我々は有用な議論のための全体Koshyラボを感謝。私たちは、イメージングとのアドバイスや助けをパティジャンスマとアリゾナ大学の神経科学省に感謝します。我々はまた、彼らのビブラトームを使用するためのPorrecaラボに感謝。この研究は、米国国立衛生研究所（NIH NS065116、AAK）によってサポートされていました。

注：マウスは、アリゾナ大学で食物および水を自由摂取との明/暗サイクルを逆に飼育し、12時間と温度及び湿度制御された部屋で維持した。実験はガイドラインとアリゾナ大学の制度的動物実験委員会の承認の下で行った。すべての努力は、苦痛を最小限にするために行われた。のCreレポーターマウスは、C57BL / 6バックグラウンド11上にあり、商業的に入手可能である。 1.マウスの感染注： - 12 トキソプラズマ後述でマウス感染の方法は、以前に10を発表された研究で使用されている。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>ヒト包皮線維芽細胞におけるトキソプラズマ株を成長ダルベッコ高グルコース中で培養（HFFS）がイーグル培地（DMEM）、10％FBS、100 U / mlのペニシリン、100mg / mlのストレプト変形omycin、および2mM L-グルタミン（CDMEM）、5％CO 2インキュベーター内部にT-25フラスコ中の寄生虫は、大きな寄生虫液胞を形成するまで。 </li><li>フラスコの底から細胞を掻き取り、フラスコの内側の3mlシリンジに接続された25ゲージの針に2回得られた溶液を通過させることによって、シリンジ放出寄生虫は、その27ゲージの針に接続された5ミリリットルの注射器の場合に、すべてのソリューションを転送する逆さまの15mlコニカルチューブ内部に配置されている。注射器にプランジャーを接続し、コニカルチューブに寄生虫ソリューションを渡す。 </li><li>遠心分離機300×gで10分間チューブ。上清はその後4〜6ミリリットルの滅菌USPグレード1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4（原液）にペレットを再懸濁吸引除去する。 </li><li>ストック溶液の10μLの血球計数器をセットし、寄生虫はミドル大きな正方形の四隅と中央の正方形で寄生虫の数をカウント後、決済するために5〜10分待ちます。 </li><li>パラを希釈100K /200μlの1×PBSの適切な接種サイズのサイトは、その後200μlの総容量で腹腔内（IP）をマウスに注射する。 注：この手順では、マウスを100KタイプIII（CEP）200μlの1×PBSで13タキゾイトを接種した。トキソプラズマの他の株をマウスに感染させる場合には、接種物の濃度は、毒性のレベルを考慮して調整される必要があり得る。 </li></ol> 2.灌流および脳収穫注：これはシストのピーク数がマウスの脳に見出されるが、他の時点が使用される時点を表すように、このプロトコルは、21日後に感染数（dpi）で行った。 17 -サイズ、数、位置、および嚢胞の有無マウス系統、寄生虫株型、ならびに接種サイズ7,14を含む多くの要因に依存する。調べでは、個別に、マウスとToxoplasのための適切な接種材料を決定する必要がありますMA株は彼/彼女が使用しています。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>セットアップすべての手術収穫ツール（ 図1）。 </li><li>各マウスについて、準備し、氷上に保つ：1X無菌のUSPグレードPBS（ヘパリン/生理食塩水）で0.9％の塩化ナトリウム（NaCl）を+ 10 U / mlのヘパリンで満たされた20mlの注射器。 4％パラホルムアルデヒド（PFA）を充填した20mlの注射器。 15ミリリットル、4％PFAでシンチレーションバイアル。複数のマウスの場合、各灌流のためのソリューションの完全な新鮮な注射器を策定した後、全てのマウスに必要な各溶液の全体量を満たしたビーカーを準備します。 </li><li>興味のある日に200μL/ケタミン/キシラジンのカクテルの体重の25グラム（24 mg / mlの＆4.8 mg / mlのそれぞれ）で、マウスの腹腔内麻酔。つま先ピンチ反射をチェックすることによって、麻酔のレベルのためのマウスを監視します。マウスがしっかりとつま先のピンチへの応答を示していないだけで、一度プロトコルを続行します。 注：麻酔の適切なレベルが前に到達するように、麻酔の他の方法があればよいプロトコルを進める。 </li><li>カバーされたフォームプラットフォーム上仰臥位でマウスを置きます。その後、70％エタノール（EtOH）（ 図2A）と胸部と腹部をスプレー足元にすべての4つの手足をピン。マウスの下のいくつかの滅菌ペーパータオルの添加は、灌流液のオーバーフローを吸収助けるために使用することができる。 </li><li>その後切開を作るためにハサミを使用してピンセットでちょうど胸骨下の皮膚を持ち上げます。胸（ 図2B）を露出するために皮膚を引き戻す。 </li><li>剣状突起を持ち上げて、ちょうど横隔膜下の腹部切開を行い、ぶっきらぼうに、振動板から離れて解剖された肝臓を露出させる。 2切開、左側の1と絞りを右肋骨の底に1を加えます。その後胸腔（ 図2C）を開くために戻って反映されている胸郭、約1 / 2-2 / 3の方法が左と右の切開を拡張します。 注：すべての臓器や主要な血管デュをカットしないように注意してください灌流の品質を損なうなりそうとして、この手順を鳴らす。 </li><li> 10〜20ミリリットル4％PFAに続く10〜20ミリリットルヘパリン/生理食塩水で経灌流。 注：灌流が適切に行われた場合、肝臓は赤から黄褐色（ 図2D）に変わります。適切に行われない場合は、血管が目に見える（ 図2E）となる。 </li><li>その腹部の上にマウスを裏返し、再びピンの足は、70％EtOHで頭と首をスプレー。首の付け根から肌を持ち上げて、切開する。頭蓋骨（ 図2F）を露出するために皮膚を削除します。肩のレベルで頭を首を切る。頭蓋骨を外し、静かに脳を削除し、4％PFA（ 図2G-H）で満たされたシンチレーションバイアルに配置します。 注：よく灌流した場合、脳は目に見える血管（ 図2I）と白表示されます。脳が十分に灌流されていない場合は、血管が目に見える（ 図2J）となる。 </li><li> Scintillaのを置きます4℃で4％PFA中脳とションバイアルを一晩、光から覆った。非USPグレード1X PBS中に脳をすすぎ、チルド1×PBSで満たされた新しいシンチレーションバイアルに移す。光からカバーし、4℃で1×PBS中の脳を、保管してください。 注：成功清算およびイメージングは​​、最大1ヶ月1X PBS中に保存セクションで達成されてきたが、PBSで長期保存がPFA固定を逆にすると、最適な画像を以下につながる可能性としては、数日以内に脳セクションに最適です。自家蛍光の増加ブラーは1ヶ月以上のための1×PBSで貯蔵した後に画像化され、いくつかのセクションに記載されています。 </li></ol> 3.脳セクショニング<ol style="margin-left: 40px;"><li> 1×PBSから脳を取り出し、脳を通してカットしても、より正確で可能にするために、脳のマトリックス（ 図3A）にそれを配置します。存在する場合、小脳および嗅球を切り落とす、その後2または3つのセクションに冠状脳をカット。 <brは/&gt;注：トリミング及び脳の切断は、脳マトリックスを用いずに行うことができる。冠状に切断部の数は、使用されているビブラトームの切削距離に依存する。矢状及び冠状切片が、最も一般的に神経解剖学的同定のために使用されても脳には、任意の方向に切断することができる。 </li><li>シアノアクリレートで試料取付ブロックの上にそれぞれの脳切片を貼付。サポートのための脳切片（ 図3B）の後ろに5％のアガロースゲルの小さなブロックを貼付。 注：他の支持機構を用いることができるが、サポートなし、ビブラトームムラセクショニングを引き起こす脳に押すことができる。 </li><li>ビブラトームとの厚いセクションでは、4の速度と9の振幅に設定さ160ミクロン（イメージングに使用目的の作動距離）に組織を切断。 注：速度及び振幅の設定があっても、滑らかな部分を得るために使用される特定のマシンに応じて調整することができる。設定がある場合正しくない場合、結果は不均一な切片、組織またはびびりマークの引き裂きすることができる。 </li><li>彼らは1週間以内にクリアしようとしている場合には、新鮮な、冷蔵1×PBSで満たされたシンチレーションバイアルに組織切片を収集します。の項では、1週間以内にクリアする予定がない場合は、-20℃で凍結保存液と店舗で満たさ1.5ミリリットルのマイクロチューブに場所セクション。 </li></ol>脳組織切片の4オプティカルクリア注：このプロトコルは、以前に公開されたメソッド8から変更されている。 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1×PBS + 2％のTween-20（胃腸/ PBST）中で25％、50％、75％及び90％容量/容量のグリセロールを準備する。 </li><li>凍結保存剤であれば、1×PBSですすぎ、25％GL / PBSTの10ミリリットルを含むシンチレーションバイアルに移し、1×PBSからセクションを削除するか。 12時間、暴露からの光に覆われて4℃でシェーカー、の上に置いてバイアル。 </li><li>すべてのセクションは、BOに沈んでいることを確認してくださいバイアルのttom。の項では、その後12時間、光への暴露からカバーし、4℃でシェーカー上で10ミリリットル50パーセントGL / PBSTでバイアルと場所を埋めるカバーするだけの十分な残して、25％のGL / PBSTを吸引。 75％のGL / PBSTその後90％のGL / PBSTこのプロセスを繰り返します。最大のクリアリングに到達するために24時間90％のGL / PBST中のセクションのままにしておきます。クリア処理の過程で、緩やかな光学クリアします（ 図4）を観察。 注：セクションでは、バイアルの底に沈んでた後に解決策がすぐに変更された場合は、このプロセスが迅速ことができる。 75パーセント＆90％のソリューションでは、セクションでは、すべての方法をバイアルの底に沈むことはありませんが、途中でフロートします。 </li></ol> 5.取付脳組織切片<ol style="margin-left: 40px;"><li>スペーサーを作成するために5個に第1.5カバースリップをカット。 図5（a）に示す点線に沿ってカバースリップを獲得し、破壊するために定規とダイヤモンドひっくり返された鉛筆を使用してください。破棄トン彼は、作品を中心にウィンドウを作成するために、プレーンガラススライド上に4アウターピースを配置してから、正しい構成（ 図5B）でスライドにスペーサーの部分を接着するために縫い目上に明確なマニキュアを磨く。 NOTE：スペーサスライドクリア部分を取り付けるためのカバーガラスの間に必要なスペースを作成するために使用される。カバーガラスは、必要な任意のサイズのウィンドウを作成するための様々な方法で切断されてもよい。プレカット発泡スペーサーも市販されている。マニキュアが完全に乾燥させるためには、少なくとも1日前取付部にスペーサーを有するスライドを作るのがベストです。 </li><li>先端がプラスチック製のトランスファーピペットを用いてスライドに転写部を切断。 90％のGL / PBSTで周辺地域に記入してください。慎重に確認してくださいすべての気泡を導入しないことセクション上にカバースリップを下げる。過剰GL / PBSTは糸くずの出ないワイプで離れて吸い上げてよい。 </li><li> RFP +を含む画像は、GFP +ニューロン<em&gt;共焦点顕微鏡すぐに（ 図7A-B）、ストアのスライドを平らにし、4℃で光からカバーとトキソプラズマ嚢胞。 注：あるいは、シールは保存し、後で画像化するために、すべてのエッジの周りに完全にスライドさせる。スライドをシールする明確なマニキュアの使用はオプションであり、1つは、さらなる処理のため、後日スライドからセクションを削除した場合、それがより困難にカバースリップを削除することがあります。 </li></ol> 6.イメージング注：すべての顕微鏡は、高解像度のzスタックを取得する能力を有することを使用することができる。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>当初は10倍で、焦点面を見つけた後、20Xの目的に変更し、GFP +細胞の内側に位置する嚢胞を識別するためにセクションをスキャン。視野内の関心領域（ROI）を中心。 </li><li>対物レンズ40倍に変更します。ことを確認するためにROI全体を通して上下にフォーカス細胞全体とCYSTは、表示されます。 注：画像は、40X / 1.30オイルDIC M27の目的とした共焦点顕微鏡を用いて得られた。 </li><li>インストールイメージングソフトウェアを使用して、嚢胞全体セルを含むzスタックを得る。画像を得るために使用される平均の設定は、図6に示されている。 NOTE：設定は、各研究者の組織切片を、顕微鏡能力に応じて調整する必要がある。 </li><li> 64への投影の数を設定することにより、完全な回転のビューを取得し1に投影数を設定することにより、zスタックの最大投影画像を得る。 注：他のソフトウェアパッケージが利用可能であり、最大値投影、回転ならびにzスタック画像の他のビューを得るために使用することができる。 </li><li>画像解析ソフトで画像を分析します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS.">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li><li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+transmission,+diagnosis+and+prevention.">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li><li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine,+even+after+extensive+parasite+clearance.">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246 (2013).</li><li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade.">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. 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S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites,+bradyzoites,+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts.">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .</li><li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases.">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li><li>Berenreiterov&#225;, M., Flegr, J., Kub&#283;na, A., N&#283;mec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis:+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis.">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925 (2011).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice.">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li><li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+agents+and+neurodegeneration.">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li><li>Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. 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著者らは、開示することは何もない。

感染した宿主細胞における細胞変化は、HIV、狂犬病、およびクラミジア18,19などの他の細胞内生物による感染症の疾患転帰にリンクされていることを考えると、私たちは私たちがCNSとの間で発生する親密な相互作用を研究することを可能にする技術を開発セルおよびトキソプラズマを開催。ここで説明する方法は、慢性的に感染した神経細胞の効率的なイメージングを可能にす...

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 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

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Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

この方法の全体的な目標は、高解像度、偏性細胞内寄生トキソプラズマ原虫に感染した個々のニューロンの三次元画像を得ることである。 トキソプラズマは、しばしば人間とげっ歯類が含まれ、その大きな中間宿主域、の中で最も成功した寄生虫の一つと考えられている。ヒトとげっ歯類の両方で、汚染された食物や水の摂取を通じて、急性感染後、 トキソプラズマがフォームをそのスロー複製にその速い複製形（タキゾイト）からの変換とシスト化によってCNSの持続感染を引き起こすことが可能である（ブラディゾイト）。免疫応答性個体では、この潜在的な中枢神経系の感染は比較的無症候性であると考えられているが、そのようなエイズ患者や移植レシピエントとして免疫無防備状態の個体では、寄生虫の再燃は、致命的なトキソプラズマ脳炎1,2につながることができます。加えて、最近の研究ヘクタールメカニズムは不明であるもののトキソプラズマと潜伏感染は、げっ歯類3,4における行動の変化につながる可能性があることを示したVEの。 驚くべきことに、CNS- トキソプラズマ相互作用の重要性を強調し、これらのデータにもかかわらず、比較的少ない、特に、細胞および分子レベルで、この関係について知られている。脳寄生虫相互作用のさえ単純な側面を研究する能力は、科学技術の限界によって一部に妨げられてきた。例えば、ニューロンは、嚢胞が持続する細胞であることを示す研究の大半は、電子顕微鏡（EM）5,6を用いて行われてきた。 EMは、高解像度を与えるが、それは時間がかかり、労働集約的で、かつ高価である。免疫蛍光（IF）アッセイは、最近、EM 7によって行われた作業を確認するために、共焦点顕微鏡と組み合わせて使用されてきた。アッセイは、実行することが技術的に容易で、比較的安価な、しかしアンダーにこれらの技術を使用している場合嚢胞、感染したニューロン間の空間的関係は、時間がかかるもの、シリアル再建を必要とする技術的に困難であり、貴重な情報の損失につながる可能性がTAND。したがって、我々は、CNSトキソプラズマ症のマウスモデルで使用し、EMまたは免疫組織化学（IHC）のない画像に感染した神経細胞の全体を私たちを可能にすることができる方法を開発した。このような技術を開発することにより、我々は、比較的迅速かつ安価な方法で感染細胞とシストの間に細胞の関係を探求し始めることができます。 私たちが開発した方法は、寄生虫タンパク質9,10に注入された生体細胞内のマークシステムと共焦点顕微鏡8による光学的にクリアとイメージング厚い脳切片の新しい技術を組み合わせたものです。このシステムでは、我々はトキソプラズマとのCre介在組換え後の11緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するのCreレポーターマウスを感染</em&gt;赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現する宿主細胞9にCreリコンビナーゼを注入菌株。この組み合わせは、私たちはCNS感染が確立された後、感染したマウスの脳を収穫厚い脳切片を切断し、そして迅速にRFP +嚢胞を見つけることによって、画像に関 ​​連する領域を特定することができる。これは、GFPの宿主細胞発現はGFP +細胞の数は、寄生虫10が含まれていない、感染に寄生虫のCreの注入のみに依存する、としないように留意することが重要である。ニューロン-このプロトコルの目的は、画像全体に感染したニューロンにできることがあるので、焦点は唯一のもRFP +嚢胞が含まれていますが、プロトコルは、GFP + / RFPイメージにも使用することができ、GFP +ニューロンにある。 感染した脳を採取し、区分された後、切片をグリセロールクリアで透明なレンダリングされます。セクションの適切な領域は、その後、共焦点顕微鏡、らで撮像する感染した宿主細胞、および、それらの全体がシスト寄生虫のlowing前例のない可視化。ここでは、識別するための完全なプロトコル、光学的にクリアリング、およびイメージング感染ニューロンを提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:265px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1008px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Series 1000 Sectioning System</td>
			<td>Technical Products International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Other vibratomes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#1.5 Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond Scriber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52865-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaject&#174; Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml</td>
			<td>Western Medical Supply, Inc.</td>
			<td>4165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed&#174; Injection Xylazine 20mg/ml</td>
			<td>Lloyd Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZsGreen Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>7906</td>
			<td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These are primary cells from human foreskins.&#160; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Penicillin Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">200mM L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">25cm2 Canted neck flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1012639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade</td>
			<td>amresco</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:265px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:135px;">H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">20ml Disposable Scintillation Vials</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">FS74500-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td>
			<td style="width:265px;">In-house</td>
			<td>17212945</td>
			<td>This product is purchased from an in-house stockroom.&#160; Other companies are compatible.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Imaris Software</td>
			<td style="width:265px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Clear nail polish</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">10ml Syringe with Luer-Lok</td>
			<td style="width:265px;">VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td>Other syringes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Three-way Stopcock</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25G x 12&#34; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td>
			<td style="width:265px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">450099</td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

トキソプラズマは、ヒト及びげっ歯類を含む広い宿主範囲、との偏性細胞内寄生虫である。ヒトとげっ歯類の両方で、 トキソプラズマは脳内の生涯持続感染を確立します。この脳の感染はほとんどの免疫担当の人で無症候性ですが、発育中の胎児や、後天性免疫不全症候群（AIDS）患者などの免疫無防備状態の個体では、脳内のためと永続この偏愛は壊滅的な神経疾患につながることができます。このように、脳- トキソプラズマ相互作用はトキソプラズマによって生成症候性疾患に重要である、まだ我々は、中枢神経系（CNS）および寄生虫の細胞との間の細胞または分子相互作用をほとんど理解していることは明らかである。 CNSのマウスモデルでは、それが神経細胞は寄生虫が解決している細胞であることを30年以上にわたって知られているが、ほとんど情報がどの程度利用可能であるトキソプラズマ症ニューロンの一部は、一般的に（ソーマ、樹状突起、軸索）を感染していると、この細胞の関係は、株の間で変更された場合。一部では、この欠如は、撮像の困難に二次であり、動物からの全感染ニューロンを可視化する。このような画像は、典型的には、連続切片および電子顕微鏡または免疫染色後に共焦点顕微鏡で画像化した組織のステッチを必要とするであろう。いくつかの技術を組み合わせることにより、ここで説明する方法は、免疫染色を必要とせずに個体、慢性的に感染した神経細胞の三次元可視化および解析を可能にする、厚い部分（160ミクロン）の使用は、嚢胞を含む全細胞を同定し、画像を可能にする、電子顕微鏡法、または連続切片とステッチ。この技術を用いて、寄生虫、感染したニューロン間の細胞の関係を理解し​​始めることができます。

図7は、2つの異なる160μmの厚さの切片だけでなく、 図7Bのための嚢胞対細胞体からの距離の代表的測定から2嚢胞含有GFP +ニューロンの代表的な画像が含まれています。7 AとBは 、この新しいことを示してプロトコルは、その全体が感染したニューロンの可視化を可能にする。 図7Cは、この撮像技術では、嚢胞...

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3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

このプロトコルを使用して、我々は、シスト化の寄生虫と感染したニューロン間の空間的関係の可視化と分析を可能にする寄生虫トキソプラズマに感染したマウスからの画像160の厚さの脳切片することができました。

感染ニューロンの3-Dイメージングと分析<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;トキソプラズマ</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K ビュー.  University of Arizona. このプロトコルを使用して、我々は、シスト化の寄生虫と感染したニューロン間の空間的関係の可視化と分析を可能にする寄生虫トキソプラズマに感染したマウスからの画像160の厚さの脳切片することができました。 

ビデオ: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

神経科学

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

電位感受性色素を持つカニ口と胃の神経節における神経細胞の光学的イメージング

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

商工会議所のコンポーネントとマルチスケール光イメージングの3次元印刷を組み込むColliculo、視床皮質マウス脳スライスの変更、

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

生体内でマルチ モーダル イメージングとマウス レーザー誘発脈絡膜新生血管モデルの解析

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.