NIH / NIDCD 및 RP에 슈미트 재단의 보조금에 의해 지원 작동합니다.

이 프로토콜은 이전에 뇌 조직 1-7에 하나 또는 두 개의 사본 수종을 감지하는 우리와 다른 사람에 의해 개발된 표준 방사선이 아닌 방사선 원위치 하이브리드화 방법에 따라 개발 및 정제되었다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 최종 사용자가 선택한 절차 중단의 수에 따라 2 ~ 3 일 총 길이있다. 아래의 자세한 모든 단계가 riboprobe의 하이브리드화 단계 및 사후 하이브 리다이 제이션 세척을 제외하고, 상온에서 실시하는 것입니다. 이 방법에 관련된 모든 단계에 필요한 솔루션 및 버퍼는이 프로토콜의 끝 부분에서 찾을 수 있습니다. 1. 조직 준비 및 Sectioning <ol><li> 참살 빠르게 주제의 두뇌를 추출하고, 적절한 크기의 플라스틱 금형에 넣습니다. </li><li> 조직 테크의 포함 매체와 두뇌를 커버하고 빠르게 빠른 냉동 dry-ice/alcohol 목욕탕에서 플라스틱 금형을 놓으십시오. 냉동 조직은 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다. </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여 청구 Superfrost 플러스 슬라이드에 슬라이드 당 2 ~ 3 두뇌 섹션을 수집합니다. 섹션의 두께는 10-12 μm의해야합니다. 슬라이드는 -80 ° C에서 사용까지 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 프로브 정제에 대한 Sephadex G50 열 준비 &quot;Sephadex 컬럼이 상용 소스에서 구입할 수 있지만, 우리는 프로브 정화를 위해 필요합니다 컬럼의 생성을 위해 아래 저가의 대안을 제공합니다. <ol><li> 상온에서 RNase 무료, DEPC - 처리된 물 (예를 들어, DEPC - 처리된 물 100 ML에 분말 2g), 혼합 솔루션 간략하고 저장과 Sephadex G50 분말의 하이드 레이트 적절한 금액 초과 Sephadex G50을 촉진합니다. </li><li> Sephadex G50 강수량 다음 (물을 상위 계층) 뜨는 제거합니다. </li><li> 5 회 - 3 위의 과정을 반복합니다. </li><li> 최종 세척 후 사용까지 4 Sephadex G50 TE 버퍼 (1:1 비율)에 솔루션 및 저장 ° C를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 이곳은 살균 한 ML 주사기로 글라스 울을 autoclaved하고 하단에 소형 레이어를 만들기 위해 플런저로 압축하고 15 ML 팔콘 튜브에 주사기를 놓습니다. </li><li> 잘 TE에 Sephadex G50의 솔루션을 섞는다. 이 솔루션과 함께 주사기 / 열을 채웁니다. </li><li> 1,000 rpm으로 30 초에 대한 컬럼을 원심 분리기. </li><li> 칼럼이 거의 Sephadex G50 비즈 가득 때까지이 절차를 반복합니다. </li><li> 그 결과 해당 컬럼에 대한 컬럼 세척 버퍼 200 μl를 적용하고 1000 rpm으로 2 분을 위해 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 그 결과 해당 컬럼에 대한 열의 차단 버퍼 200 μl를 적용하고 1000 rpm으로 2 분을 위해 스핀. 열 평형이 단계 4-5 번 반복합니다. ° C까지 사용 Parafilm와 봉인하면 열이 4 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. Riboprobes의 라벨링 및 정제 우리가 상세 한 riboprobe의 생성 및 정화를 아래. dFISH 각 프로브의 준비 프로브 중 하나가 비오틴 - 태그 UTP와 다른 반면 digoxigenin (발굴) 태그 UTP이 표시됩니다 것을 제외하고, 동일한 방법론을 포함합니다. <ol><li> 감각 (제어) 또는 안티 센스 riboprobes 중 하나를 생성하는 관심 집중 (&gt; 150 NG / μl)와 정화 선형 cDNA 솔루션을 준비합니다. </li><li> 1.5 ML의 microfuge 관에서 cDNA 템플릿, 배 프로브 라벨링 버퍼 2 μl, 10X 파다 1 μl (또는 비오틴) - 라벨 믹스, RNasin 0.5 μl하고 적절한 RNA 효소 1 μl를 정화의 0.5-1 μg을 추가 그리고 RNAse없는 (DEPC - 처리) 물 10 μl로 솔루션의 최종 볼륨을 가지고. </li><li> 37 물 목욕에있는 솔루션 ° 2 시간 C를 품어. </li><li> 솔루션 및 열 차단 버퍼 39 μl, tRNA 1 μl (20 μg / μl 주식)를 추가합니다. </li><li> 프로브 정화를위한 Sephadex G50 컬럼을 준비합니다. 이를 위해, 열 50 μl 차단 버퍼를 추가하고 1,000 rpm으로 10 초을 위해 스핀. 열 (즉, 그 결과 해당 컬럼에 적용되는 전체 50 μl가 원심 분리의 사이클 이후에 회복된다) 평형이 단계에게 2-3 번 반복합니다. </li><li> Sephadex G50 칼럼, 위치 칼럼의 하단에 새로운 microfuge 튜브에 프로브 솔루션을 적용하고, riboprobe 솔루션의 정화 50 μl를 얻기 위해 1,000 rpm으로 3 분을 위해 스핀. </li><li> 중 표준 포름 알데히드 - 아가로 오스 겔 RNA, 또는 분광 광도계를 사용하여 레이블 riboprobe의 품질 및 수율을 평가합니다. </li></ol> 4. 포스트 - 고정, 아세틸화 및 하이브리드화 <ol><li> -80 ° C의 냉장고에서 섹션을 제거하고 평형에 실내 온도에 대한 허용합니다. 그 후, 5 분 추위, 갓 만들어진 3 % paraformaldehyde 솔루션 섹션을 품어. </li><li> 간략 P의 부분을 씻어hosphate 두 번 호수 (PBS)를 버퍼. </li><li> 표준 알코올 시리즈 (70, 95, 및 100 %, 2 분마다)를 통해 섹션을 탈수하고, 그들이 공기 건조하게. </li><li> 10 분 아세틸화 솔루션 섹션을 품어. </li><li> 2X SSPE에 섹션 3 번 린스. </li><li> 표준 알코올 시리즈 위에서 설명한을 통해 다시 한번 섹션을 탈수하고, 그들이 공기 건조 수 있습니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 솔루션의 적절한 볼륨을 준비하고 솔루션 (프로브 농도 : 각 프로브 1 NG / μl)를 모두 riboprobes를 추가합니다. 하이브 리다이 제이션 솔루션의 총 부피는 (섹션당 하이브 리다이 제이션 용액 16 μl) hybridized 수 섹션의 개수에 따라 결정됩니다. </li><li> 그 공기 방울 오버레이에게 조직을 보장하지 조직 및 coverslip 슬라이드에 하이브 리다이 제이션 솔루션의 적절한 볼륨을 적용합니다. </li><li> 이곳은 금속 슬라이드 홀더에 슬라이드. 미네랄 오일 욕조에 담가 소유자 ° C 야간 65으로 설정합니다. 그 coverslips (즉, 슬라이드 소유자의 측면은 미네랄 오일 컨테이너의 하단에 접촉해야합니다) 위쪽으로 직면하고 있는지 확인합니다. </li></ol> 5. 포스트 하이브 리다이 제이션 씻는다 <ol><li> 다음날, 조심스럽게 미네랄 오일 목욕에서 슬라이드 홀더를 제거하고 간단히 슬라이드에서 여분의 기름을 제거하기 위해 클로로포름에 린스. </li><li> 플레이스 5-10 분 2X SSPE 솔루션 슬라이드. Coverslips은 용액 중에 슬라이드에서 분리해야합니다. </li><li> 새로운 2X SSPE 솔루션에 슬라이드를 전송하고, 실온에서 1 시간 그들을 유지. </li><li> 2X SSPE 플러스 50 %의 포름 아미드를 포함하는 솔루션으로 섹션을 전송합니다. 이 솔루션의 온도는 야간 하이브 리다이 제이션 절차에 사용되는 온도를 일치해야합니다. 1.5 시간이 용액에 슬라이드를 유지. </li><li> 0.1X SSPE 솔루션 하이브리드화 단계의 동일한 온도로 미리 예열 섹션을 전송합니다. 30 분이 솔루션 섹션을 품어. 추가 30 분에 대해이 단계를 반복합니다. </li></ol> 6. Riboprobes의 감지 및 시각화 <ol><li> 어느하기 위해 0.3 % 과산화수소가 10 분 동안 추가되었습니다 TNT 버퍼에 슬라이드를 전송합니다. </li><li> TNT 버퍼, 3 회 (각 10 분)에 섹션을 씻으십시오. </li><li> DAKO 펜 사용하여 두뇌 섹션을 포함하는 주변 잘 그려. 중요한주의는 해당 섹션 건조하지 않도록하기 위해 행사되어야합니다. </li><li> 각 슬라이드에 TNB 버퍼 150 μl를 적용하고, 습기 챔버에서 30 분이 솔루션 섹션을 품어. </li><li> 틸팅 슬라이드로 초과 TNB 솔루션을 제거합니다. </li><li> 2 시간의 습기가 실내에 퍼옥시데이즈 - 복합 백신 발굴 항체 및 저장 슬라이드가 포함된 TNB 솔루션 150 μl을 적용합니다. 항체 농도 전에 dFISH을 수행하기 위해 관심의 각 사본에 대해 개별적으로 결정되어야합니다. </li><li> TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각. </li><li> 알렉사 각 슬라이드 594 - 복합 tyramide 작업 솔루션을 150 μl를 적용하고, 1 시간에 습기 챔버에 저장합니다. 이 솔루션은 제조 업체의 지시에 따라 준비되어야합니다. </li><li> TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각. </li><li> 30 분 - TNT 버퍼에 품어 섹션 어느 위해 0.3 % 과산화수소 10에 추가되었습니다. </li><li> TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각. </li><li> 슬라이드 당 TNB 버퍼 150 μl를 적용하고, 30 분 습한 실내에 보관하십시오. </li><li> 틸팅 슬라이드로 초과 TNB 솔루션을 제거합니다. </li><li> 2 시간의 습기가 실내에 퍼옥시데이즈 - 복합 안티 - 비오틴 항체 및 저장 슬라이드가 포함된 TNB 솔루션 150 μl를 추가합니다. </li><li> TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각. </li><li> 알렉사 150 μl 488 - 복합 슬라이드 1 시간을 위해 품어 섹션 tyramide 작업 솔루션을 적용합니다. 이 솔루션은 제조 업체의 권고에 따라 준비되어야합니다. </li><li> TNT 버퍼 부분을 씻어, 3 회, 10 분 각각. </li><li> 섹션 Hoechst 솔루션 (TNT 버퍼에 1:1000) 150 μl를 추가 2 분 습한 챔버에 보관하십시오. </li><li> TNT 버퍼에 섹션을 씻어, 3 회, 5 분마다. </li><li> 형광 호환 설치 매체 (예 : Vectashield 또는 antifade을 연장)와 Coverslip 섹션. </li></ol> 7. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 우리는 여기 얼룩말 핀치 두뇌에서 얻은 대표 dFISH 결과를 보여줍니다. caudomedial nidopallium (NCM), 포유류의 청각 피질의 송버드 아날로그에서 얻은 photomicrographs 있습니다 표시됩니다. 뇌 섹션은 parvalbumin (A), 억제 신경의 하위 인구 마커에 대한 감독 biotinylated riboprobe와 hybridized 및 ribo 파고 - 라벨이 붙지만탐사선이 활동에 의존 유전자 zenk (B), 노래 위주의 뉴런에 안정적인 마커에 대한 감독. (A)와 (B) 청각 경험에 의해 활성화됩니다 억제 뉴런의 인구를 보여줍니다의 C) 중첩. 화살표와 화살촉이 두 riboprobes의 각 독점적으로 표시된 셀을 표시하고, 별표 관심의 두 사본을 공동 표현 대표 뉴런을 보여줍니다. 스케일 바 = 25 μm의.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 척추 두뇌가 neurochemically 및 기능 구성 방법 연구, 어떻게 behaviorally - 관련 감각 자극에 미치는 영향 성인 뇌 8-10에서 뉴런의 게놈 기기 확인하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 우리는 성공적으로 마우스, 쥐 그리고 노래하는 새는에서 뇌 조직에서이 방법을 사용하지만,이 프로토콜은 척추 동물의 배열, 그리고 아마도이 아닌 신경 조직에서 얻은 뇌 부분에 쉽게 적용할 수?...

솔루션 <ol><li> 칼럼 세척 버퍼 : 50 ML DEPC - 처리된 물 10 MM 트리스 - HCL, 0.15 M NaCl, 0.05 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 50 μg / μl tRNA, 0.1 % SDS. </li><li> 열 차단 버퍼 : 50 ML DEPC - 처리된 물 10 MM 트리스 - HCL, 50 MM NaCl, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). </li><li> TNT 버퍼 : 60 ML 1 M 트리스 - HCL, 5 M NaCl 18 ML과 트리톤의 1.8 ML DEPC - 처리된 물 600 ML에서 X - 100. </li><li> TNB 버퍼 : 100 MM 트리스 - HCL, 8.3 μg / μl BSA, 0.15 M NaCl 3 % 트리톤 DEPC - 처리된 물에 X - 100. </li><li> TE 버퍼 : 10 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5 플러스 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.5. </li><li> 아세틸화 솔루션 : triethanolamine 플러스 DEPC - 처리된 물 200 ML에 아세트산 무수물 0.5 ML의 2.7 ML. </li><li> 하이브 리다이 제이션 솔루션 : 50 % 포름 아미드, 2X SSPE, 2 μg / μl tRNA, 1 μg / μl BSA 및 1 μg / DEPC - 처리된 물에 μl 폴리. 이 섹션마다 16리터이 필요합니다. </li></ol>

double fluorescence in situ hybridization in fresh brain sections

여기서 우리는 두 형광의 수정된 버전을 설명<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브 리다이 제이션 (dFISH) 메소드 신선한 냉동 뇌 부분에 대한 관심의 두 mRNAs 검출에 최적화된. 우리 그룹은 성공적으로 유전자 공동 규제를 공부하기 위해이 방법을 사용하고 있습니다. 더 구체적으로, 우리는 단세포 해상도의 해부 조직 neurochemical 특성, 및 중앙 감각 회로의 감각적 경험의 영향을 탐험이 dFISH 방법을 사용했습니다. 이 프로토콜은 쥐, 쥐 및 노래하는 새는에서 뇌 조직에서 검증된되었지만 쉽게 다른 척추 종 적용할뿐만 아니라 이외의 신경 조직의 배열로 될 예정입니다. 이 영화에서 우리는이 절차의 주요 단계에 대한 자세한 데모를 제공합니다.

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Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

이 프로토콜은 아닌 방사성을 포함<em&gt; 원위치</em척추 두뇌의 얇은 부분에서, 단일 셀 해상도로 두 사본 종의 동시 확인 가능&gt; 하이브 리다이 제이션 절차.

더블 형광 현장에서</em신선한 두뇌 섹션> 하이브 리다이 제이션

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

15.9K 조회수.  University of Rochester. 이 프로토콜은 아닌 방사성을 포함 원위치 하이브 리다이 제이션 절차.

더블 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션