合。この溶液を注射器/列を埋める。 </li><li> 1000rpmで30秒間カラムを遠心する。 </li><li>列がほぼ完全にセファデックスG50ビーズを充填されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li>カラムにカラムの洗浄​​緩衝液200μlを適用し、1000rpmで2分のためにそれを遠心分離。フロースルー捨てる。 </li><li>列に列のブロッキング緩衝液200μlを適用し、1000rpmで2分間、それを回転させる。カラムを平衡化するこのステップ4-5回繰り返します。 ° C使用時までパラフィルムで密封された場合、列は4℃保存することができます。 </li></ol> 3。リボプローブのラベリングと精製我々は詳細に、単一のリボプローブの生成と精製を以下に。 dFISHの場合は、各プローブの調製は、プローブのいずれかがビオチンタグの付いたUTPと他の一方、ジゴキシゲニン（DIG）-タグ付きUTPで標識されることを除いて、同じ方法論が含まれる。 <ol><li>センス（対照）またはアンチセンスリボプローブのいずれかを生成するための関心の集中（&gt; 150 ng /μLの）と精製した線状化したcDNA溶液を調製します。 </li><li> 1.5mlマイクロチューブに、cDNAを鋳型、5倍のプローブの標識バッファーを2μl、10X DIGの1μL（またはビオチン）標識ミックス、RNasin 0.5μlおよび適切なRNAポリメラーゼ1μlを精製の0.5〜1μgを追加する、およびRNaseフリー（DEPC処理）水で10μlの溶液の最終容積をもたらす。 </li><li> 37℃水浴中でソリューション℃で2時間、Cをインキュベートする。 </li><li>ソリューションに、そして列ブロッキングバッファー39μlを、tRNAの1μL（20μg/μLの株式）を追加します。 </li><li>プローブの精製のためのセファデックスG50カラムを準備します。この目的のために、列に50μlのブロッキングバッファーを追加し、1000rpmで10秒間、それを回転させる。 カラムを平衡化するこのステップを2-3回繰り返して（すなわち、列に適用される完全な50μlの遠心分離のサイクル後に回収される）。 </li><li>セファデックスG50カラム、位置、列の一番下に新しいマイクロ遠心チューブにプローブ溶液を適用する、とリボプローブ溶液を精製した50μlを得るために、1000rpmで3分間、それを回転させる。 </li><li>どちらかの標準的なホルムアルデヒド - アガロースRNAゲル、または分光光度計を用いて標識リボプローブの品質と収量を評価する。 </li></ol> 4。後固定、アセチル化とハイブリダイゼーション<ol><li> -80℃の冷凍庫からセクションを削除し、平衡化は室温を可能にする。その後、5分間コールド、たての3％パラホルムアルデヒド溶液で切片をインキュベートします。 </li><li>簡単に言うとPのセクションをすすぐhosphateは二回（PBS）緩衝生理食塩水。 </li><li>標準的なアルコール系（70、95、および100％、2分ごと）を通してのセクションを脱水し、空気乾燥してみましょう。 </li><li> 10分間アセチル化溶液中でのセクションをインキュベートする。 </li><li> 2X SSPEのセクションを3回すすいでください。 </li><li>標準的なアルコール系上記を通じて再びセクションを脱水し、それらを空気乾燥することができます。 </li><li>ハイブリダイゼーション溶液の適切な量を準備して、溶液（プローブ濃度：各プローブに対しては1 ng /μL）に、両方のリボプローブを追加します。ハイブリダイゼーション溶液の総体積がハイブリダイズするセクション（セクションごとのハイブリダイゼーション溶液の16μlの）の数に基づいて決定されます。 </li><li>無気泡オーバーレイという組織を確実に組織し、カバースリップのスライドへのハイブリダイゼーション溶液の十分な量を適用します。 </li><li>金属製のスライドホルダーにス​​ライドを配置。 65で設定されたミネラルオイルバスに浸し、ホルダー℃で一晩。カバースリップが（すなわち、スライドホルダーの外側面は鉱物油の容器の底部に接触するはず）を上に向けられていることを確認します。 </li></ol> 5。ポストハイブリダイゼーションの洗浄<ol><li>翌日、慎重にミネラルオイルバスからスライドホルダーを削除し、簡単にスライドから余分な油を除去するためにクロロホルムでそれを洗う。 </li><li>場所は、5〜10分間2X SSPE溶液中でスライドします。カバースリップは、溶液中の中のスライドからデタッチする必要があります。 </li><li>新しい2X SSPEのソリューションにスライドを移し、室温で1時間のためにそれらを保つ。 </li><li> 2X SSPEプラス50％ホルムアミドを含む溶液にセクションを移す。この溶液の温度は、一晩ハイブリダイゼーション手順において使用される温度と一致する必要があります。 1.5時間この溶液中でスライドしてください。 </li><li> 0.1 × SSPEソリューションハイブリダイゼーション工程の同じ温度に予め温めておいたためにセクションを転送します。 30分間この溶液中でのセクションをインキュベートする。さらに30分ごとにこの手順を繰り返します。 </li></ol> 6。リボプローブの検出と可視化<ol><li> 0.3％過酸化水素を10分間、添加されたTNTバッファーにスライドを移し。 </li><li> TNTバッファー、3回（10分ごと）でセクションを洗ってください。 </li><li> DAKOのペンを使用して、脳のセクションを含む領域の周囲に井戸を描く。重要なことに、注意はそのセクションが乾燥しないように行使する必要があります。 </li><li>各スライドにTNBバッファー150μlのを適用し、湿度の高い室で、30分間この溶液中でのセクションをインキュベートする。 </li><li>傾斜スライドで過剰TNBのソリューションを取り外します。 </li><li> 2時間多湿のチャンバー内でペルオキシダーゼ標識抗DIG抗体、および店舗のスライドを含むTNBの水溶液150μlを適用します。抗体濃度は、前dFISHを行うために関心の各転写産物に対して個別に決定されるべきである。 </li><li> 3回、10分ごとに、TNTバッファー内のセクションを洗ってください。 </li><li>各スライドにアレクサ594 -共役チラミドワーキング溶液150μlを塗布し、1時間多湿のチャンバー内に保存してください。このソリューションは、製造者の指示に従って準備する必要があります。 </li><li> 3回、10分ごとに、TNTバッファー内のセクションを洗ってください。 </li><li> 30分 - 0.3％過酸化水素を10分間添加したTNTバッファー内のセクションをインキュベートする。 </li><li> 3回、10分ごとに、TNTバッファー内のセクションを洗ってください。 </li><li>スライドあたりのTNBバッファー150μlのを適用し、30分間湿潤なチャンバーに保管してください。 </li><li>傾斜スライドで過剰TNBのソリューションを取り外します。 </li><li> 2時間多湿のチャンバー内でペルオキシダーゼ結合抗ビオチン抗体、および店舗のスライドを含むTNBの水溶液150μlを加え。 </li><li> 3回、10分ごとに、TNTバッファー内のセクションを洗ってください。 </li><li>アレクサの150μlの488標識スライドと1時間インキュベートするセクションへチラミド実用的なソリューションを適用します。このソリューションは、製造業者の推奨に従って準備する必要があります。 </li><li> 3回、10分ごとに、TNTバッファー内のセクションを洗ってください。 </li><li>セクションにヘキスト溶液（TNTバッファーで1:1000）150μlを加え、2分間多湿の室に保管してください。 </li><li> TNTバッファー内のセクションを洗って、3回、各5分間。 </li><li>蛍光互換マウント培地（例えば、Vectashieldや褪色を褪色）付きカバースリップのセクション。 </li></ol> 7。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="図1" /> 図1ここでは、キンカチョウの脳で得られた代表的なdFISHの結果を示す。示さcaudomedial nidopallium（NCM）、哺乳類の聴覚皮質の鳴き鳥のアナログから得られた顕微鏡写真である。脳切片は、パルブアルブミン（A）、抑制性ニューロンの亜集団のマーカーに対して向けられたビオチン化リボプローブとハイブリダイズし、リボDIG -標識したプローブは、活動依存的遺伝子zenk（B）、曲駆動型ニューロンのための信頼できるマーカーに対して向け。 C）のオーバーレイ（）と（B）は、聴覚経験によって活性化される抑制性ニューロンの人口を示しています。矢印と矢印の2つのリボプローブのそれぞれに排他的に標識された細胞を表し、アスタリスクは、代表的なニューロンの興味の両方の成績証明書を共発現​​を示す。バー=25μmのスケール。

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利害の衝突は宣言されません。

我々は、脊椎動物の脳がneurochemicallyと機能的に編成されているか研究し、そしてどのように行動に関連した感覚刺激の影響成人の脳の8-10の神経細胞のゲノム機械かを判断するためにこのプロトコルを使用している。我々は正常マウス、ラット、鳴禽類の脳組織でこのメソッドを使用していましたが、このプロトコルは、脊椎動物種の配列と、おそらく、非神経組織から得られた脳切?...

ソリューション<ol><li>カラムの洗浄​​バッファー：50ミリリットルDEPC処理水に10mMトリス- HCl、0.15 MのNaCl、0.05mMのEDTA、50μg/μLのtRNAは、0.1％SDS。 </li><li>列ブロッキングバッファー：50ミリリットルDEPC処理水に10mMトリス- HCl、50mMのNaCl、0.1mMのEDTA。 </li><li> TNTバッファー：1 Mトリス塩酸60mlを、5 M NaClを18 mlのDEPC処理水600mlのトリトンX - 100の1.8ミリリットル。 </li><li> TNBバッファー：100mMトリス- HCl、8.3μg/μLのBSA、0.15 MのNaClおよび3％トリトンDEPC処理水でX - 100。 </li><li> TEバッファー：10mMトリス- HCl、pH7.5のプラス1 mMのEDTA、pH7.5の。 </li><li>アセチル化のソリューション：トリエタノールアミンプラスDEPC処理水200mlの無水酢酸を0.5mlの2.7ミリリットル。 </li><li>ハイブリダイゼーション溶液：50％ホルムアミド、2X SSPE、2μg/μLのtRNAは、1μg/μLのBSAおよび1μgの/ DEPC処理水に添加ポリ。それは、セクションごとに16リットルが必要です。 </li></ol>

double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections

ここでは、二重蛍光の修正版を説明<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（dFISH）メソッドでは、新鮮凍結脳切片における関心のある2 mRNAを検出するために最適化。当社グループは、正常遺伝子の共同規制を研究するためにこのアプローチを使用しています。具体的には、我々は単一細胞の解像度で、解剖学的組織、神経化学的特性、および中央の感覚回路の感覚経験の影響を調べるためにこのdFISHのメソッドを使用している。このプロトコルは、マウス、ラット、鳴禽類の脳組織で検証されていますが、非神経組織の配列にだけでなく、他の脊椎動物種に容易に適用可能であることを期待されている。この映画では、この手順の主なステップの詳細なデモンストレーションを提供しています。

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Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

このプロトコルは、非放射性の関係<em&gt;その場</em脊椎動物の脳の薄片で、単一セルの解像度で、二つの転写産物の種の同時同定を可能にする&gt;ハイブリダイゼーション手順。

二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

16.0K ビュー.  University of Rochester. このプロトコルは、非放射性の関係その場ハイブリダイゼーション手順。

ビデオ: Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

神経科学

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

小動物の慢性神経録音用超軽量電動マイクロドライブの設計およびアセンブリ

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em&gt;その場で</em&gt;幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

ラピッド<em&gt;その場で</emセロトニン症候群のラットのパラホルムアルデヒド接頭辞脳にオリゴヌクレオチドプローブを使用して&gt;ハイブリダイゼーション

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在<em&gt;現場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

マルチプレックス蛍光 In Situ ハイブリダイゼーションと蛍光免疫組織化学の融合による新鮮、凍結、または固定マウスの脳切片の結合(英語)

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

エコHIV脳感染症のラットモデル

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular characterization. Fluorescence-activated nuclei sorting (FANS) can be used to successfully isolate and study human neuronal nuclei (NeuN+) populations from frozen archival tissue, thereby avoiding problems associated with handling&#160;fresh tissue. However, efforts to similarly isolate astroglia from the non-neuronal (NeuN-) element are lacking. A recently developed and validated immunotagging strategy uses three transcription factor antibodies to simultaneously isolate enriched neuronal (NeuN+), astrocyte (paired box protein 6 (PAX6)+NeuN-), and oligodendrocyte progenitor (OLIG2+NeuN-) nuclei populations from non-diseased, fresh (unfixed) snap-frozen&#160;postmortem human temporal neocortex tissue.
This technique was shown to be useful for the characterization of cell type-specific transcriptome alterations in primary pathological epilepsy neocortex. Transcriptomic analyses confirmed that PAX6+NeuN- sorted populations are robustly enriched for pan-astrocyte markers and capture astrocytes in both resting and reactive conditions. This paper describes the FANS methodology for the isolation of astrocyte-enriched nuclei populations from fresh-frozen human cortex, including tissue dissociation into single-nucleus (sn) suspension; immunotagging of nuclei with anti-NeuN and anti-PAX6 fluorescently conjugated antibodies; FANS gating strategies and quality control metrics for optimizing sensitivity and specificity during sorting and for confirming astrocyte enrichment; and recommended procurement for downstream transcriptome and chromatin accessibility sequencing at bulk or sn resolution. This protocol is applicable for non-necrotic, fresh-frozen, human cortical specimens with various pathologies and recommended postmortem tissue collection within 24 h.

We have developed a method that enriches for and isolates human astrocyte populations from fresh-frozen tissue for use in downstream molecular analyses.

二重蛍光その場でハイブリダイゼーション