Este artículo fue apoyada por NSERC # 299280 Grant, IRSST como una beca para los padres y G. FRSQ como un premio de investigación de estudiantes de pregrado de M. Cyr. Damos las gracias a Yoan Lemieux-Laneville para realizar las manipulaciones grabadas en video.

<html> Antes de cualquier manipulación, debe identificar el grupo de tendones que se utilizan en función de la experiencia que están llevando a cabo y el aparato a su disposición. Para nuestros propósitos, los tendones ventral fueron elegidos porque son más pequeños y por lo tanto más fáciles de manipular en la medición de la sección transversal y ajustándolas a la cámara del biorreactor. Tenga en cuenta que todos los instrumentos son esterilizados en autoclave o con etanol al 70%. Por otra parte, una botella de aerosol que contiene 70% de etanol se coloca al lado de cada estación de trabajo para esterilizar los guantes experimentadores antes de cada operación. Parte 1: Extracción Después de la resección, la cola es cuidadosamente manipulada por sus extremos para evitar daños en los tejidos. Además, para conservar la viabilidad celular, todas las manipulaciones se llevan a cabo en solución salina fría. 1A) Materiales: <ul><li> Solución salina fría (D-PBS) </li><li> Hielo picado </li><li> Superficie protectora </li><li> Tabla de cortar </li><li> Manipulación de las placas individuales </li><li> 2 500 platos ml </li><li> Dos platos de vidrio 2L </li><li> Cinta adhesiva </li><li> 1 Pinzas </li><li> 1 pinza </li><li> 1 Pinzas de pie </li><li> 1 par de tijeras quirúrgicas </li><li> Un bisturí </li><li> 1 par de tijeras quirúrgicas <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Manipulación individual con la identificación de la orientación (&quot;P&quot; de &quot;proximal&quot;) </li></ul> 1B) Estación de trabajo: <ol><li> Hacia fuera el protector de la superficie y el lugar de la tabla de cortar en la parte superior. </li><li> Llene cada dos grandes platos de cristal a la mitad con hielo picado y colócalos en el papel. </li><li> Pegue un pedazo de cinta adhesiva en una esquina de la placa de la manipulación y se identifican con una letra para indicar el extremo proximal. </li><li> Llena los dos platos pequeños de cristal a mitad de camino y todas las ranuras de las placas de la manipulación con la solución salina fría. Colocarlos en los platos de cristal grande que contenga hielo. </li><li> Organizar todos los instrumentos estériles en el protector de la superficie. </li><li> La transferencia de la cola en uno de los platos de vidrio que contiene una solución salina. </li></ol> 1C) Manipulaciones: <ol><li> Observar la anatomía en el extremo proximal de la cola para distinguir la cara ventral de la parte dorsal. La cara ventral tiene un mayor número de tendones y los vasos sanguíneos que puede ser verificado por una leve presión en la cola para producir pequeñas gotas de sangre. </li><li> Con las tijeras quirúrgicas, cortar la piel a lo largo de la cara dorsal de la cola, si se desea extraer los tendones ventral (oa lo largo de la parte ventral si necesita los tendones dorsales). </li><li> Abrir la incisión en el extremo proximal y quitar la piel con las pinzas o los dedos y por la manipulación cuidadosa de los extremos de la cola. </li><li> Enjuague la sangre y el pelo en la solución salina y la transferencia de la muestra en el plato de cristal restante que contiene una solución fresca. Cambiar los guantes. Una sección transversal se observa bajo microscopio de luz se muestran los grupos tendón de seis años. Un tendón de cada grupo se adjunta al final de cada vértebra caudal, por lo que cortar en el disco intervertebral para exponer los tendones nuevo a lo largo del corte. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Sección transversal de la cola de rata se observa bajo el microscopio óptico. </li><li> Corte el extremo distal a través del cartílago 2-3 vértebras más corta con tijeras quirúrgicas. Coloque la pieza en el tablero para cortar los tejidos blandos utilizando un bisturí y luego inmediatamente a colocarlo en la solución. </li><li> Con unas pinzas, sacar un tendón de la parte final distal. </li><li> Con un agarre suave en ambos extremos, el lugar del tendón en la placa de manipulación individual. Repita los dos últimos pasos hasta que no los tendones más se pueden extraer y cortar una vértebra más corto cada vez que nuevos tejidos necesitan ser expuestos. </li></ol> Parte 2: corte transversal medida del área 7 Cuando el tejido se somete a la caracterización mecánica o la estimulación, sus propiedades mecánicas están especificadas por la normalización de la fuerza en el interior del tendón con el estrés. Esta es la razón por la que evaluar la sección transversal. 2A) Materiales: <ul><li> Micrómetro óptico </li><li> Estereomicroscopio </li><li> Cámara digital </li><li> Borde de reconocimiento y los algoritmos de reconstrucción perfil 5,6 </li><li> Solución salina fría (D-PBS) </li><li> 1 20-200μL Micro pipetas de volumen </li><li> Una llave hexagonal de ajuste micrómetro óptico </li><li> 2 pinzas / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. Micrómetro óptico </li></ul> 2B) Estación de trabajo: <ol><li> Abra el software (Cámara digital y algoritmos). </li><li> Coloque el micrómetro óptico de modo que haya espacio suficiente para cargar el tendón en el aparato. </li><li> Creación de los instrumentos y el plato de vidrio que contiene los tendones extraídos a mano. </li></ol> 2C) Manipulaciones: <ol><li> Llenar el compartimiento de medición con una solución salina fría hasta que los dos sistemas de anclaje están sumergidos. </li><li> Transferencia del tendón en el compartimiento mediante la celebración de los extremos con unas pinzas. </li><li> Mediante succión a través de la micropipeta de volumen, sacar un extremo a la vez en el tubo de silicona. Aspirar hasta el final se extiende más allá de los cuellos del eje. </li><li> Apretar los collares de eje para comprimir los tubos e instalar el aparato bajo el microscopio estereoscópico. </li><li> Con una ampliación de 105X, estirar los tendones mientras se observa el tejido hasta que las arrugas ya no son perceptibles. Tramo adicional de 0,40%. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Proyección del tendón con un aumento de 105x, antes y después del estiramiento. </li><li> Ajuste la posición y el enfoque para mantener una imagen clara del tendón en un rotación de 180 °. </li><li> Tomar una foto en cada rotación de 10 ° sin necesidad de modificar la tensión, el enfoque o la posición. Utilice sólo el eje de rotación para llevar a cabo la rotación. Debido a su forma de cono, estos pasos se pueden repetir en diferentes puntos a lo largo del tendón. </li><li> Activar el reconocimiento de borde y los algoritmos de reconstrucción de perfil con el fin de analizar la base de datos que ha registrado. </li><li> Libre del tendón aflojando los cuellos del eje y el soplado de aire en los tubos de silicona con la pipeta el volumen de micro. </li><li> Vuelva a insertar el tendón en la placa de la manipulación, una vez más la manipulación por los extremos. </li><li> Verificar la forma de la reconstrucción perfil obtenido y el valor de la sección transversal. </li></ol> Parte 3: Enjuague Para eliminar la contaminación que pueda haber ocurrido durante las manipulaciones anteriores, los tejidos se lavan en gabinete de bioseguridad. 3A) Materiales: <ul><li> Solución salina fría (D-PBS) </li><li> Múltiples ranura manipulación placa </li><li> Manipulación de las placas individuales </li><li> Cinta adhesiva </li><li> 2 pinzas </li><li> 1 Pinzas de pie </li></ul> 3B) Estación de trabajo: <ol><li> Encender el ventilador en el gabinete de bioseguridad 15 minutos de antelación y limpiar las superficies interiores con etanol al 70%. </li><li> Traiga todos los instrumentos dentro de la cabina de bioseguridad. </li><li> Palo trozos de cinta en una esquina de cada placa individual para identificar el extremo proximal. </li><li> Llenar todas las ranuras con una solución salina estéril. </li></ol> 3C) Manipulaciones: <ol><li> Introducir la placa de la manipulación que contiene el tendón extraído en el gabinete. </li><li> Con unas pinzas, quite el tendón de su plato con una comprensión suave en cada extremo. </li><li> Sumerja y revuelva suavemente el tendón en la solución salina en cada compartimento de la placa de la manipulación de múltiples ranuras, a partir de la más cercana y de proceder a la ranura más lejana. </li><li> Por último, se sumergen en el tendón de una placa de manipulación individual. </li></ol> Parte 4: Carga en la cámara de biorreactor Para evitar una mayor contaminación, las manipulaciones siguientes también se llevó a cabo en la cabina de bioseguridad. 4A) Materiales: <ul><li> Biorreactor de 4 cámaras </li><li> Ancla estéril </li><li> Una placa de Petri estéril </li><li> Media celda fría cultivo (DMEM) </li><li> Cianoacrilato </li><li> 2 pinzas </li><li> Pinzas de pie </li><li> 0.5-10μl de micro-pipeta de volumen </li><li> 1 Regla <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Biorreactor de cámara </li></ul> 4B) Estación de trabajo: <ol><li> Desde el paso anterior se realizó también en gabinete de bioseguridad, la eliminación de herramientas innecesarias le dará más espacio de trabajo. </li><li> Lleve todos los otros instrumentos en el interior del gabinete. </li></ol> 4C) Manipulaciones: <ol><li> Coloque un ancla en la placa de la manipulación con su carrete centrado sobre el extremo del tendón y la herida de tejido y alrededor de la bobina. </li><li> Rodar el ancla más y mantener la extremidad suelta al tiempo que garantiza que el tejido permanece unida al ancla. Parar después de ¾ de vuelta. </li><li> Llevar a cabo la mismapasos con el otro extremo. </li><li> Rollo de los dos anclajes en igual hasta que es de 6 cm entre sus centros 1. </li><li> Afloje el tendón que lo sumergen en la solución y permitir que las secciones anclado en seco breve para mejorar sus propiedades mecánicas 2.3. </li><li> Vierta cianoacrilato en la placa de Petri y sacar 2.5μL en la pipeta de volumen micro. </li><li> Aplique una gota de cianoacrilato para el tejido de la herida, sin dejar caer el pegamento en la solución salina. Repita la operación hasta 2 gotas se han aplicado a cada ancla. </li><li> Con el tendón todavía completamente sumergido, espere 5 minutos para que el pegamento se seque por completo. </li><li> Durante este tiempo, para llenar el compartimiento de cámara con solución salina. </li><li> Rehidratar todo el tejido con una solución salina para evitar daños. </li><li> Sólo mediante la manipulación de las anclas, la transferencia del tendón en la cámara de bioreactor y cerrarlo para evitar fugas y la contaminación durante la transferencia. </li></ol> Parte 5: Resultados del representante: El resultado del protocolo muestra que cuando se realiza correctamente, el aislamiento del tejido riguroso procedimiento de preparación que sea posible para mantener la esterilidad del tejido, la viabilidad y la integridad. En primer lugar, utilizando el método de extracción simple y repetitivo, que son capaces de extraer los tendones de cola sin dañar la red de colágeno, ya que puede ser observado por un análisis microscópico de las secciones de H &amp; E contaminada se dio cuenta después de la extracción. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Red de colágeno del tendón después de la extracción (5μm sección longitudinal teñidos con H &amp; E). A continuación, los tendones se cultivaron durante un máximo de diez días y llevó a cabo pruebas de esterilidad. Cada día, plateado solución utilizada cultivo en agar y se incubó durante 24 horas. Dado que no se observó el crecimiento bacteriano, llegamos a la conclusión de que nuestras manipulaciones no dan lugar a la contaminación. Con el algoritmo de reconstrucción de perfil y un micrómetro óptico, podemos estimar el área transversal dentro de un margen de error del 2% 7. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Reconstrucción perfil de un RTT. Finalmente, se evaluó la viabilidad de usar el LIVE / DEAD viabilidad / citotoxicidad kit de células de los mamíferos después del paso de enjuague y después de un período de cultivo de doce días. Dado que una gran mayoría de verde fluorescente las células vivas se hicieron evidentes, podemos afirmar que nuestros procedimientos de aislamiento tienen éxito en la preservación de los tejidos vivos. La misma prueba se llevó a cabo dos horas después de fijar el tendón en la cámara del biorreactor. Se verificó que la deshidratación y la cola en el ancla no se había extendido en el tejido entre los dos anclajes. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Viabilidad de los tejidos en el ancla (verde = células vivas, rojo = las células muertas)

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	<li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons.">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li><li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> D&#233;shydratation de matrices collag&#233;niques reconstruites in vitro: effets sur les propri&#233;t&#233;s m&#233;caniques et histologiques [dissertation]. , 114-114 (1981).</li><li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon.">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li><li>Hupp&#233;, N., Lessard, J. -. L., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Design+for+the+Mechanobiological+Study+of+Soft+Tissue+Damage+and+Repair+in+Conditions+that+Provide+the+Best+Approximation+of+Actual+Use.">A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use.</a> , (1985).</li><li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements.">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li><li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues.">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li><li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Techniques+for+the+Evaluation+of+Cross-Sectional+Area+in+Rat+Tail+Tendons+Generate+Significant+Errors.">Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors.</a> , (1985).</li></ol>

Mediante la aplicación de los procedimientos experimentales, podemos realizar una gran variedad de estudios in vitro de este tipo de tejidos. Como por ejemplo, un estudio sobre la degeneración de los tejidos se llevó a cabo mediante la aplicación de los menores de la estimulación de RTT por un período de diez días. Cada día, se evaluaron las propiedades mecánicas del tejido en los ensayos no destructivos de relajación de tensiones. Al final, hemos sido capaces de observar la variación de estrés RTT ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-PBS </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>311-410-CL</td>
<td>Saline solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc. </td>
<td>609-037-EL </td>
<td>Saline solution
 1g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics </td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062 </td>
<td>Saline solution
 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>12800-017</td>
<td>Culture solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>600-105-CG</td>
<td>Culture solution 3.7g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>090150</td>
<td>Culture solution 10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062</td>
<td>Culture solution 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Optic Micrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulation plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioreactor chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies

Tendones cola de rata (RTT) son un modelo común biológicos utilizados en la experimentación en estudios in vitro en los campos de la fisiología del tendón y tendinitis. Trabajar con los tejidos es un reto porque son muy frágiles, y hasta ahora no había protocolo rigurosamente detallado de su aislamiento. Frente a estos desafíos, hemos desarrollado métodos e instrumentos para facilitar la manipulación de RTT y el tejido de control de la viabilidad, la esterilidad y la integridad. En este artículo se describen los procedimientos experimentales utilizados para preparar RTT para los estudios biomecánicos y mechanobiological. Nuestro trabajo se divide en cuatro etapas: extracción, corte transversal medida del área, el enjuague y la carga en la cámara del biorreactor. En cada paso, todos los procedimientos, materiales y manipulaciones se presentan en detalle para que puedan ser fácilmente reproducidas. Por otra parte, los instrumentos específicos desarrollados se presentan: una placa de manipulación utilizados para separar RTT, un micrómetro óptico para colocar el tejido en la medida del área transversal y un sistema de anclaje para fijar la RTT en un biorreactor. Por último, se describen los resultados obtenidos después de múltiples pruebas para validar nuestros métodos. Evaluaciones de la viabilidad, la esterilidad y la integridad demostrar que nuestros procedimientos sean lo suficientemente rigurosos para la manipulación de los tejidos delicados, como los tendones de cola de rata.

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Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

En este artículo se describen los procedimientos experimentales utilizados para preparar los tendones cola de rata para los estudios biomecánicos y mechanobiological. Varias características de los principales pasos en la preparación se ha demostrado, a partir de la extracción, corte transversal medida del área, el enjuague y la carga en la cámara del biorreactor.

Preparación de los tendones Cola de Rata de Estudios biomecánicos y Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K vistas.  Université de Sherbrooke. En este artículo se describen los procedimientos experimentales utilizados para preparar los tendones cola de rata para los estudios biomecánicos y mechanobiological. Varias características de los principales pasos en la preparación se ha demostrado, a partir de la extracción, corte transversal medida del área, el enjuague y la carga en la cámara del biorreactor.

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Interview: Protein Folding and Studies of Neurodegenerative Diseases

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

Entrevista: plegamiento de proteínas y Estudios de Enfermedades Neurodegenerativas

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Investigación

Biología

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Preparación de las Culturas Rata total del cerebro de las neuronas y la glía de Estudios para el Desarrollo

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  Following division, these cells migrate posteriorly, where FGF diffusing from the retina induces them to differentiate into a posterior array of elongated lens fiber cells, which compose the bulk of the lens.  Differentiation of lens epithelial cells into lens fibers can be induced in vitro by culturing explants of the central region of the anterior epithelium in the presence of FGF-2.  Explants are prepared from lenses of neonatal rats by removing the lens from the eye and grasping the lens capsule on the posterior side with dissecting tweezers.  The posterior capsule is then gently torn open and pressed down into the plastic bottom of a tissue culture dish. The peripheral regions of the explant are removed with a scalpel and the central area is then cultured in the presence of 100ng/ml FGF-2 for as long as 2-3 weeks, depending on the parameters to be studied.  Since epithelial cells in cultured explants differentiate in approximate synchrony over a period of days to weeks, the time course of signaling and gene expression can be determined using molecular, biochemical, and pharmacological techniques.  Immunofluorescence microscopy is a powerful adjunct to these methods as it demonstrates the subcellular localization of proteins of interest and can reveal the physiological consequences of experimental manipulations of signaling pathways.

Explants of the central region of rat lens epithelia differentiate synchronously when cultured in the presence of FGF-2. Immunofluorescence microscopy of such cultures can provides novel information about gene expression and signaling events associated with terminal differentiation.

Preparación y Cultura de la lente explantes Rata epiteliales para el estudio de la diferenciación terminal

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Preparación de corazón de rata altamente acoplado mitocondrias

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparación de suero de rata Adecuado para mamíferos Whole cultivo de embriones

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola de la rata

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...