We thank Michael Candlish for critical comments on the manuscript. This project was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft grants BO1743/6 and SFB/TRR 152 P11 and Z02 to Ulrich Boehm.

注：倫理声明：動物を対象とする手順は、ハンブルク大学とザールラント大学の動物福祉委員会によって承認された。 1.準備と胚組織の固定<ol><li>胚を解剖し、動物を犠牲にする前に、組織のその後の固定のためのソリューションを準備するために必要なすべての機器を配置します。 注：常に（pHを7.4に調整し、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％PFA）新鮮な4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を調製する。 </li><li>倫理的に承認された手順とタイミングを妊娠したメスのマウスを安楽死させる。 </li><li>プラットフォーム上にマウスを転送します。 70％エタノールで腹部の腹側を湿らせ、腹腔を露出させ、鋭いハサミを使って垂直切開する。 </li><li>胚チェーンを特定し、慎重に鈍鉗子を使用してそれを引き出し、氷冷PBSにそれを配置します。 </li><li>から個々の胚を削除する細かいハサミとピンセットを用いて、胚チェーン。胚の周りに余分な組織を除去し、氷冷PBSでそれらを洗ってください。 </li><li> （PFAに胚を転送する前に）小さな尾の生検を取り、性別の識別とトレーサー対立遺伝子の遺伝子型決定PCR用テール溶解バッファーでそれをインキュベートする。 </li><li>ほとんどの側面に胚か​​ら開始し、シェーカー上で氷の上の氷冷4％PFAを含むチューブに別々に各胚を移す。 </li><li>一定に振盪しながら氷上で1.5時間E13.5歳以下の年齢で胚を浸す。一定に振盪しながら氷上で2.5時間、年齢E14.5とE15.5で胚を浸す。 </li><li>胚の年齢E16.5歳以上の場合は、首を切るとPFA溶液に頭を浸漬する前に、外側の皮膚を除去。 E16.5胚の頭部が一定に振盪しながら氷上で4.5時間浸漬することができます。 </li><li>適切な固定後、氷冷PBSで胚を3回洗浄する。それらは沈むまで4℃でPBS溶液中の30％スクロース中に胚を移し下へ。 </li></ol> 2.凍結<ol><li>クライオ金型、クライオ手袋、フェザー級昆虫学鉗子、マーカーペン、最適切削温度化合物（OCT）：凍結プロセスを開始する前に必要なすべての材料を配置</li><li> （組織、日付と遺伝子型の向きに言及）恒久的なアルコール耐性マーカーでクライオモールドラベルを付けます。砕いたドライアイスのスラッシュとアイスバケットで100％エタノールを準備します。イソペンタンを含む内部のガラスビーカーを置きます。イソペンタンを冷却するために10分間待ちます。 </li><li>一方、ショ糖溶液から組織を除去する実験室のワイプを用いて組織の周りに余分なショ糖を拭き取る。組織をカバーするために十分な10月で予め標識低温金型に組織を移す。 10月中に気泡を避ける。特に組織の周りに。 </li><li>組織の損傷を避けるために、フェザー級昆虫学の鉗子を使用して、OCTで組織を向けます。クライオモルを転送することによって、凍結開始予め冷却したイソペンタン浴中dは。それが適切に凍結しないように10月にイソペンタンをかけないでください。 -80℃でアルミ箔とストア内のサンプルを包みます。 </li></ol> 3.凍結切片化<ol><li>クライオスタットを用いて、5のシリーズの中で14μmの薄い連続切片をカットし、免疫蛍光（IF）分析のためのSuperFrost®プラスガラススライド上に収集する。使用するまで-80℃でスライドを保管してください。 </li></ol>チラミドシグナル増幅（TSA）プロトコルを使用して4トレーサーの可視化<ol><li>染色に必要なバッファーと試薬を準備します。常に新鮮に利用当日にトリスNaClのトゥイーン（TNT）のバッファを準備します。 <ol><li> 1 Lの最終容量までのNaClとのddH 2 O 5の1 Mトリス塩酸pH7.5の、30ミリリットルの100ミリリットルを使用して、TNT緩衝液を準備する1ミリリットルピペットを用いてのTween 20の500を添加する。すべてのTween 20であることを保証するためにゆっくりとツイーン20を加え、上下に数回ピペットをフラッシュソリューション。 </li><li>ブロッキング試薬5グラムを追加1 Lの最終容量まで1 Mトリス塩酸pH7.5の、30のNaClとのddH 5 mlの2 Oの100ミリリットルを使用してトリスのNaClブロッキング（TNB）のバッファを準備します（付属キット）をゆっくりバッファに少しずつ攪拌しながら。 （これは30〜60分より長い時間がかかるべきではありません）完全にブロッキング試薬を溶解するために連続的に撹拌しながら55℃まで徐々にソリューションを熱し。均質な加熱は55℃の水浴を使用し達成するために。ソリューションは、乳白色に表示されます。使用する前に室温にソリューションを持参してください。長期保存のために-20℃で小分けし、保存。 </li><li>分子生物学/ HPLCグレードDMSO中（キットに付属）ビオチンチラミド試薬を再構成する。これに応じて、キットは、DMSOの適切な量は変化し得るために使用される。 4℃で保存溶液を保管してください。 注：それぞれのCreおよびR26対立遺伝子についてヘテロ接合性動物からの切片は、回路解析のために使用することができる。使用Sネガティブコントロールとして、それぞれ1 のCreまたは1 R26対立遺伝子を運ぶ同腹仔からections、。正確にダブルヘテロ接合動物からのスライドのようなネガティブコントロールスライドを扱います。また、ダブルヘテロ接合動物から一つの制御スライドを含むが、TSA試薬（増幅されていないコントロール）を除外。 </li></ol></li><li>鋭い新鮮なメスは、組織切片の周囲の過剰なOCTを除去し、PAPペンでセクションの周りに境界をマークする使用。 </li><li>室温（RT）で2〜3分間、スライドを乾燥させる。 5分ごとにTNTでRT 3Xでスライドを洗う。内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、氷冷メタノール中で0.3％H 2 O 2溶液中に室温で30分間スライドをインキュベートする。 </li><li>室温で5分間ごとに、PBSで洗浄3X。組織透過性のためにPBS中0.5％トリトンX-100で10分間インキュベートする。 5分ごとにTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 </li><li> TNBとのブロック30（スライドあたり、200〜300μlのブロッキング溶液）加湿チャンバー中室温で分。すべてのセクションが完全にTNBでカバーされていることを確認してください。スライドはステップ間で完全に乾くせてはいけない。 </li><li>過剰のブロッキングバッファーを切るとトレーサー認識する一次抗血清を適用するRTまたは一晩、4℃で2時間、TNB中に希釈し（1：1,000ヤギ抗WGA BLのため、1 15000ウサギGTT抗GFP）を。完全に組織切片（スライドあたり200〜300μl）をカバーするために十分なボリュームを使用してください。 注：ここで推奨プライマリ抗血清希釈液を調整しなければならないことがある。 </li><li> 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 </li><li> （：抗WGAのための500ウマ抗ヤギIgG、1：RTで1時間TNBにおける抗GFPのために5000ヤギ抗ウサギIgG 1）最初の抗血清のホストを認識し、ビオチン化二次抗血清でのセクションをインキュベートします。 </li><li> 5分で撹拌しながら、各RTでTNTを洗浄3X。 100ストレプトアビジン（SA）結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP、提供のWi：1でインキュベートする加湿チャンバー内で室温で30分間、TNB中キット）番目。 5分ごとにTNTでRT 3Xでスライドを洗う。一方、TSAを解凍。 </li><li> （キットに付属、BLの可視化とGTTのためのTSA +キット用TSAキットを使用）TSA増幅希釈剤中TSA 1:50に希釈する。 RTで正確に10分間、希釈したTSAでの組織切片をインキュベートします。使用直前にTSAを希釈し、理想的に前の洗浄工程の間に、将来の実験のために、残りの希釈されたTSA試薬を使用しないでください。常に新鮮な準備。 </li><li> 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 RTで30分間TNBで500のAlexa Fluor（登録商標）546ストレプトアビジンコンジュゲート：1でインキュベートする。 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 </li><li>核染色のために室温でPBS中の5％ビスベンズイミド溶液中で10分間インキュベートする。 5分で攪拌しながらそれぞれのTNTでRT 3Xでスライドを洗う。 Fluromount Gでマウントし、エピ蛍光または共焦点顕微鏡法を行う。 <em&gt;トラブルシューティング：トレーサー転送の有効性は、（使用のCreドライバ線によって決定される）を産生する細胞におけるROSA26遺伝子座の発現レベルに依存し、神経回路上（トレーサー、収束等の産生ニューロン数など ）を分析します。したがって、ここに推奨1次抗血清の希釈は、低または過剰な信号を防止するために調整されなければならない。背景は、常に適切な対照スライド（上記参照）を使用して分析されるべきである。 </li></ol>胚セクション5.τlacZ染色<ol><li>染色に必要なバッファーと試薬を準備します。常に新鮮に使用前のLacZバッファーCを準備します。 <ol><li> 1ミリリットルの70％ジメチルホルムアミド（DMF）のX-galを40gのを添加することにより5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（X-galの）ストック溶液（40 mg / mlの）を調製。長期保存のために-20℃でアルミホイルや店舗で覆い。 </li><li>準備し、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）番目1ミリリットルの70％DMFにNBTを50g添加することによりOCK溶液（50 mg / mlで）。長期保存のために-20℃でアルミホイルや店舗で覆い。 </li><li> LacZの25％グルタルアルデヒドを80μl、4％PFAの5ミリリットル、1 MのMgCl 2、最終的に最大500のEGTAを100μl、1ミリリットルM 1のリン酸緩衝液pH7.4とのddH 2 O20μlのを使用して固定液の準備容量10ml。 </li><li> LacZを500 mMのEGTAを用いて、1 mlの1 MのMgCl 2、5ミリリットル、500ミリリットルの最終容量までの1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）とのddH 2 Oを50mlのバッファ準備する。 </li><li> 1mlのMののMgCl 2、500 mMのEGTA 5mlの5mlの1％デオキシコール酸ナトリウム、10％のNP-40を100ml、50 1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）の溶液とのddH 2 Oを使用してLacZのバッファBを準備500ミリリットルの最終容量まで。 </li><li>使用直前に新鮮な作り、アルミホイルで覆ったLacZ緩衝液Bの1mlにNBTストック溶液10μlおよびX-galストック溶液12.5μLを添加することにより、LacZの緩衝液Cを調製する。 </li></OL&gt; </li><li> （その間PAPペンでスライドを準備する）は、少なくとも10〜15分間室温でスライドを乾燥させます。 </li><li> LacZのセクションでは、化学ヒュームフード内部の加湿チャンバー内で室温で2分間固定液固定する。 PBSで3回洗浄を、2mMのMgCl 2を補った。 </li><li> LacZを持つスライドを室温で10分間、3回ずつ洗浄緩衝液のLacZ緩衝液Aでスライドを洗浄します。 5分間ずつのLacZ緩衝液Bで2回洗浄する。加湿チャンバー内で6時間または一晩30〜37℃でのLacZ緩衝液Cでスライドをインキュベートする。 注：LacZのバッファCの十分なボリュームを追加します。スライドは、インキュベーション中に完全に乾くべきではありません。 </li><li>適切なインキュベーションの後、PBSでスライドを洗浄は、2のMgCl 2を補った。のddH 2 Oで簡単にセクションをすすぐマイヤーのグリシンゼラチンでカバースリップ。微分干渉コントラスト（DIC）イメージング·セットアップを搭載した光学顕微鏡に適しています。 </li></ol> 6. GENDERおよびトレーサージェノタイピング<ol><li> 10ミリリットルの最終容量を補うために、1Mトリス塩酸pH8.5の、500 mMのEGTA、10％SDS、5 M NaClおよびのddH 2 O400μlの200μlの100μlを1ミリリットルを使用してテール溶解バッファーを準備します。 </li><li>尾の生検を含む各エッペンドルフチュー​​ブにテール溶解バッファー500μlのを追加します。を100mg / mlの最終濃度にプロテイナーゼKを加える。 55℃でシェーカー上で一晩インキュベートする。 </li><li> RTで10分間、17000×gで遠心分離サンプル。新しい遠心チューブに上清を移し。上清に500μlのイソプロパノールを加える。アップ及びダウンチューブを反転させて、少なくとも5分間混ぜる。 </li><li> RTで5分間17000×gで遠心機でスピン。上清を注ぐ。 70％エタノール200μlを追加します。少なくとも5分間振る。 </li><li> 5分間17000×gで遠心分離する。ピペットマン（オフかけないでください）​​で上清を取り除きます。 15〜30分間のウォーム室（37℃）でペレットを乾燥させる。 </li><li> 100μlの再懸濁ペレット低TE pHが8.0または水の広口径フィルターチップを使用。適切な溶解に一晩で1時間、55℃に入れ、37℃で。 4℃で保存。 </li><li> PCR反応（尾DNA1μlの、各プライマー2.5μlのDMSO、10 PM、25の各dNTPμM、及び1Mベタインを含む50μlの反応混合物）のためのDNA1μlのを使用してください。ジェノタイピングと性別識別のためのPCRプライマーは、 マテリアルの表に記載されている。 </li></ol>

<ol>
	<li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals.">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li><li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse.">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li><li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. 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遺伝的に定義されたニューロン集団の神経回路をトレースする導入遺伝子として経シナプストレーサーを発現するトレーサーまたはneurotopicウイルスの定位注射と比較していくつかの利点を有する。まず、トレーサーは、内因性タンパク質として産生されるので、任意の免疫応答を誘発しないと選択的な神経経路は、再現性の高い別の動物で分析することができる。これは、非侵襲的な方法で...

解剖パストレースは、脳と行動1との間の関係を解読するための最も一般的に使用さツールの一つです。神経回路のトレース技術の進歩は、マウス2における遺伝的に特定されニューロン集団から神経回路をトレースする能力を持つ神経科学を授けている。これらの技術的進歩にもかかわらず、それは特に、胚成熟中の神経回路の形成を解明するために依然として厳しい。現在までに開発さトレースの方法の多くは経シナプストレーサーまたは遺伝的に改変された神経向性ウイルスの定位注射（ 図1）2,3に基づいているためである。これらの技術は、発達中の脳、注射部位の再現性、注射部位の電位の炎症と最もimporに、接続性の空間的および時間的分解能を達成するような技術的に困難なトレーサー注射などのいくつかの固有の制限ものの神経向性ウイルスによるtantlyの細胞毒性は、それらの使用4を制限する。 別の方法は、遺伝子改変マウスでの導入遺伝子として経シナプストレーサーを表明することにある。我々は最近、この手法を変更し、すべての遺伝的に特定されニューロン集団5の神経回路をマッピングするために、バイナリ遺伝経シナプストレーシングシステムを開発した。 Cre介在した後に私たちの実験的な戦略は、双方向のトレーサー大麦レクチン（BL）6またはROSA 26座からGFP（GTT）7に融合した逆行性トレーサー破傷風毒素フラグメントCのいずれかを発現する二つの新しいノックインマウス系統に基づいており、再結合。ここでは、選択的にキスペプチンを作る神経細胞のBLとGTT、生殖軸8,9の成熟の調節に関与している神経ペプチドを表現するために、これらのマウス系統を使用していました。我々は、この技術は、キスの発達および成熟を可視化するために適していることを証明する雌マウスの脳5の胚発生時にpeptin神経回路。 育種戦略 R26-BL-IRES-τlacZ（BIZ）とR26-GFP-TTC（GTT）トレーサーラインがノックインされた組換えROSA26対立遺伝子を運ぶ菌株5。 R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子は、2つのloxP部位5が隣接している強力な転写停止信号の存在に転写的に沈黙している。 BIZとGTT導入遺伝子の発現は、転写停止信号のCre媒介除去により活性化される。 R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子は、単にのCreドライバラインと交配することによって独立して使用することができる。分析動物についてそれぞれCreおよびR26対立遺伝子についてヘテロ接合を使用することができる。 1 のCreまたは1 R26対立遺伝子を有する同腹仔は、それぞれ、対照として使用されるべきである。あるいは、トンを生成することも可能であるノックインriple のCre、R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子を有する動物が、これは一つの追加のクロスが必要になります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="721">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">14530-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32205-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryo mold (Peel-a-way)</td>
			<td style="width:219px;">Polyscience Inc.</td>
			<td style="width:119px;">18646A-1</td>
			<td>22mm x 22mm x 20mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Formamide (DMF)</td>
			<td style="width:219px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">23470,293</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:219px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluoromount G</td>
			<td style="width:219px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34988-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isopentane (Methyl 2-butane)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kaiser&#39;s Glycine gelatin</td>
			<td style="width:219px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1092420100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">494437-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:219px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">HN00.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NBT</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">298-83-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nonidet P40 substitute</td>
			<td style="width:219px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">743.85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OCT</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PAP pen</td>
			<td style="width:219px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafarmaldehyde</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:219px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Superfrost slides</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FT4981GLPLUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TSA kit</td>
			<td style="width:219px;">PerkinElmer&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEL700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TSA plus kit</td>
			<td style="width:219px;">PerkinElmer&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NEL749A001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:219px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">AE15.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton-X 100</td>
			<td style="width:219px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">3051.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:219px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">9127.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">X-gal</td>
			<td style="width:219px;">ROTH</td>
			<td style="width:119px;">2315.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:219px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Light microscope equipped with DIC imaging&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Axioskop2 equipped with Axio Vision software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Fluroscence microscope</td>
			<td style="width:219px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Axioskop2 equipped with Axio Vision software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Photoshop</td>
			<td style="width:219px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;">PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-WGA (recognizes BL)</td>
			<td style="width:219px;">Vector Laboatories</td>
			<td style="width:119px;">AS-2024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotinylayted horse anti-goat IgG</td>
			<td style="width:219px;">Vector Laboatories</td>
			<td style="width:119px;">BA-9500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:219px;">Vector Laboatories</td>
			<td style="width:119px;">BA-1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)</td>
			<td style="width:219px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-GnRH</td>
			<td style="width:219px;">Affinity Bio Reagent</td>
			<td style="width:119px;">PA1-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dylight488-donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SA5-10038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SA-Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td>S-11225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL Fwd (for BIZ genotyping)</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2">&#160;ATGAAGATGATGAGCACCAG 
			GGC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL Rev&#160; (for BIZ genotyping)</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2">&#160;AGCCCTCGCCGCAGAACTC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cre Fwd&#160; (for Cre genotyping)</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2">GTCGATGCAACGAGTGATGAG 
			GTTCG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cre Rev&#160; (for Cre genotyping)</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2">CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTAC 
			ACCTGC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TTC Fwd&#160; (for GTT genotyping)</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2">AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TTC Rev&#160; (for GTT genotyping)</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2">GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCT 
			TGAA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XY Fwd (for gender genotyping)</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2">TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XY Rev&#160; (for gender genotyping)</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2">CCGCTGCCAAATTCTTTG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26 Fwd</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2">CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ROSA26 Rev</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2" style="width:285px;">GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">SA Rev</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td colspan="2" style="width:285px;">CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conditional genetic transsynaptic tracing in the embryonic mouse brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

このセクションでは、R26-BIZ（B L-I RES-τlacのZ）とR26-GTT（G FP-TT C）の対立と協力を得ることができる代表的な結果を示している。ここでは、生殖軸を調整する神経回路の成熟を ​​分析するためにR26-BIZとR26-GTT対立遺伝子を使用しています。脊椎動物で複製することは、中央ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）を分泌する視床​​下部ニューロンの?...

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Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.6K ビュー.  University of Saarland School of Medicine. Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution. 

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Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Cerebrospinal fluid (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is present during early vertebrate embryonic development and persists throughout life. Adult CSF is thought to cushion the brain, remove waste, and carry secreted molecules1,2. In the adult and older embryo, the majority of CSF is made by the choroid plexus, a series of highly vascularized secretory regions located adjacent to the brain ventricles3-5. In zebrafish, the choroid plexus is fully formed at 144 hours post fertilization (hpf)6. Prior to this, in both zebrafish and other vertebrate embryos including mouse, a significant amount of embryonic CSF (eCSF) is present . These data and studies in chick suggest that the neuroepithelium is secretory early in development and may be the major source of eCSF prior to choroid plexus development7.
eCSF contains about three times more protein than adult CSF, suggesting that it may have an important role during development8,9. Studies in chick and mouse demonstrate that secreted factors in the eCSF, fluid pressure, or a combination of these, are important for neurogenesis, gene expression, cell proliferation, and cell survival in the neuroepithelium10-20. Proteomic analyses of human, rat, mouse, and chick eCSF have identified many proteins that may be necessary for CSF function. These include extracellular matrix components, apolipoproteins, osmotic pressure regulating proteins, and proteins involved in cell death and proliferation21-24. However, the complex functions of the eCSF are largely unknown.
We have developed a method for removing eCSF from zebrafish brain ventricles, thus allowing for identification of eCSF components and for analysis of the eCSF requirement during development. Although more eCSF can be collected from other vertebrate systems with larger embryos, eCSF can be collected from the earliest stages of zebrafish development, and under genetic or environmental conditions that lead to abnormal brain ventricle volume or morphology. Removal and collection of eCSF allows for mass spectrometric analysis, investigation of eCSF function, and reintroduction of select factors into the ventricles to assay their function. Thus the accessibility of the early zebrafish embryo allows for detailed analysis of eCSF function during development.

We present a method to collect cerebrospinal fluid (CSF) and to create a system which lacks CSF within the embryonic zebrafish brain ventricular system. This allows for further examination of CSF composition and its requirement during embryonic brain development.

ゼブラフィッシュ胚の脳室の手動排水

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

神経科学

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

鳥類胚性内耳神経における聴覚繊維の選択的なトレース

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This approach has been most extensively used in the brain by utilizing the swine pathogen pseudorabies virus (PRV)1. PRV does not infect great apes, including humans, so it is most commonly used in studies on small mammals, especially rodents. The pseudorabies strain PRV152 expresses the enhanced green fluorescent protein (eGFP) reporter gene and only crosses functional synapses retrogradely through the hierarchical sequence of synaptic connections away from the infection site2,3. Other PRV strains have distinct microbiological properties and may be transported in both directions (PRV-Becker and PRV-Kaplan)4,5&#160;.&#160;This protocol will deal exclusively with PRV152. By delivering the virus at a peripheral site, such as muscle, it is possible to limit the entry of the virus into the brain through a specific set of neurons. The resulting pattern of eGFP signal throughout the brain then resolves the neurons that are connected to the initially infected cells. As the distributed nature of transsynaptic tracing with pseudorabies virus makes interpreting specific connections within an identified network difficult, we present a sensitive and reliable method employing biotinylated dextran amines (BDA) and cholera toxin subunit b (CTb) for confirming the connections between cells identified using PRV152. Immunochemical detection of BDA and CTb with peroxidase and DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) was chosen because they are effective at revealing cellular processes including distal dendrites6-11.

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...