著者らはH.アイゼン、M. Gubbels、K.バン​​Grinsven、E. Guillenは、A.ドレイク、V.マハジャン、Q.高、そして有意義な議論と試薬のG.ヤップに感謝しています。私たちはJ. Dausman、R.フラナリー、およびマウスのコロニーの管理と支援のためのJ.ジャクソンに感謝しています。我々はFACSorting用P. Wisniewskiはに感謝しています。 EMFは、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムによってサポートされていました。 RJは、健康補助金RO1 - HD045022とR37 - CA084198の国立研究所によってサポートされていました。 HLPは、国立衛生研究所からの補助金によって支えられている。

このメソッドは、で報告された研究で使用されて<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak ら 、Science 328（5975）、243〜248（2010） 。</a> 1。ドナー細胞の分離特定のTまたはB細胞がtransnuclearマウスモデルを生成するためのドナー細胞として使用できる前に、マウスは、興味のある病原体に感染したり、目的の抗原で免疫する必要があります。我々は、 トキソプラズマ原虫に対して特異的CD8 +細胞を使っているので、次のプロトコルは、これらの細胞や個人的な興味に応じて適応させる必要性の生成と分離を説明します。 <ol><li>マウス脳のホモジネート（約40）に由来する嚢胞はBL / 6 H - 2 bとH - 2 dの制限されたCD8 + T細胞の両方の分離を可能にするXをBalb / c F1（B6CF1）マウスに腹腔内注射する。 </li><li>免疫応答のピーク時には、感染したマウスは安楽死させた場合、脾臓を単離し、6 mLの赤血球（RBC）の溶解バッファーが含まれている皿に置かれた。 </li><li> 2つのカバーのスライドのつや消しの側面を使用して、脾臓は慎重に粉砕し、室温で5分間RBC溶解バッファー中でインキュベートされる。 </li><li> 14mlのPBSを追加、50mlファルコンチューブと300グラムで5分間、遠心分離機にセルストレーナー（40または70ミクロン）を介して細胞懸濁液をフィルターします。 </li><li>上清を除去する、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに1 mLのPBSと転送で細胞ペレットを再懸濁します。 300グラムで5分間遠心操作して、その後上清を取り除く。 </li><li> 、50μLのPBSで細胞ペレットを再懸濁します関心の細胞型（例えばCD3、B220、CD8、およびCD4）を識別するための蛍光標識抗体を追加し、そして蛍光MHC - I四量体（CD4 T細胞のMHC - IIテトラマー）ロードされたラベルが付い4℃で30分間細胞懸濁液とインキュベートへの関心のペプチド℃の</li><li> 1 mLのPBS、3 mlのPBSで300グラム、ペレットを再懸濁しますで5分間遠心分離を追加し、チューブにセルストレーナー（40または70ミクロン）を介して細胞懸濁液をフィルターします。 </li><li> （図1B）厳重にゲートを設定することにより、FACSortingを実行します。 </li></ol> 2。体細胞核移植体細胞核移植のためのいくつかのプロトコルがあります。ここで説明したものは、中期- IIおよびサイトカラシンBのためのドナー細胞を使用して第二減数分裂の阻害で逮捕された卵母細胞の使用はG0/G1期にあるかを必要とされることができます。 <ol><li>卵母細胞の調製<ol><li> BDF1背景の雌マウスは、午後5時と午後7時との間のマウスあたり5IU PMSで腹腔内注射する。 </li><li>約47時間後、各マウスは5IU HCGを腹腔内に注入されます。 </li><li> HCG注射と同じ日に卵母細胞用培養皿を（KSOM - AAは、油の下に下がる）の準備及び° C、5％CO 2インキュベータ37内に配置します。また、水銀を使用してそれらをロードすることにより、体細胞核移植（核出術のための7μmと4またはリンパ球核の核移植のための5μm以下）のために必要な針を準備。 </li><li>マウスを安楽死させるとHCG後の13H（約8時）約卵管を分離。 HCZBの1〜2滴で卵を集める。 </li><li>一つずつは、M2のw /ヒアルロニダーゼを含むドロップに卵管を移動する。ニックはforcepと慎重に卵管やドロップに卵母細胞 - 卵丘複合体を動かす。すべての卵母細胞 - 卵丘複合体が単離されている後、皿を37℃でインキュベートされた℃に</li><li> 2〜5分間は（正確な時間はヒアルロニダーゼのバッチに依存する）卵母細胞を収集した後、HCZBとプレートそれらKSOM - AAの低下にに洗ってください。 </li></ol></li><li>卵母細胞の摘出<ol><li> SCNTプレートを作製するためにペトリ皿の蓋を使用してください。顕微鏡、およびマイクロマニピュレータを設定します。 </li><li>眼球摘出を開始する前にPVPの除核の針（7ミクロン）を洗浄する。 </li><li>摘出の場合は、サイトカラシンB（5μg/ mL）を持つHZCBのドロップに卵母細胞（10-30）のグループを置く。水平に（5分以上）のラインアップの卵母細胞をインキュベートしながら。 </li><li> one卵母細胞を取り、保持している針の前面に配置します。真空を適用することによって、保持している針に卵母細胞を修正。脱核の針を使用して、染色体スピンドル複合体（CSC、しばしば&quot;核&quot;と呼ばれる）3時の位置になるまで卵母細胞を回します。 </li><li>ピエゾパルスを使用すると、卵母細胞にダメージを与えることなく、慎重に透明帯を貫通する。中期- IIのスピンドルに隣接する針の開口部を配置し、真空を適用する。 &quot;核には&quot;ゆっくりと針に移動する必要があります、そしてそれが完全に除去された後、膜は、それ自体を封印してください。 </li><li> KSOM - AA低下に戻って除核卵母細胞を移し、それらを複数回洗浄する。 eを繰り返します。卵母細胞の新しいグループと核形成ステップ。すべての卵を摘出または11AMについてまでされるまで続けます。 </li></ol></li><li>核転送<ol><li>核移植のための、交流の核移植針（4〜5ミクロン）とPVPでそれを洗うと除核の針（7ミクロン）。 </li><li> PVPとドロップに興味のある細胞（例えばCD8 + T細胞）に配置、よく混ぜ、10分の最小インキュベート。 </li><li>サイトカラシンB（2.5μg/ mL）を持つHCZBのドロップに除核卵母細胞の群（10-30）を置きます。核移植の針を使用して水平方向（5分以上）のラインアップの卵母細胞をインキュベートしながら。 </li><li> PVP -細胞懸濁液から、ドナー細胞をピックアップし、出たり入ったりの外膜は、（細胞膜と細胞質ゾルの断片が見えるはずです）に分解されるまで、それを吸引除去する。必要に応じてピエゾパルスを印加することができます。核が分離された後、針でそれを少し上に移動し、10から30になるまで核をピックアップし続けます。 </li><li>整列除核卵母細胞を含むドロップして移動します。真空を適用することにより、保持針一つ卵母細胞を修正。透明帯への核移植の針が（核が離れて開幕からでなければならない）隣接配置し、針が透明帯を通過するまで、ピエゾパルスを適用する。慎重に、針の先端に1つの核を移動し、針の先端の2 / 3の内側になるまで卵母細胞に針を押し込みます。卵母細胞膜の少しが針になるように、小さな負圧を適用します。 </li><li>それは卵母細胞が実際に&quot;オープン&quot;である唯一の時間ですので次のステップは、非常に重要です。 、ピエゾの単一パルスを適用する正圧を印加することにより、針の核を押し出す、慎重に先端が卵母細胞の約1 / 3となるように針を引き戻すし、適用する負圧をとするために針を引き戻すために、引き続き卵母細胞を密封。各卵母細胞で、この手順を繰り返します。 </li><li>グループのすべての卵母細胞の核を受け取った後、彼らはKSOM - AAの媒体中で洗浄し、培養する。すべての卵母細胞でこの手順を繰り返します。 </li><li>最後のグループは30分の最低KSOM - AAの文化をされた後、SCNT -胚はSrCl2を含むCA -フリー化メディアの低下に転送されます。 </li><li>活性化の6時間後、疑似前核（PPN）陽性SCNT -胚の量が決定されます。彼らは胚盤胞期に到達するまでの胚はその後さらに3.5日間KSOM - AA降下で洗浄し、培養する。 </li><li>選択の薬物や化学物質（例えばトリコスタチンAなど）の活性化と培養培地に加えることができる。 </li></ol></li></ol>胚性幹細胞の3.Derivati​​on SCNT -胚盤胞を偽妊娠の雌（また、直接またはワンステップクローニングとも呼ばれる）に転送するといずれか、または胚性幹細胞を（また間接的または二段階クローニングとも呼ばれる）を導出するために使用することができます。それはES細胞を生成するためにはるかに効率的なので、我々は2段階の手順を選択してください。科学者が直接クローニングすることに興味を持っている場合にはセクション5で説明したように、胚盤胞を偽妊娠の雌に直接転送することができます。 胚性幹細胞の派生を説明する多くのプロトコルがあります。ここで説明したものは、フィーダー細胞、及びウシ胎児血清を利用した標準的な技法、である。 <ol><li>核移植後の二日目、ES細胞の導出のための96 - U -ウェルプレートを準備。 </li><li> 10分の最小インキュベート96 U - wellプレートの各ウェルにゼラチン100μLを、追加、そしてその後それを削除してください。 </li><li>融解フィーダー細胞とESD培地の応じてボリュームに再懸濁し、25cm 2の面積に相当するなどのフィーダー細胞を10mLのESD培地および細胞懸濁液200μLで再懸濁しているがよくゼラチン処理したのそれぞれに追加されます。 </li><li> 37℃インキュベーターと文化にプレートを入れ° C、5％CO 2。 </li><li> 3.5日後、胚は胚盤胞の段階になっているはず。 </li><li>数滴のES細胞用培地と酸性thyrodeをめっきすること滅菌細菌の料理を準備します。 </li><li>胚盤胞は、最初に通常のES細胞の培地を含む水滴にKSOM - AAドロップから転送され、2回洗浄する。 </li><li>慎重に酸性thyrodeの一滴に胚盤胞のグループを（5-10胚盤胞）に転送し、透明帯が溶解するまでそこに置いてください。 </li><li>胚盤胞は、その後、ES培地のドロップに移して2回洗浄し、その後、フィーダーでコーティングされた96 - U - wellプレート（上手にへの1つ胚盤胞）に置かれます。 </li><li>胚は、それらを乱すことなく37℃、5％CO 2でインキュベーターで5-7日間培養する。これにより、胚の時間を与えるフィーダー層にttach、および伸長を形成する。 </li><li>各ウェルにESD培地にプレーティングフィーダによって、24ウェルプレートを準備し、例えば12 mLのESD培地では50 cm 2とフィーダと同等のものを再懸濁し、そして各ウェルに細胞懸濁液の500μLを加える。 </li><li>慎重に胚96 - U -ウェルプレートからESD培地を除去、250μLHEPES（またはPBS）で2回各ウェル洗浄、50μLのトリプシンを追加し、37℃で約5分間インキュベート℃に</li><li>副産物は、単一細胞懸濁液、37℃で24ウェルプレートとインキュベートに転送° C、5％CO 2。に離れて落ちてまで、複数回上下にピペッティング</li><li> ESCの導出が成功した場合は、ESCのコロニーは、7〜10日後に見えるはずです。 </li></ol> 4.Blastocyst注入胚盤胞の注入は、トランスジェニックマウスモデルの任意の種類を生成するルーチンのテクニックです。胚盤胞の注入と偽妊娠の雌に、後続の転送がうまくタイミングが必要であることを言及することが重要です。 <ol><li> PMSとHCGと首相雌マウスは、セクション2.1で説明した。 HCG注射後の雄マウス（ケージごとに一人の女性、男性1マウス）と一緒に雌マウスを置く。 </li><li>翌日、プラグ用の雌を確認してください。これは、0.5dpc（日後に性交）としてカウントされます。 </li><li>受精胚は、その後のセクション2.1で説明したように卵管から分離し、さらに3日間KSOM - AAで培養されています。 </li><li>胚盤胞注入（3.5dpc）の日にES細胞を準備します。 </li><li> ES細胞から培地を除去、37、HEPES（またはPBS）で2回洗浄トリプシンを追加し、5分間インキュベート℃に</li><li> ES培地、皿にプレートし、37℃で45〜60分間インキュベート（フィーダー細胞は、より高速なES細胞より付着）フィーダー細胞の量を減らすために、C、5％CO 2で再懸濁し、トリプシン処理細胞。 </li><li>チューブにセルストレーナー（40または70ミクロン）を介して細胞懸濁液を移し、そして1000rpmで5分間遠心操作。 </li><li>必要になるまで氷上で500μLES培地とストアに上清を、再懸細胞ペレットを削除します。 </li><li> PVPとHCZBを含むめっき低下によって滅菌細菌ディッシュの蓋を準備します。 </li><li> 、水銀と載荷位置に置くとPVPとのそれを洗浄することにより15μmの針を準備します。 </li><li> HCZBとドロップに胚盤胞（10〜30個の胚盤胞）のグループを置き、そしてHCZBの別のドロップに50から50μLのES細胞懸濁液（濃度に依存する）に追加します。 </li><li>注射針でES細胞を（50セル）ピックアップします。 </li><li>胚盤胞でドロップに移動します。水平に胚盤胞を合わせ、真空を適用することにより保持している針を持つものを修正。 </li><li>内細胞塊（ICM）9時の位置になるまで注射針を使用すると、胚盤胞を回します。 </li><li> 、3時位置にして注射針を置き、針の先端にはES細胞がないことを確認して、注射針が胞胚腔に透明帯と栄養外胚葉を貫通するまでピエゾパルスを適用する。 </li><li> ES細胞はICMに固執するように、少数のES細胞を（5-15セル）を離します。グループのすべての胚盤胞は、ES細胞を注入されるまで続けます。 </li><li>胚盤胞の一つのグループが終了した後、KSOM - AAで二度、それらを洗浄し、胚盤胞が注入されるまで、それらKSOM - AAとドロップにしてください。 </li></ol> 5。胚移植偽妊娠の雌への胚の転送は非常に慎重にと研究者の機関のガイドラインに従って実施する必要がある手術を、表します。 <ol><li> 、女性レシピエントマウスをAnaesthetize右下の象限を剃って、消毒。 </li><li>使用してはさみで皮膚を開き、そして皮膚から腹膜を分離。 </li><li>腹膜（赤色スポット）を介して卵巣を見つけ、そして卵巣に近接して腹膜を開きます。 </li><li>鉗子を使用して、慎重に卵管を取得し、子宮を引き出します。 </li><li>口のピペットに接続されているキャピラリーで約10胚盤胞のグループをピックアップ。 </li><li>一鉗子で子宮を固定し、小さな針で、そこに小さな全体をパンチし、子宮の内腔に胚盤胞と毛細血管を挿入します。 </li><li>慎重に子宮に胚を解放し、キャピラリを取り外します。 </li><li>腹腔内に戻って子宮を押してください。 </li><li>腹膜のエッジを見つけ、少数のステッチで閉じます。 </li><li>いくつかのステープルでマウスの皮膚を閉じます。 </li><li>手術後の痛みの場合は、体重mg当たり5μgのカルプロフェンを管理する。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="図1" /> 図1体細胞核B6CF1バックグラウンドで事前に定義されたT細胞の伝達。 SCNT胚盤胞から派生したCD8 + T細胞と胚性幹細胞から生成された胚の絶対及び相対番号。 <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。SCNT胚性幹細胞を注入キメラマウスの代表的なフローサイトメトリー分析。ゲートと数字は（合計CD8 + T細胞あたりのパーセント）キメラマウスにおける特異的CD8 + T細胞の存在を示している。

<ol>
	<li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+recombination.">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li><li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements.">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li><li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li><li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer.">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li><li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type.">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li></ol>

我々は、SCNTが事前定義された特異性T細胞からtransnuclearマウスを生成するために使用できることをここに示している。ここには示されていませんが、テクニックは、事前定義された特異性を有するB細胞からtransnuclearマウスを生成するために利用できるようになるはずです。 考慮すべき重要な点は、感染や免疫や興味のTまたはB細胞を分離するために使用されるマウスの系統、性別、です。 TとB細胞は一般に非常に低い初期化の効率を持っているので、我々は、目的のハプロタイプのF1雑種を使用することをお勧めします。ドナー細胞はまた、性別を決定するので、我々は、雄マウスからT細胞またはB細胞を使用することをお勧めします。これは、唯一の雄キメラマウスが繁殖しやすく、高速であるという雄マウスで、生殖細胞系列を介してTCRやBCRを送信になってしまいます。 一緒になって、我々は、SCNTを介してそのエピジェネティックなリプログラミングが免疫学的フィールドの大きな利点となるのマウスモデルの新しいタイプを生成するための強力なツールを、表すと思う。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Red Blood Cell lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>REF 352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pregnant Mare Serum (PMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>367222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Chorionic Gonadotropin (HCG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>230734</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4272</td>
<td>Type IV-S</td>
</tr>
<tr>
<td>KSOM-AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-106-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCZB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-173-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ca-free medium for activation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-174-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>SrCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>255521</td>
<td>100mM = 10x</td>
</tr>
<tr>
<td>AlbuMAX I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11020-021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PVP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biotech</td>
<td>102787</td>
<td>Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I</td>
</tr>
<tr>
<td>Cytochalasin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C6762</td>
<td>500&mu;g/ml = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Trichostatin A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8552</td>
<td>5mM = 1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Holding needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>MPH-SM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection and transfer needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>4-15, 7-15, 15-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>14088-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>11251-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Wound Clip Applicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wound Clips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K871H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D6429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>15%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-602E</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>101806</td>
<td>200mM = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Aminoacids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140050</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985-023</td>
<td>5&mu;l in 500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1106</td>
<td>1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>MEK inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9900L</td>
<td>For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50&mu;M)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

transnuclear mice with pre-defined t cell receptor specificities against toxoplasma gondii obtained via scnt

T細胞のようなリンパ球は、、特定の特異性1の受容体を生成するために、遺伝V（D）J組換えを受ける。並び替え抗原特異的T細胞受容体（TCR）のためのトランスジェニックマウスは、T細胞の発達と機能を研究するために必要不可欠なツールでした。しかし、このようなTCRは、通常、多くの場合、不可避的に高い親和性とT細胞の選択を繰り返す抗原刺激、以下の長期培養後に、関連するT細胞から分離されています。 TCRのランダムゲノム統合α-およびβ-鎖と非内因性プロモーターからの発現は、発現レベルと動態の変動につながることができる。 体細胞核移植を介したエピジェネティックなリプログラミングは、関心のある任意のセルから胚性幹細胞とマウスを生成するツールを提供しています。エピジェネティックなマークがリセットされる間、その結果、SCNTは既知の特異性のT細胞に適用されるときに、これらの遺伝子のV（D）J再編成は、SCNT -胚性幹細胞（ES細胞）とそこから派生したマウスに転送されます。私たちは、 トキソプラズマ原虫に対する事前定義された特異性をもつT細胞が実験的に導入遺伝子を改変することなく、その内因性遺伝子座から特定 ​​のTCRを発現マウスモデルを生成するために使用できることを実証した。そのようなtransnuclearモデルを得ることができるとの相対的な容易さと速度は、他の疾患モデルの構築のための可能性を秘めています。

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Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

私たちは、体細胞核移植（SCNT）を介してエピジェネティックなリプログラミングが事前定義されたT細胞受容体（TCR）特異性を有するマウスモデルを生成するためのツールと​​して使用できることをここに示しています。これらtransnuclearマウスは、内因性プロモーターの制御下での内因性遺伝子座から対応するTCRを発現する。

に対する事前定義されたT細胞受容体の特異性をもつTransnuclearマウストキソプラズマ SCNTを介して取得

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

transnuclear-mice-with-pre-defined-t-cell-receptor-specificities

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

14.0K ビュー.  Whitehead Institute for Biomedical Research. 私たちは、体細胞核移植（SCNT）を介してエピジェネティックなリプログラミングが事前定義されたT細胞受容体（TCR）特異性を有するマウスモデルを生成するためのツールと​​して使用できることをここに示しています。これらtransnuclearマウスは、内因性プロモーターの制御下での内因性遺伝子座から対応するTCRを発現する。

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Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

高純度の取得トキソプラズマ</em不連続塩化セシウム勾配別>オーシスト

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

免疫・感染学

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

活性骨髄由来マクロファージとBradyzoite条件におけるトキソプラズマのシスト壁形成

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

分離するために遺伝学的スクリーニングトキソプラズマホストセル出口変異体

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

の遺伝的操作<em&gt;Δku80</emの機能ゲノム解析のための&gt;株<em&gt;トキソプラズマ</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

フォワード遺伝学は、識別するためのマクロファージを使用した画面<em&gt;トキソプラズマ</emIFN-γ依存性細胞自律イミュニティへの抵抗のための重要な&gt;遺伝子

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

自己免疫に対する幹細胞由来の抗原特異的制御性T細胞の開発

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of liver cancer. This is a major concern, especially in developing countries. Failure of the immune system to mount an effective response against HBV leads to chronic infection. Although HBV vaccine is present and novel antiviral medicines are being created, eradication of virus-reservoir cells remains a major health topic. Described here is a method for the generation of viral antigen (Ag) -specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) (i.e., iPSC-CTLs), which have the ability to suppress HBV replication. HBV replication is efficiently induced in mice through hydrodynamic injection of an HBV expression plasmid, pAAV/HBV1.2, into the liver. Then, HBV surface Ag-specific mouse iPSC-CTLs are adoptively transferred, which greatly suppresses HBV replication in the liver and blood as well as prevents HBV surface Ag expression in hepatocytes. This method demonstrates HBV replication in mice after hydrodynamic injection and that stem cell-derived viral Ag-specific CTLs can suppress HBV replication. This protocol provides a useful method for HBV immunotherapy.

Presented here is a protocol for the effective suppression of hepatitis B virus (HBV) replication in mice by utilizing adoptive cell transfer (ACT) of stem cell-derived viral antigen (Ag)-specific T lymphocytes. This procedure may be adapted for potential ACT-based immunotherapy of HBV infection.

幹細胞由来ウイルスAg特異的Tリンパ球はマウスにおけるHBV複製を抑制する

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...