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論理的根拠 80量体のサーモ科学Dharmaconオリゴ、50の使用を悪用し、ここでは、我々は、オリゴが標的染色体DNAにアニーリング以下、酵母細胞のゲノムDNAに遺伝情報を転送できることによって、遺伝子補正アッセイに基づいて、手順を示します。オリゴが標的の成功は予想される表現型を表示する酵母のコロニーの出現によって得点が記録されます。所望の遺伝子改変はオリゴ配列に組み込まつまたは複数のヌクレオチドの中に運ばれている場合、遺伝情報は、ターゲットプロセス中に染色体レベルでは、このように、染色体の標的DNAへのRNAの消化管から直接RNA / DNAハイブリッド形態を流れる。サーモ科学Dharmacon RNA含有オリゴリボヌクレオチド/秒は、DNA修復合成を介して遺伝子ターゲティングのためのテンプレートとして機能することができますまたはDNAに埋め込むことができ、DNA複製中にテンプレートとして機能する。これらの実験では、酵母/ 出芽酵母 /真核生物のモデル系を使用しますが、同様のアプローチは、他の生物や細胞型にも応用することができます。このビデオでは、我々はターゲットの酵母のゲノムの遺伝子座に相同で設計され、標的遺伝子の変異を修正するには真中の1リボヌクレオチドを​​含むサーモ科学Dharmaconオリゴを使用してください。 RNAを含むオリゴによる形質転換後、我々は、オリゴのRNA管が染色体DNAに組み込まれ、DNA複製時のDNA合成のテンプレートとして機能することができることを示す特定の周波数で標的部位の補正を観察。 RNA気道内に運ば遺伝情報を安定的に次のセルの世代に伝えられる。ここでは、染色体DNA中に転送するRNAの情報を検出するためにサーモ科学Dharmacon RNA含有オリゴとアプローチによって、酵母細胞の形質転換の手順を説明します。 この実験で使用されているRNAを含むオリゴのA.デザイン我々は、酵母の遺伝的欠陥を修正するRNAを含むオリゴを設計しているS. trp5遺伝子座での出芽酵母染色体DNA。プロトコルで使用されている酵母菌株は、2塩基欠失一ナンセンス変異（図1A）を持つ変異体trp5遺伝子が含まれています。このような酵母株はトリプトファン要求性変異体であるとトリプトファンせずにメディア上でコロニーを形成しない。 TRP5遺伝子のDNA配列は、サッカロミセス属ゲノムデータベース（http://www.yeastgenome.org/~~V）で入手可能です。このプロトコルで使用されているサーモ科学Dharmacon RNA含有オリゴは、欠失変異とtrp5対立遺伝子（図1A）のナンセンス変異を修正するために設計された1つリボヌクレオチドを修正するために設計された2塩基のDNAの挿入、は65 - merのです。オリゴのシーケンスは次のように設計されています。 5&#39; - AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG - CG - GATCCCACATTCTG - RG - GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT。このオリゴは、200nmのスケールでサーモ科学Dharmacon（ラファイエット、CO）により合成され、そして脱塩され、脱保護し、PAGE精製せずに使用。 酵母のトランスフォーメーションのためのRNAを含むオリゴ（Storici らから変更。、2007年）のB.の準備<ol><li>すべての開始前に潜在的なRNaseのコンタミを除去するためのRNase除染液と捜査官が着用しているオリゴチューブ、ピペット、渦、ラック、実験エリアと手袋などの実験に使用される材料を拭きます。すべてのステップでRNaseフリー水、化学試薬、チューブやピペットチップを使用してください。この実験ではすべてのステップでは、RNaseフリーにする必要があります。 </li><li>サーモ科学Dharmacon RNA含有オリゴは、会社から250ピコモル/ RNaseフリー水とペレットを溶解するために精力的に渦を持つμlのストック溶液に、受信した懸濁します。 -80℃で保存する</li><li>すぐに変換する前に、氷上でRNAを含むオリゴを解凍し、RNaseフリーのチューブのRNaseフリー水を50ピコモル/μlに希釈する。各変換には、RNAを含むオリゴの1ナノモルが必要です。 </li><li>オリゴの二次構造を除去するために2分間100℃のヒートブロック上のRNAを含むオリゴの選択された量の変性。 </li><li>すぐに変性した後、チューブを氷上に置きます。変換まで氷上で保管してください。 </li><li>実験のコントロールとして対応するDNAは、専用のオリゴが使用されます。このオリゴは、上記のように、-20℃から融解し、RNAを含むオリゴなどの変換用に準備されています。 </li></ol> RNA含有オリゴを用いて酵母のC.変換<ol><li> trp5変異酵母細胞と豊富なYPD液体培地5mlに接種し、30℃で一晩（参照物質）で成長する。 </li><li> YPD液体培地50mlに一晩培養液1.5 mlを。 </li><li> 4時間、30℃でシェーカー（225 rpmの）で細胞をインキュベート。 </li><li>解決策1と解決策2 IMMを準備ediately RNaseフリーチューブの変換の前に（資料を参照してください）​​。 </li><li> 50ミリリットルのRNaseフリーのチューブと2分間1562グラムに相当する3000回転、、でスピンして細胞培養を転送します。細胞の降水量のペレットは約です。 0.3センチメートル3。 </li><li>上清を除去し、2分間3000rpmでRNaseフリー水とスピンの50mlで細胞を洗浄。 </li><li>可能な限り培地に存在する可能性がある培地とのRNaseを取り除くために5回ごとに手順6を繰り返します。 </li><li>解決策1と2分間3000rpmでスピン5mlに上清と再懸セルを削除します。 </li><li>ソリューション1の250μlの上清と再懸セルを削除します。細胞のこの量は7-8に変換するのに十分です。 </li><li> RNaseフリーのマイクロチューブに細胞懸濁液のアリコート50μlを、RNAを含むオリゴワーキング溶液（1ナノモル）、またはDNAのみのオリゴワーキング溶液（1ナノモル）、または滅菌水20μlを20μl20μlを追加ネガティブコントロールのための無オリゴある。次に、各形質転換反応のために解決策2を300μlを加える。キャリア自体とオリゴの行為として、変換の過程でサケ精子DNAを追加する必要はありません。 </li><li>均質成分を混合する激しくボルテックス。 </li><li> 30℃シェーカーで30分間の変換反応をインキュベートする。 </li><li> 42℃のヒートショック℃で15分間。 </li><li> 4分間2236グラムに相当する5000回転、、で細胞をスピンダウン。 </li><li>滅菌水100μlの上清と再懸セルを削除します。 </li><li>この細胞懸濁液のアリコートを取ると10万倍と約を使用して1つのYPDプレート上にプレートの細胞によって滅菌水で希釈する。 30で15滅菌ガラスビーズとインキュベート℃で2日間C。 </li><li>プレート約を使用してトリプトファン（SC - TRP）のない合成完全な固体培地のいずれかのペトリ皿上の各形質転換反応液からすべて懸濁している細胞。 30で15滅菌ガラスビーズとインキュベートします4-5日のためのC（図2）。 </li></ol> RNA含有オリゴによる遺伝子補正のD.解析<ol><li> RNAを含むオリゴ、DNAのみのオリゴおよびno -オリゴ制御のための遺伝子の補正周波数を計算するために選択培地（図2）だけでなく、Y​​PD培地上に生育したコロニーの数を数えます。得られた数値を比較します。 2塩基の欠失やナンセンス変異をもつtrp5対立遺伝子の自然復帰率は、このように我々はオリゴを細胞に添加されていない選択培地上にコロニーの形成を期待していない、使用する酵母菌株の10月9日よりも小さいです。 </li><li>いくつか出ストリークは、無作為にシングルコロニーの分離株を取得するYPD培地に形質転換体のコロニーをピックアップ。コロニーの成長のための二日を待って、その後いくつかの（少なくとも5）の単一コロニーを取り、YPD上と選択培地上でパッチを作る。 </li><li>コロニーPCR（図1B）によってRNAを含むオリゴの標的領域（250-1,000 bp）を増幅するプライマー対を設計します。コロニーPCRのための手順は、（Storiciとレズニック、2006 2から変更）、次のとおりです。 <ol><li>再懸濁し、細胞（約1立方ミリメートルは）水50μlの個々のパッチから取得しlyticaseの1単位を追加します。 100℃ヒートブロックでインキュベーションに続いて10分、°溶液中の細胞とリリースゲノムDNAを切断する5分間室温でインキュベートする。 </li><li> PCR条件：PCR反応は、細胞懸濁液10μlを含む、50ピコモルフォワードプライマーとリバースプライマーの各々は、10mMのdNTPを、Taqポリメラーゼの1単位、10倍のバッファとの5μlを1μl、滅菌水で調整されます50μlの最終容積。 95℃30秒の30サイクル° C、55℃30秒° C、および72℃で1分間° C; 72℃で7分間の最終伸長時間は℃、その後のサンプルのPCRプログラムは95℃で3分間です。 4℃で保存されています1分/ kbの延長時間は、この反応のために仮定されます。 </li><li> PCRに続いて、サンプルはPCR産物（図3）の観察のために1％または2％（PCR産物の予想サイズに応じて）アガロースゲル上で実行されています。 </li></ol></li><li>遺伝情報が転送される場合、RNA含有オリゴは、酵母のゲノムのターゲット領域での新たな制限部位（図1B）を生成することによって、それは適切な制限酵素でPCR産物を消化して情報の正しい伝達を確認することが可能です。制限部位は、RNAを含むオリゴによって生成されていない場合は、手順6に進みます。特定の制限酵素を使用してダイジェストPCR産物。消化反応は15μlに6 PCR産物の液、バッファー、BSA（いくつかの酵素のために必要とされていない可能性があります、使用する酵素のための命令を参照）、制限酵素0.5μlの、および滅菌水を含まれています。サンプルは、使用される酵素の特定の温度で1時間インキュベートする。 </li><li> bを転送した遺伝子改変を観察するために、2％アガロースゲルの同じ行上に消化サンプルと一緒に未消化サンプルを実行するRNA含有オリゴのy RNA路（図3）。 </li><li> PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、DNAシーケンシングのためにそれらを準備する。製品を増幅するために使用したものと同じプライマーでシークエンシング用サンプルを提出する。 </li><li>選択された参照配列（図4）と複数の配列のアライメントを可能にするソフトウェアを使用してDNAシーケンシングの結果を分析する。 </li></ol> RNA含有オリゴのE.アルカリ処理（図5） <ol><li>各反応について、1.5 mlチューブにRNA含有オリゴ、またはDNA -オリゴの1ナノモル（250ピコモル/μLストック溶液4μl）を添加。 </li><li>加水分解のために1 M NaOHを4μlのを追加し、あるいは1時間、ネガティブコントロールとして、4μlのH 2 Oを追加し、水浴で65℃でインキュベートするその後、水浴から氷へ移動する。 </li><li> 1.2MのHClを、H 2 Oの1 Mトリス-塩酸、4μlの4μlの、あるいはH 2 Oの6μlのとネガティブコントロール用の1 Mトリス- HClを4μlの2μlので中和する。変換まで氷上で保管してください。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。欠陥trp5遺伝子のおよびRNAを含むオリゴで補正TRP5対立遺伝子の模式図。）trp5変異遺伝子は、2塩基欠失（黒い三角形）と1ベースのナンセンス変異を（アスタリスク）が含まれています。一本鎖RNAを含む2塩基挿入（青ループ）とVan91 I制限酵素部位を（ブラケットによって示される）を生成する1 - RNAの塩基置換（赤の矩形）とオリゴは、遺伝的欠陥を修正するための酵母細胞に形質転換されtrp5遺伝子の。 TRP5遺伝子はRNA含有オリゴ（訂正拠点が青い矩形で示されている）によって修復された後にB）、Van91私のサイトはTRP5遺伝子に生成されます。 TRP5遺伝子で唯一Van91 I制限部位を含む278 bpの断片は、プライマー（P1とP2）のペアによって増幅されたPCRです。 Van91でP1とP2のPCR産物の消化後に生成された177 bpと101 bpの断片を、私も表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 RNAを含むオリゴ型の変換結果。）無オリゴで形質転換した酵母細胞は、SC - TRPの培地上の任意のコロニーを形成しない、プレートABを参照してください。 B）細胞の後にSC - TRPに成長しているプレートCGショーの酵母のコロニーは、RNAを含むオリゴの1ナノモルで形質転換されています。 C）のセルの後にSC - TRPに成長しているプレートHLショーの酵母のコロニーは、対応するDNAのみのコントロールオリゴの1ナノモルで形質転換されています。 <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。からの遺伝情報の伝達RNAを含む標的ゲノム領域を増幅するPCR産物の制限消化により酵母染色体DNAにオリゴをの検出。PCRサンプルの2％アガロースゲル電気泳動P1とP2によって増幅し、Van91 I制限酵素で消化。レーン1、8、15、100のサイズは、200、300、400と左に表示されている500塩基のDNAラダー、レーン2、trp5変異株のゲノムDNAから増幅さtrp5遺伝子座のPCR産物、レーン3、PCRレーン4-7、RNAを含むオリゴの標的のTrp +コロニーに由来するゲノムDNAから増幅したPCR産物;レーン9〜14、Van91 I制限消化DNAのみのオリゴがターゲットとのTrp +コロニーに由来するゲノムDNAから増幅産物レーン2から7までのPCR産物の。レーン10〜14でカットされていないPCR産物のバンドの存在はTRP5軌跡（CCACATTCTGG）でVan91 Iで部分消化によって説明することができます。 Van91私（CCANNNN NTGG）のための切断部位は、複数のシーケンスを持つことができることを考慮すると、TRP5で生成されたサイトは、酵素のための最適なターゲットになる場合があります。我々はオリゴによって運ばれたもの以外の追加変更を検出しないすべての上記のPCR産物のDNA配列に続く、実際には（図4を参照）。 Van91でP1とP2プライマーと消化の産物のバンドが増幅された278 bpのPCRバンドは177 bpおよび101 bpの私は、右上の矢印で示されています。 <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="図4Thumb" /> 図4。 RNAを含むオリゴによる遺伝子の補正を示すDNA塩基配列決定の結果。）RNAを含むオリゴの標的ゲノム領域のDNAの電気泳動図。 DNA配列（箱入り青）のGは、RNA含有オリゴでRGに由来する。また、箱入りのCG拠点の挿入です。他のすべてのPCR産物からシークエンシングの結果は、よくバックグラウンドを超える蛍光シグナルを、また、これと同等明らかです。 B）のTrp + transfoのTRP5領域の配列は、DNAのみのオリゴ（T1）およびRNAを含むオリゴ（T2 - T5）の上にコンセンサス配列に一致するとの標的rmantsは（ゲノムDNA、赤オリゴが標的とする前にtrp5変異細胞のそれと比較されています網掛け）。底の修理RNAを含むオリゴは2つの塩基のDNAの挿入と赤でマークされた一塩基（G）のRNA置換されています。だけでなく、RNAを含むオリゴその黄色の色調のショーと青の枠で囲ま領域はDNAのみのオリゴは、正確にすべての試験した試料の欠失変異やナンセンス変異を修正。破線は、RNAを含むオリゴ配列の位置をマーク。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg">ここをクリックして</a>図4の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。アルカリ処理は、RNAを含むオリゴによる遺伝子の補正を防ぎます。RNA含有オリゴ（R）で形質転換頻度は赤いバーでとDNAのみのオリゴ（D）で、青色のバーに表示されていることが示されている。エラーバーは各オリゴのための3つの独立した変換のための平均の標準誤差を表しています。 DNAのみのオリゴはなしとNaOH処理と同様の形質転換頻度が表示されます。異なって、RNA含有オリゴによる形質転換頻度は、NaOHで0次の治療に低下します。したがって、RNA含有オリゴと準備がDNAのみのオリゴで汚染されていない、したがって、観察された形質転換頻度は、RNAを含むオリゴに固有のものです。

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	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

この記事の映像制作は、このマニュアルで使用する試薬や器具を生産するサーモフィッシャーサイエンティフィック、後援した。

RNAは細胞内でゲノムDNAに直接遺伝情報を転送することができるという事実は、合成RNAを含むオリゴ（Dharmacon合成オリゴ）1の使用を悪用発見された。それは、細胞がDNA合成の鋳型としてRNAを含む分子またはRNAのみのシーケンスを使用することができる原理の証明だ。だけでなく、遺伝情報が逆転写されたDNAのコピーの中間の必要なしにゲノムDNAにRNAから直接転送することができますデモにつながったRNAを含むオリゴの使用だけでなく、RNAが相同テンプレートとしてで使用できることを証明するDNA損傷1,3の修復。我々はここで示した例のようにオリゴは、RNAのみで作らまたはDNA配列に埋め込まれているだけで、単一のリボヌクレオチドを​​含めることができます。 RNA含有オリゴは、ゲノムの不良品trp5対立遺伝子にナンセンス変異を修正するために設計された1つの埋め込 ​​みリボヌクレオチドを持っています。リボヌクレオチドからゲノムDNAの遺伝情報の伝達は、標的細胞の表現型の変化（細胞がトリプトファンを欠く培地上に生育している）によって明らかにされる。 RNA含有オリゴで得られた遺伝子の補正の周波数を測定し、コントロールDNAのみのオリゴのそれと比較されます。我々は様々な酵母の遺伝子を変異させ、異なるセルの背景、この遺伝子の補正アッセイを行うことにより、我々は、特にRNAを含むオリゴが標的に影響する要因/ sで検出することができます。従って、我々は細胞がRNA / DNAハイブリッドの安定性を制御する方法のメカニズムを明らかにすることができます。単にRNAを含むオリゴの異なる変種を設計することで我々は、DNA修飾でテンプレートとして機能する特定のRNAの消化管に対する尤度を決定することができますし、我々はDNAに組み込まれた特定のRNA配列の安定性を決定することができます。また、我々は、RNA / DNAハイブリッドと相互作用する因子の生体内基質に好まれるかを識別することができます。 主に短期利用、in vitro試験のいくつかのRNAを含むオリゴは、同様のRNase Hの生体機能に 、RNアーゼHの酵素4として、DNAとのハイブリッドのRNAを認識することができる要因の機能を特徴づけるために実施されているが、 RNA / DNAハイブリッド安定性はほとんど未知のままに影響を与えることができる他のタンパク質の同一性として。かなりの長さ（50〜80量体）と、最適な品質のRNAを含むオリゴを利用する可能性が（そのようなサーモ科学DharmaconオリゴRNAを含有など）は直接の in vivo での分子プロセスの広い範囲を調べる方法を開いています目的の細胞。このビデオに示すように、RNAを含むオリゴを使用した変換は、いくつかの追加手順がRNaseにによる劣化を防ぐために、DNA分子を用いて変換に比べて本質的に必要になります。このように、RNAを含むオリゴを使用して変換が酵母のシステムに限定されるものではなく、DNAオリゴによる変換が堪能である任意の生物や細胞のタイプに適用することができます。 結論では、RNAを含むオリゴで細胞を標的とする細胞にin vivoで DNAに埋め込 ​​まれているRNA / DNAハイブリッドとリボヌクレオチドを生成するための機会を提供しています。 in vivoでの安定性、機能とこれらの結果は、RNAを生成/ DNAハイブリッドは、潜在的にDNA修復の未知のメカニズムを明らかにして標的遺伝子のために新しい戦略を明らかに、分析し、特徴づけることができる。

A.トランスフォーメーション試薬とメディア（Storiciとレズニックから変更、2006年<ol><li> YPD（酵母ペプトンデキストロース）：1 Lの場合、10gの酵母エキス、20グラム大豆ペプトン、20グラムブドウ糖。 YPD固体培地を作るために15gの寒天を追加。使用前にオートクレーブ。室温で保管してください。 </li><li>解決策1：酢酸リチウムの0.1M。変換前にすぐに準備します。解決策1、正常に機能するソリューションである、従ってそれは、粉体から直接製造される。いいえ原液は行われません。室温で保管してください。 LiAcはDNAに酵母細胞壁の透過性を向上させます。 </li><li>解決策2：酢酸リチウムの0.1Mとポリエチレングリコール4000の50％。また、溶液2は、実用的なソリューションであり、それは粉体から直接行われます。いいえストック溶液を準備されていません。室温で保管してください。 PEGの堆積物は、酵母細胞にオリゴ。 </li><li> RNA含有オリゴ（サーモ科学Dharmacon）、50から80量体、脱塩、脱保護および非精製。 250ピコモル/μlに懸濁します。 -80℃で保存する</li><li> DNAのみのオリゴ、50から80量体、脱塩及び非精製。 50ピコモル/μlに懸濁します。 -20℃で保存</li><li> SC -トリプトファン（トリプトファンを欠く合成完全培地）固形培地。 </li><li>オートクレーブによる滅菌0.5センチメートル径のガラスビーズ、。 </li><li>のRNaseオフ：RNaseの除染液。 </li><li>のDNase / RNaseフリー、滅菌遠心管。 </li><li>のDNase / RNaseフリー、無菌コニカルチューブ。 </li><li> ZAPでのDNase / RNaseフリー、滅菌エアロゾルのピペットチップ：1〜200ミリリットル、百〜千ミリリットル。 </li></ol> B.コロニーPCRの材料。 <ol><li>脱塩及び非精製されたDNAプライマー、。 50ピコモル/μlに滅菌水に溶解する。 -20℃で保存</li><li> Taq DNAポリメラーゼ、バッファー、dNTPを。 </li><li> PCRチューブ。 </li></ol> C. PCR精製。 <ol><li> PCR精製キット。 </li></ol> D.ゲル電気泳動。 <ol><li>アガロース。 </li><li> 10倍TBEから希釈した1 × TBEランニングバッファー（45 mMトリス - ホウ酸および1mMエチレンジアミン四酢酸）。 </li><li>プレステ分子量マーカー。 </li><li> DNAのローディング色素。 </li></ol> E.制限消化。 <ol><li>制限酵素、10倍のバッファー、BSA。 </li></ol> RNA含有オリゴのためのF.アルカリ処理。 <ol><li> NaOH溶液の1 M。 </li><li> HCl溶液の1.2 M。 </li><li>トリス- HClの1 M、pH7.4のソリューション。 </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

合成短い核酸ポリマー、オリゴヌクレオチド（オリゴ）は、分子生物学の最も機能的かつ広範なツールです。オリゴは、任意の所望のDNAまたはRNA配列を含むように作製することができると、ベースと糖の修飾のさまざまなを含むように調製することができる。また、オリゴは、特定の核酸の変化を模倣するため、DNA損傷と修復のメカニズムの効果を調べるために重要なツールとして使用できるように設計することができます。我々は、50〜80ヌクレオチドの間の長さと熱科学Dharmacon RNAを含むオリゴは、染色体RNA / DNAハイブリッドの in vivo、機能や結果でとDNAに埋め込 ​​まれたリボヌクレオチドの、勉強するのに特に適していることが分かった。 RNA / DNAハイブリッドが容易にDNA複製、修復と転写の間に形成することができる、しかし、非常に小さな細胞のRNA / DNAハイブリッドの安定性についてはほとんど知られており、どの程度これらの雑種は、細胞の遺伝的整合性に影響を及ぼす可能性がする。 RNAを含むオリゴは、従って、染色体DNAへのリボヌクレオチドを​​導入し、選択した長さと塩基組成のRNA / DNAハイブリッドを生成するのに最適なベクトルを表します。ここでは、真核生物のモデル系の酵母/ サッカロマイセスセレビシエ /のゲノム中へのリボヌクレオチドの取り込みのためのプロトコルを提示する。まだ、私たちの研究室が利用されているサーモ科学Dharmacon RNAを含むオリゴは、細菌からヒトの細胞に、種々の細胞系の染色体レベルでのRNA / DNAハイブリッドを生成する。

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Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

この作品は、染色体レベルでのRNA / DNAハイブリッドを形成し、酵母細胞内でRNAからゲノムDNAに遺伝情報の伝達を明らかにする方法を示しています。

RNAを含むオリゴヌクレオチドを​​使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

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A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

遺伝学

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

免疫・感染学

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

医学

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

高密度DNAおよびRNAマイクロアレイ - 光リソグラフィー合成、ハイブリダイゼーション、大型核酸ライブラリーの調製

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

発生生物学

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

2 &#39;末端を含むRNAのオリゴマーの固相合成のためのプロトコール<em&gt; O</em&gt;チオフェンメチル修飾と環状二色性によるキャラクタリゼーション

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

化学

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

生化学

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

環境学

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

生物工学

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

オリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

RNAを含むオリゴヌクレオチドを使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

要約

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点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

高密度DNAおよびRNAマイクロアレイ - 光リソグラフィー合成、ハイブリダイゼーション、大型核酸ライブラリーの調製

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

2 '末端を含むRNAのオリゴマーの固相合成のためのプロトコール

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ

オリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化

RNAを含むオリゴヌクレオチドを​​使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

要約

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点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

高密度DNAおよびRNAマイクロアレイ - 光リソグラフィー合成、ハイブリダイゼーション、大型核酸ライブラリーの調製

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

2 '末端を含むRNAのオリゴマーの固相合成のためのプロトコール

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ

オリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化

RNAを含むオリゴヌクレオチドを使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代