この記事は、NSERCグラント＃299280、M.シールに学部学生研究賞としてG.の親とFRSQへの奨学金としてIRSSTによってサポートされていました。我々はビデオに記録された操作を実行するためのYoanレミュー- Lanevilleに感謝。

<html>どんな操作する前に、あなたが行っている実験と処分で装置に応じて使用される腱のグループを識別する必要があります。彼らは小さいと断面積を測定し、バイオリアクターチャンバーにそれらをフィットする際に操作するため、容易であるため、我々の目的のために、腹側腱が選ばれました。 すべての楽器はオートクレーブまたは70％エタノールで滅菌されていることに注意してください。また、70％エタノールを含むスプレーボトルは、各操作の前に実験者の手袋を消毒するために、各ワークステーションの横に配置されて。 パート1：抽出切除後、尾は慎重に組織の損傷を防ぐために、その四肢によって操作されます。また、細胞の生存率を節約するために、すべての操作は冷生理食塩水で実施されています。 1A）材料： <ul><li>冷たい生理食塩水（D - PBS） </li><li>クラッシュアイス</li><li>表面プロテクター</li><li>まな板</li><li>個々の操作プレート</li><li> 2 500ミリリットル料理</li><li> 2 2Lガラスの皿</li><li>接着テープ</li><li> 1ピンセット</li><li> 1鉗子</li><li> 1ピンセットスタンド</li><li>外科鋏の1ペア</li><li> 1メス</li><li>手術用ハサミの1ペア <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="図1" /> 図1の向きの識別による個別操作（&quot;近位&quot;は&quot;P&quot;） </li></ul> 1B）ワークステーション： <ol><li>表面プロテクターを広げ、その上にまな板を置く。 </li><li>砕いた氷を半分に、それぞれ2つの大型ガラス皿を記入し、紙の上に置きます。 </li><li>操作板の角にテープを貼り、近位端を示すために文字で識別する。 </li><li>冷食塩水で半分に二つの小さなガラスの皿と操作板のすべての溝を埋める。氷を含む大規模なガラスの皿に置いてください。 </li><li>表面の保護上のすべての滅菌機器を整理する。 </li><li>生理食塩水を含むガラス皿の一つに尾を移す。 </li></ol> 1C）操作： <ol><li>背側から腹側を区別するために尾の近位端の解剖学的構造を観察。腹側には、腱と優しく血液の小さな滴を生成するために尾を絞って検証することができる血管の大きい数を持っています。 </li><li>あなたが腹腱を（またはあなたが背腱が必要な場合は、腹側に沿って）抽出する場合は、外科はさみを使用して、尾の背側に沿って皮膚をカット。 </li><li>近位端で切開を開き、慎重にテールの端を操作することにより、鉗子またはあなたの指を使って皮膚を削除し、。 </li><li>生理食塩水で血液や髪を洗い流すと、新鮮な溶液を含む残りのガラス皿に試料を移す。手袋を変更します。 光学顕微鏡下で観察横断セクションは、6つの腱のグループを示しています。各グループから1つの腱は、それぞれの脊椎骨の尾側端に取​​り付けられているので、カットに沿って新たな腱を公開するために椎間板でカットされます。 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。光学顕微鏡下で観察したラットの尾部の横断セクション。 </li><li>外科はさみで短く軟骨2〜3椎骨を通して遠位端をカット。メスを用いて軟部組織を切断してすぐに溶液中でそれを置き換えるためにまな板の上の尾を置きます。 </li><li>ピンセットを使用して、遠尾部の端から一腱を引き出します。 </li><li>両端にある穏やかなホールドで、個々の操作板に腱を配置。 それ以上腱まで、最後の2つの手順を繰り返しますが出からかわれ、新しい組織が露出する必要があればoneの椎骨を短くカットすることができます。 </li></ol>パート2：断面積の測定7 組織が機械的特性評価や刺激を受けるとき、その機械的性質は、ストレスに腱の内部に力を正規化して記述されています。これは、我々は断面積を評価する理由です。 2A）材料： <ul><li>光マイクロメータ</li><li>実体顕微鏡</li><li>デジタルカメラ</li><li>エッジ認識とプロファイルの再構成アルゴリズム5,6 </li><li>冷たい生理食塩水（D - PBS） </li><li> 1 20 -200μLマイクロボリュームのピペット</li><li>光学マイクロメータの調整のための1 16進数のキー</li><li> 2ピンセット / files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg&quot;ALT =&quot;図3&quot;/&gt; 図3。光学マイクロメータ</li></ul> 2B）ワークステーション： <ol><li>ソフトウェア（デジタルカメラおよびアルゴリズム）を開きます。 </li><li>装置の腱をロードするのに十分な余地があるように、光マイクロメータを配置。 </li><li>楽器や手元に置いて抽出した腱を含むガラス皿を整理する。 </li></ol> 2C）操作： <ol><li>両方のアンカーシステムが水没するまで冷生理食塩水で測定する区画を埋める。 </li><li>ピンセットで端を保持してコンパートメントに腱を転送します。 </li><li>マイクロボリュームピペットを介して吸引を使用して、シリコンチューブに一度に四肢を引く。端がシャフトのカラーを超えたまで吸引する。 </li><li>チューブを圧縮し、実体顕微鏡下で装置をインストールするには、シャフトのカラーを締めます。 </li><li>折り目はもはや知覚されなくなるまで組織を観察しながら、105Xの倍率で、腱を伸ばす。追加の0.40パーセントでストレッチ。 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：前と延伸後の105x倍率で腱投影。 </li><li>位置を調整し、180 °回転以上腱の鮮明な画像を維持するために焦点を当てる。 </li><li>緊張、フォーカスや位置を変更せずにすべての10 °の回転で写真を撮る。ローテーションを実施する唯一の回転軸を使用してください。その円錐形のために、これらの手順は、腱に沿って異なる点で繰り返すことができます。 </li><li>あなたが登録したデータベースを分析するために、エッジの認識と、プロファイルの再構成アルゴリズムをアクティブにします。 </li><li>シャフトのカラーを緩めて、マイクロボリュームのピペットを用いてシリコンチューブに空気を吹き付けることによって腱を解放する。 </li><li>再び端でそれを処理、操作プレートの上に腱を挿入しなおす。 </li><li>得られたプロファイルの再構成と断面積の値の形状を確認してください。 </li></ol>パート3：すすぎ前回の操作中に発生した汚染物質を除去するために、組織は、バイオセーフティーキャビネットでリンスする。 3A）材料： <ul><li>冷たい生理食塩水（D - PBS） </li><li>複数の溝操作プレート</li><li>個々の操作プレート</li><li>接着テープ</li><li> 2ピンセット</li><li> 1ピンセットスタンド</li></ul> 3B）ワークステーション： <ol><li>事前にバイオセーフティキャビネット15分でファンをオンにし、70％エタノールで内側の表面をきれいに。 </li><li>バイオセーフティキャビネット内のすべての楽器を持参してください。 </li><li>近位端を識別するために、個々のプレートの角の上にテープの断片を貼り付けてください。 </li><li>滅菌生理食塩水で、全ての溝を埋める。 </li></ol> 3C）操作： <ol><li>キャビネットで抽出された腱を含む操作のプレートを導入する。 </li><li>ピンセットを使用して、両端にある穏やかな把握と、そのプレートから腱を取り外します。 </li><li>浸すと優しく近いから開始し、遠い溝に進む、複数の溝操作プレートの各区画の生理食塩水で腱をかき混ぜる。 </li><li>最後に、水没個々の操作板の腱。 </li></ol>第4部：バイオリアクターチャンバーにロードさらなる汚染を避けるために、以下の操作は、バイオセーフティーキャビネットで行われます。 4A）材料： <ul><li>バイオリアクターチャンバー4 </li><li>無菌アンカー</li><li> 1滅菌ペトリ皿</li><li>コー​​ルド細胞培養培地（DMEM） </li><li>シアノアクリレート</li><li> 2ピンセット</li><li>ピンセットスタンド</li><li> 0.5 -10μlのマイクロボリュームピペット</li><li> 1ルーラー <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。リアクターチャンバー</li></ul> 4B）ワークステーション： <ol><li>前のステップはまた生物学的安全キャビネット内に実現されて以来、不必要なツールの除去はより多くの作業スペースを与える。 </li><li>キャビネット内部のすべての他の楽器を持参してください。 </li></ol> 4C）操作： <ol><li>腱四肢上の中心と組織を巻き上げ、そのスプールにとスプール周りの操作板の上にアンカーを置きます。 </li><li>アンカーをロールオーバーし、組織がアンカーに接続されているとどまることを確保しながらゆるい四肢を開催。 ¾ターン後に停止します。 </li><li>同じことを行うもう一方の端でのステップ。 </li><li>それらのセンター1間は6センチメートルになるまで均等に上の両方のアンカーをロールバックします。 </li><li>溶液に浸漬し、固定されたセクションは、その機械的性質2-3を強化するために一時的に乾燥させるため腱を緩めます。 </li><li>シャーレにシ​​アノアクリレート注ぐとマイクロボリュームのピペットに2.5μLを描く。 </li><li>生理食塩水内の任意の接着剤を落とすことなく、傷アップの組織へのシアノアクリレートのドロップを適用します。 2滴を各アンカーに適用されるまで繰り返します。 </li><li>腱がまだ完全に浸漬して、完全に乾燥するために接着剤を5分待ちます。 </li><li>この時間の間に、生理食塩水でチャンバー区画を埋める。 </li><li>損傷を防ぐために、生理食塩水ですべての組織を再水和。 </li><li>唯一のアンカーを操作することにより、バイオリアクターチャンバーに腱を転送し、転送中に漏れや汚染を防ぐために、それを閉じます。 </li></ol>パート5：代表的な結果： プロトコルの結果が正しく実行されたときに、私たちの組織厳密な分離と準備手順は、組織の無菌性、生存性および完全性を維持する事を可能にしていることを示しています。 最初に、単純で反復的な抽出法を用いて、我々はそれを抽出後に実現したH＆E汚染されたセクションの顕微鏡分析によって観察することができるようにコラーゲンのネットワークにダメージを与えることなく、尾腱を抽出することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="図6" /> 図6。解凍後の腱コラーゲンのネットワーク（H＆Eで染色さ5μmの縦断面図）。 最大10日と実施された無菌試験のために我々は、その後、培養腱。毎日、我々は、メッキは、寒天培地上に培養液を使用し、24時間のためにそれをインキュベートした。は細菌の増殖が観察されなかったので、我々の操作は汚染が発生しないと結論付けた。 プロファイルの再構成アルゴリズムと光学マイクロメータで、我々は、エラー7の2％のマージン内に断面積を推定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="図7" /> 図7。RTTのプロフィール再建。 最後に、我々は、洗浄ステップの後および12日間の培養期間後に、哺乳動物細胞用LIVE / DEADバイアビリティ/細胞毒性キットを使用して実行可能性を評価した。緑色蛍光生細胞の大多数が明白だったので、我々は分離法が生きている組織を維持に成功していることを確認することができます。同試験は、バイオリアクターチャンバーに腱をアタッチした後、二時間を実施した。我々は、アンカーで脱水し、接着剤が両方アンカーの間の組織に広がっていなかったことを確認。 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="図8" /> 図8。アンカーでの組織の生存率（緑=生細胞、赤=死細胞）

<ol>
	<li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons.">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li><li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> D&#233;shydratation de matrices collag&#233;niques reconstruites in vitro: effets sur les propri&#233;t&#233;s m&#233;caniques et histologiques [dissertation]. , 114-114 (1981).</li><li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon.">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li><li>Hupp&#233;, N., Lessard, J. -. L., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Design+for+the+Mechanobiological+Study+of+Soft+Tissue+Damage+and+Repair+in+Conditions+that+Provide+the+Best+Approximation+of+Actual+Use.">A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use.</a> , (1985).</li><li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements.">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li><li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues.">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li><li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Techniques+for+the+Evaluation+of+Cross-Sectional+Area+in+Rat+Tail+Tendons+Generate+Significant+Errors.">Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors.</a> , (1985).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

これらの実験手順を適用することにより、我々は組織のこの種のin vitro試験での多種多様を行うことができます。例として、組織の変性に関する研究は10日間の期間のためのラウンドトリップ時間に下の刺激のアプリケーションによって行われました。毎日、我々は非破壊応力緩和試験では組織の機械的特性を評価した。終わりに、我々は、RTT応力変化を観察するため、機械的性...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-PBS </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>311-410-CL</td>
<td>Saline solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc. </td>
<td>609-037-EL </td>
<td>Saline solution
 1g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics </td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062 </td>
<td>Saline solution
 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>12800-017</td>
<td>Culture solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>600-105-CG</td>
<td>Culture solution 3.7g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>090150</td>
<td>Culture solution 10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062</td>
<td>Culture solution 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Optic Micrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulation plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioreactor chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies

ラット尾腱（ラウンドトリップ時間）は、腱生理学と腱の分野でのin vitro研究で実験に使用される一般的な生物学的なモデルです。これらの組織での作業は、彼らは非常に壊れやすいので、挑戦、そして今まではその分離には厳密に詳細なプロトコルはなかったさ。 これらの課題に直面し、我々は、ラウンドトリップ時間と制御の組織の生存性、無菌性と整合性の操作を容易にするための方法と手段を開発している。この記事では、生体力学とmechanobiological研究のためのRTTを準備するために使用される実験手順を説明します。バイオリアクターチャンバーに洗浄し、ロード、抽出、断面積の測定：私たちの仕事は主に4つのステップに分かれています。 それらは簡単に再現できるように、各ステップで、すべての手順、材料や操作を詳細に表示されます。また、開発された特定の楽器が紹介されています：RTTのを分離するために使用される操作板は、断面積の測定や、アンカーのシステムの間に組織を配置する光学マイクロメータは、バイオリアクターへのRTTを添付すること。 最後に、我々は我々の方法を検証するために複数のテスト後に得られた結果を説明します。実行可​​能性、滅菌性および完全性の評価は、私たちの手続きは、このようなラット尾腱のような脆弱な組織の操作のための十分に厳格であることを示している。

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Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

この記事では、生体力学とmechanobiological研究のためにラット尾腱を調製するのに使用される実験手順を説明します。準備の主要なステップのいくつかの機能は、すすぎとバイオリアクターチャンバーにロードし、抽出、断面積の測定をはじめ、実証されています。

生体力学とMechanobiological研究ラット尾腱の準備

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K ビュー.  Université de Sherbrooke. この記事では、生体力学とmechanobiological研究のためにラット尾腱を調製するのに使用される実験手順を説明します。準備の主要なステップのいくつかの機能は、すすぎとバイオリアクターチャンバーにロードし、抽出、断面積の測定をはじめ、実証されています。

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Interview: Protein Folding and Studies of Neurodegenerative Diseases

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

インタビュー：タンパク質フォールディングと神経変性疾患の研究

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the ...

生物学

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

ニューロンとグリアの開発研究ラットの脳の集計文化の調製

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  Following division, these cells migrate posteriorly, where FGF diffusing from the retina induces them to differentiate into a posterior array of elongated lens fiber cells, which compose the bulk of the lens.  Differentiation of lens epithelial cells into lens fibers can be induced in vitro by culturing explants of the central region of the anterior epithelium in the presence of FGF-2.  Explants are prepared from lenses of neonatal rats by removing the lens from the eye and grasping the lens capsule on the posterior side with dissecting tweezers.  The posterior capsule is then gently torn open and pressed down into the plastic bottom of a tissue culture dish. The peripheral regions of the explant are removed with a scalpel and the central area is then cultured in the presence of 100ng/ml FGF-2 for as long as 2-3 weeks, depending on the parameters to be studied.  Since epithelial cells in cultured explants differentiate in approximate synchrony over a period of days to weeks, the time course of signaling and gene expression can be determined using molecular, biochemical, and pharmacological techniques.  Immunofluorescence microscopy is a powerful adjunct to these methods as it demonstrates the subcellular localization of proteins of interest and can reveal the physiological consequences of experimental manipulations of signaling pathways.

Explants of the central region of rat lens epithelia differentiate synchronously when cultured in the presence of FGF-2. Immunofluorescence microscopy of such cultures can provides novel information about gene expression and signaling events associated with terminal differentiation.

最終分化を研究するための準備とラットの水晶体上皮外植片の培養

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

ミトコンドリアは密結合のラットの心臓の準備

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

哺乳類の全胚培養に適したラット血清の調製

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

ラットの外側尾静脈から血液をサンプリング

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Methods Article

生体力学とMechanobiological研究ラット尾腱の準備