このプロトコルは、蛍光RNAscopeのin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学を、新鮮凍結または固定脳製剤を使用して組み合わせたものです。この技術は、同じ組織標本中のRNAとタンパク質の標的を空間的に可視化するための高感度のin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学法の組み合わせを実証することにより、柔軟性を可能にします。この手法は、脳組織切片のマルチプレックスラベリングに適用でき、神経科学における不均一な神経集団内のmRNAおよびタンパク質の空間的構成と機能的意義の調査に役立ちます。
このプロトコルは、主に新鮮凍結組織およびパラホルムアルデヒド固定組織の処理手順に焦点を当てています。凍結したばかりの脳組織の切片化を開始するには、事前に冷却したクライオスタットチャックに取り付け、14マイクロメートルの厚さの冠状切片を切断します。切片を荷電ガラス顕微鏡スライドに取り付けます。
取り付けたスライドをスライドボックスに移します。次に、箱をドライアイスで摂氏マイナス80度の冷凍庫に輸送します。組織固定のために、調製したパラホルムアルデヒド溶液を濾過する。
摂氏4度に冷やします。取り付けられたスライドをマイナス80°Cの冷凍庫からドライアイスに移し、すぐに冷やしたパラホルムアルデヒド溶液に15分間浸し、 新鮮凍結した組織の脱水を行い、スライドガラスが完全に乾燥していることを確認します。経心溶融固定マウントから脳を取り出した後、振動ミクロトームを使用して、厚さ30マイクロメートルの組織切片を切断します。
切断した切片を凍結保護液に保管します。FISHアッセイ当日に、フリーフローティング切片を0.1モルPBSを含む12ウェル細胞培養プレートに移し、回転プラットフォームシェーカーで90〜100RPMで攪拌して凍結保護剤を洗い流します。次に、絵筆を使用して、洗浄中の剥離を防ぐためにガラス顕微鏡スライドに切片を平らに取り付け、少なくとも2時間風乾します。
疎水性バリアペンを使用して、切片の周囲に疎水性バリアを描き、FISH試薬を封じ込めます。前処理に続いて、組織をプロテアーゼ溶液中でインキュベートし、メーカーのガイドラインに従ってRNAscopeプローブと2時間ハイブリダイズします。その後、逐次増幅工程および蛍光免疫組織化学検査を行う。
まず、スライドをインキュベートするための加湿された光保護チャンバーを準備します。ウォーターバスで、50X洗浄バッファーとプローブを摂氏40度に10分間温めます。室温まで冷却したら、50倍のストック濃度から1X洗浄バッファー1リットルを調製します。
テキスト原稿に記載されているようにプローブ混合物を調製します。プロテイナーゼ処理では、プロテイナーゼ3を組織切片に添加し、室温で30分間インキュベートします。プロテイナーゼを洗い流すには、室温で0.1モルのPBSにスライドを静かに浸し、切片が剥がれないようにします。
ハイブリダイゼーションのために、プローブ混合物を組織切片に添加する。加湿した予熱したチャンバーに入れます。その後、摂氏40度で2時間インキュベートします。
洗浄バッファーで組織切片を2回、2分間すすぎます。シグナル増幅には、スポイトボトルを使用して、組織切片を覆うように増幅溶液を添加し、本文に記載されているようにインキュベートします。ブロッキング溶液を組織切片に加え、室温で1時間インキュベートして、非特異的結合を防ぎます。
スライドをフリックして、インキュベーション後に余分なブロッキングバッファーを除去します。次に、一次抗体で切片を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、スライドを1X TBSで3回洗浄します。
二次抗体を添加し、切片を室温で2時間インキュベートします。カメラ付きの落射蛍光顕微鏡でスライドを調べます。代表的な画像を20倍の倍率で取得し、TIFファイルとして保存します。
本研究では、DAPI標識の不在により、組織の品質、完全性、および細菌汚染の不在が確認されました。ユビキチンC、ペプチジルプロリルイソメラーゼB、およびRNAポリメラーゼIIA mRNAを標的とするポジティブコントロールプローブからの標識により、RNAの完全性が確認されました。NTS内のGalR1 mRNA陽性ニューロンを区別するための新鮮凍結調製物では、追加の神経化学的マーカーを使用しました。
膜結合型小胞トランスポーターは明確に標識された。対照的に、PHOX2Bプロモーターの制御下で発現するチロシンヒドロキシラーゼやGFPなどの細胞質タンパク質は、かすかに観察され、明確な輪郭を欠いているため、綿状であると説明されました。細胞質GalR1 mRNAのGalR1 FISHプローブ標識は点状で、明瞭に観察された。
免疫組織化学の質がタンパク質の細胞内局在に依存することを確認するために、異なる核タンパク質および細胞質タンパク質を同じ組織切片のFISHと並行して標識しました。細胞質のPHOX2B GFPは綿状の外観を呈していた。一方、核のPHOX2Bタンパク質シグナルは明瞭であり、FISHと組み合わせると、より質の高い免疫標識が確認されました。
固定凍結切片をFISHと併用して実施した場合、免疫組織化学は細胞内局在に関係なく信頼性が高かった。GlyT2 mRNA陽性ニューロンは、NTS内ではなく、NTSの腹側に位置していました。GlyT2 mRNA陽性ニューロンとPHOX2B mRNA陽性ニューロンは共局在しなかった。
PHOX2B mRNA陽性NTSニューロンの亜集団はチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性であり、GlyT2 mRNAを含有するものはなかった。RNAscopeは、細胞や組織におけるRNA分布を1分子分解能で可視化し、解析することができます。新しいRNA種、疾患メカニズム、遺伝子発現パターン、ニューロンの多様性、細胞間相互作用の研究を強化します。
