このプロトコルは、ユーザーが代替スプライシングを受けることができるゲノム発現システムを生成することを可能にし、この場合、その機能および疾患関連についてテストすることができる円形のRNAを形成するので、重要である。この技術の主な利点は、円形RNA形成および機能における代替スプライシングを研究する際に、他の人がこのプロトコルを分子生物学およびクローニングに使用する道を開くということです。このテクニックを初めて試してみる人に対する私のアドバイスは、PCR条件を最適化することです。
勾配を実行するか、異なるアニーリング温度と延長時間でタッチダウン PCR を実行します。通常、6 KB 以上の長いフラグメントは、サイクルごとに 1 KB を拡張し、最適な増幅のために異なるアニーリング温度をテストする必要があります。この方法のデモンストレーションは、ユーザーに、特にプライマーの生成の手順のより困難な側面のより良い視覚的表現を与えるので、重要です。
この手順を開始するには、UCSCゲノムブラウザをロードし、円形RNA形成に必要な反復要素を同定し、それらを構築物に組み込みます。重要なことに、増幅用のプライマーは反復要素の外側にある必要があります。円形RNA配列をヒトBLAT探索に貼り付け、適切な生物を選択します。
シーケンスを送信し、ブラウザビューに移動し、1.5タイマーまたは適切なズームアウトします。次に、繰り返し要素の上にマウスを移動し、フローティング ウィンドウでサブタイプを識別します。Alu 要素は、ラインの中にあります。
誤った画像が得られた場合にブラウザをリセットするには、ウィンドウの下にあるデフォルトのトラックボタンを使用します。まず、USCSゲノムブラウザの一番上の行にあるDNAを見て、ウィンドウに示されているDNA配列をダウンロードします。シーケンスの書式設定オプションで、拡張ケース/カラーオプションを選択します。
デフォルトケースを低い値として選択し、NCBI RefSeq のトグルケースを選択します。リピートMaskerで下線と太字と斜体を選択します。[送信] をクリックします。
大文字としてエキソン、小文字としてイントロンがあります。エキソン/イントロンの境界線を確認してください。ブラウザが逆補数を表示する場合は、正しいエキソン/イントロンの境界線が表示されるまで戻って、逆の補数ボックスを選択します。
次に、正しい向きのファイルをワープロドキュメントにコピーし、エキソンをハイライト表示します。増幅する断片を選択して、イントロンが繰り返しの領域で始まらないようにし、これらの領域のプライマーが特定の配列を増幅しないようにします。まず、Web ツールを使用して、クローニング用のプライマーを設計します。
ベクター配列については、挿入部位を最後のヌクレオチドとして追加し、その後にフラグメントを追加する。ベクトルの番号付けは特定の挿入部位から始まらないため、ベクトル内の挿入部位が位置し、下流の部分が上流のシーケンスの前に配置されます。融点が摂氏4度を超え、増幅に働かない場合はプライマーを調整します。
本研究では、円形RNAを生成するレポーター遺伝子をクローニングして解析する。最適化 PCR 産物は、1X ゲル グリーンを含む 1%アガロースゲル上で分離されます。個々のバンドは、酵素DNAアセンブリで使用されるPCR産物を表します。
これらのバンドは、その後、ゲルから切り取られ、精製されます。精製PCR製品はゲルグリーンで期待されるサイズに合わないため、1%アガロースゲルで分離され、その後エチジウム臭化物で染色され、製品のサイズが正しいことを確認します。まず、酵素DNAアセンブリキットをセットします。
ベクトルと挿入物を 1 ~ 2 のモル比で結合します。次に、10マイクロリットルのDNAアセンブリマスターミックスを加えます。50度で60分間サンプルをインキュベートします。
インキュベーション中に氷上の有能な細胞を解凍します。細胞は50マイクロリットルの体積でなければなりません。次に、総組立反応で有能な細胞を変換します。
冷却された組み立て製品の2マイクロリットルを有能な細胞に加えます。チューブを4~5回軽くフリックして混ぜます。渦を出さないで下ろしてください。
氷の上に30分間置きます。42°Cで30秒間加熱衝撃を与えます。その後、2分間氷の上に戻します。
この後、950マイクロリットルの室温SOC培地をチューブに加えます。300 RPMで振りながら摂氏37度で60分間インキュベートします。このインキュベーションの間に、適切な抗生物質を含む2つの選択プレートを温める。
インキュベーションに続いて、反応管を10,000gで30秒間遠心分離し、細胞をペレット化し、一方の選択プレート上の細胞の25%をプレートアウトし、もう1つの選択プレートに75%をプレートアウトする。これらのプレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。トランスフェクションを開始する前に、制限ダイジェストによってDNAを確認してください。
ここで、エキソン9〜12を含む代表的なタウミニジーンは、主要な組換えを排除することを示す制限酵素で切断される。トランスフェクションの場合、まず、pH2で1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度で、直線状ポリエチレン塩酸塩を水中に溶解します。水酸化ナトリウムを使用してpHを7個まで持ち込み、0.22マイクロメートルのフィルターで溶液を無菌フィルターにします。
使用できる状態になるまで、摂氏4度で溶液を保管してください。その後、細胞を6ウェルプレートのウェルに分割し、10%FBSを含むDMEM培地で一晩成長させます。翌日、報告された遺伝子の1マイクログラムを無菌チューブにアリコートし、150ミリモル塩化ナトリウムを濾過した無菌の200マイクロリットルを加える。
渦を混ぜます。次に、この混合物にポリエチレンアミン溶液を、DNAのマイクログラム1グラムにつき3マイクロリットルのポリエチレンイミンの割合で添加する。チューブの底部にサンプルを収集するために簡単に遠心分離機。
室温で10分間インキュベートします。その後、HEK293細胞に直接追加します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩細胞をインキュベートします。
翌日、RNA分離キットを使用して、RT-PCR用のRNAを分離します。ヒト脳組織由来の2つのサンプルからcDNAを、タウエキソン1210を逆に回る円形RNAプライマーで増幅し、タウエキソン1211を前方に回る。タウ円形RNAに対応する予想バンドが見られるが、他の強いバンドはヒトゲノムと一致しなかったアーティファクトである。
この実験は同一のPCR条件で繰り返されるが、逆転写は、サークタウエキソン1210逆プライマーでのみ行われた。シーケンシングによって、期待されるバンドのみが増幅され、検証されます。RNAは、リニアRNAを除去するRNase Rで処理されます。
円形RNAは処理後に検出可能であるのに対し、リニアRNAはもはや検出可能なシグナルを与えなくなる。RNAはトランスフェクション後24時間に単離され、RT-PCRによって分析されます。直線的なタウmRNAの増幅は、エキソン10の代替スプライシングによる2つのバンドを示す。
それらの比率は、スプライシング因子の過剰発現に変化する。円形1210タウRNAの増幅は、特にCdc2様キナーゼCLK2およびSRタンパク質9G8の発現に対するタウ・サークRNA発現の依存性を示す。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、ミニジーンを構築する際のプライマーの設計と位置です。
プライマーは繰り返し要素に存在してはならないため、増幅される断片に応じて異なる条件下で最適化する必要があります。この手順に従って、実行できる他の方法は、循環RNAの機能をテストすることです。ユーザーは、タンパク質の翻訳または隔離をテストして、ユーザーが興味を持っている特定の円形RNAの機能を同定することができます。
この技術は、ユーザーがテストし、その機能を識別し、いくつかの側面で病気に関連する円形のRNAを発現することができるミニジーンシステムでゲノム断片を利用する方法を開いた。この技術の意味合いは、タウオパシー、タウ病に関連する神経変性疾患などの特定の疾患の潜在的な治療法および診断に及ぶ。MAPTとして知られる微小管関連タンパク質タウは、疾患病理に寄与していると考えられる円形RNAを生成し、この方法は、これらの円形RNAを完全に研究し、その機能と疾患との関連を特定することを可能にすることを発見しました。
この方法は、円形RNAの理解、その機能、および特定の疾患におけるそれらが果たす役割についての洞察を提供することができる。この方法は、その機能に関する洞察を提供することができる種間の円形RNAを発現する他のミニ遺伝子のクローニングに適用することができる。PCR産物の増幅は、ゲノムDNAから増幅された長い断片と、断片内に複数の反復要素を有する場合に最も困難であることが証明されています。
