Cet article a été appuyé par le CRSNG # 299280 Grant, IRSST comme une bourse d&#39;études pour les parents et le FRSQ G. comme une bourse de recherche étudiant de premier cycle à M. Cyr. Nous remercions Yoan Lemieux-Laneville pour effectuer les manipulations enregistrées sur vidéo.

<html> Avant toute manipulation, vous devez identifier le groupe de tendons à être utilisés en fonction de l&#39;expérience que vous menez et l&#39;appareil à votre disposition. Pour nos besoins, les tendons ventrale ont été choisis parce qu&#39;ils sont plus petits et donc plus faciles à manipuler lors de la mesure de la section transversale et leur montage dans la chambre de bioréacteur. S&#39;il vous plaît noter que tous les instruments sont stérilisés à l&#39;autoclave ou 70% d&#39;éthanol. Par ailleurs, un vaporisateur contenant de l&#39;éthanol à 70% est placé à côté de chaque station de travail pour stériliser les gants expérimentateurs avant chaque opération. Partie 1: Extraction Après résection, la queue est soigneusement manipulé par ses extrémités pour éviter d&#39;endommager les tissus. Aussi, pour conserver la viabilité des cellules, toutes les manipulations sont effectuées dans une solution saline froide. 1A) Matériaux: <ul><li> Froid solution saline (D-PBS) </li><li> Glace concassée </li><li> Surface protecteur </li><li> Planche à découper </li><li> Plaques manipulation individuelle </li><li> 2 500 plats ml </li><li> 2 plats en verre 2L </li><li> Ruban adhésif </li><li> 1 Pince à épiler </li><li> 1 pince </li><li> 1 Pince debout </li><li> Une paire de ciseaux chirurgicaux </li><li> 1 Scalpel </li><li> 1 paire de ciseaux chirurgicaux <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Manipulation individuelle avec l&#39;identification d&#39;orientation (&quot;P&quot; pour &quot;proximale&quot;) </li></ul> 1B) station de travail: <ol><li> Etalez le protecteur de surface et le lieu de la planche à découper sur le dessus. </li><li> Remplir chaque verre de plus de deux plats à moitié avec de la glace pilée et les placer sur le papier. </li><li> Collez un morceau de ruban sur un coin de la plaque de manipulation et d&#39;identifier avec une lettre pour indiquer l&#39;extrémité proximale. </li><li> Remplissez les deux plats de petit verre à mi-course et tous les rainures des plaques de manipulation avec une solution saline froide. Placez-les dans des plats en verre de grande taille contenant de la glace. </li><li> Organiser tous les instruments stériles sur le protecteur de surface. </li><li> Transférer la queue dans l&#39;un des plat en verre contenant une solution saline. </li></ol> 1C) Manipulations: <ol><li> Observez l&#39;anatomie à l&#39;extrémité proximale de la queue de distinguer la partie ventrale de la face dorsale. La face ventrale a un plus grand nombre de tendons et un vaisseau sanguin qui peut être vérifié en pressant doucement la queue pour produire de minuscules gouttes de sang. </li><li> En utilisant les ciseaux chirurgicaux, couper la peau le long de la face dorsale de la queue, si vous voulez extraire les tendons ventrale (ou le long de la face ventrale si vous avez besoin des tendons dorsaux). </li><li> Ouvrez l&#39;incision à l&#39;extrémité proximale et enlever la peau à l&#39;aide de forceps ou vos doigts et en prenant soin de manipuler les extrémités de la queue. </li><li> Rincez le sang et les cheveux dans la solution saline et le transfert de l&#39;échantillon dans le plat en verre contenant une solution restante frais. Changer de gants. Une section transversale considérée sous microscopie optique montre les groupes tendon six. Un tendon de chaque groupe est attaché à l&#39;extrémité caudale de chaque vertèbre, donc on coupe au disque intervertébral pour exposer les tendons le long de la nouvelle coupe. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Coupe transversale de la queue du rat vu en microscopie optique. </li><li> Coupez l&#39;extrémité distale du cartilage de 2-3 vertèbres courtes avec des ciseaux chirurgicaux. Placez la queue sur le plateau de coupe pour couper les tissus mous à l&#39;aide d&#39;un scalpel, puis immédiatement à le remplacer dans la solution. </li><li> En utilisant une pince à épiler, retirez un tendon de la queue distale. </li><li> Avec une prise douce aux deux extrémités, placez le tendon dans la plaque de manipulation individuelle. Répétez les deux dernières étapes jusqu&#39;à ce que ne tendons plus peut être taquiné et couper court à chaque fois une vertèbre de nouveaux tissus ont besoin d&#39;être exposée. </li></ol> Partie 2: mesure de la superficie transversale 7 Quand le tissu est soumis à la caractérisation mécanique ou de stimulation, ses propriétés mécaniques sont décrits en normalisant la force à l&#39;intérieur du tendon au stress. C&#39;est pourquoi nous évaluons section transversale. 2A) Matériaux: <ul><li> Micromètre optique </li><li> Stéréomicroscope </li><li> Appareil photo numérique </li><li> Edge et la reconnaissance des algorithmes de reconstruction Profil 5,6 </li><li> Froid solution saline (D-PBS) </li><li> 1 pipette de 20 200 pl de volume micro </li><li> Une clé hexagonale pour les réglages du micromètre optique </li><li> 2 pinces / Files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figure 3 &quot;/&gt; Figure 3. Micromètre optique </li></ul> 2B) station de travail: <ol><li> Ouvrez le logiciel (appareil photo numérique et algorithmes). </li><li> Placer le micromètre optique afin qu&#39;il y ait assez de place pour charger le tendon dans l&#39;appareil. </li><li> Organiser les instruments et un plat en verre contenant les tendons extrait à portée de main. </li></ol> 2C) Manipulations: <ol><li> Remplir le compartiment de mesure avec une solution saline froide jusqu&#39;à ce que les deux systèmes d&#39;ancrage sont submergés. </li><li> Transfert du tendon dans le compartiment en tenant les extrémités avec des pincettes. </li><li> L&#39;utilisation de la pipette d&#39;aspiration par l&#39;intermédiaire de micro-volume, tirez une extrémité à un moment dans le tube de silicone. Aspirer jusqu&#39;à la fin s&#39;étend au-delà les cols de l&#39;arbre. </li><li> Serrer les colliers d&#39;arbre pour compresser les tubes et d&#39;installer l&#39;appareil sous la loupe binoculaire. </li><li> A un grossissement de 105X, étirer les tendons tout en observant le tissu jusqu&#39;à ce que le plis ne sont plus perceptibles. Étirez par additionnels de 0,40%. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Projection à un grossissement de 105x tendon avant et après étirement. </li><li> Ajustez la position et de se concentrer pour maintenir une image claire du tendon au cours d&#39;une rotation de 180 °. </li><li> Prenez une photo à chaque rotation de 10 °, sans modifier la tension, l&#39;accent ou la position. Utilisez uniquement l&#39;arbre rotatif pour effectuer la rotation. Grâce à sa forme conique, ces étapes peuvent être répétées à différents points le long du tendon. </li><li> Activer la reconnaissance de pointe et les algorithmes de reconstruction de profil dans le but d&#39;analyser la base de données que vous avez enregistrés. </li><li> Libre le tendon en desserrant les colliers d&#39;arbre et soufflant de l&#39;air dans les tubes de silicone à l&#39;aide de la pipette du volume micro. </li><li> Réinsérer le tendon sur la plaque de la manipulation, à nouveau sa manipulation par les extrémités. </li><li> Vérifiez la forme de la reconstruction de profil obtenu et la valeur de la zone de coupe. </li></ol> Partie 3: Rinçage Pour éliminer la contamination qui pourrait avoir eu lieu pendant les manipulations précédentes, les tissus sont rincés sous l&#39;enceinte de sécurité biologique. 3A) Matériaux: <ul><li> Froid solution saline (D-PBS) </li><li> Plaque de manipulations multiples rainures </li><li> Plaques manipulation individuelle </li><li> Ruban adhésif </li><li> 2 pinces </li><li> 1 Pince debout </li></ul> 3B) station de travail: <ol><li> Allumez le ventilateur dans l&#39;enceinte de sécurité biologique 15 minutes à l&#39;avance et nettoyer les surfaces à l&#39;intérieur avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Apportez tous les instruments à l&#39;intérieur du poste de sécurité microbiologique. </li><li> Coller des morceaux de ruban adhésif sur un coin de chaque plaque d&#39;identifier l&#39;extrémité proximale. </li><li> Remplissez tous les rainures avec une solution saline stérile. </li></ol> 3C) Manipulations: <ol><li> Introduire la plaque contenant la manipulation du tendon d&#39;extraits de l&#39;armoire. </li><li> En utilisant une pince à épiler, retirez le tendon de son assiette avec une prise douce à chaque extrémité. </li><li> Plongez et remuer doucement le tendon dans la solution saline de chaque compartiment de la plaque de la manipulation de multiples rainures, à partir de la plus proche et de procéder à la rainure plus loin. </li><li> Enfin, immerger le tendon dans une plaque de manipulation individuelle. </li></ol> Partie 4: Chargement en bioréacteur Pour éviter une nouvelle contamination, les manipulations suivantes sont également menées dans le cabinet de biosécurité. 4A) Matériaux: <ul><li> Bioréacteur chambre 4 </li><li> Ancres stérile </li><li> Une boîte de Petri stérile </li><li> Moyen de cellules en culture froide (DMEM) </li><li> Cyanoacrylates </li><li> 2 pinces </li><li> Brucelles debout </li><li> 0.5-10 ul micro-pipettes de volume </li><li> Une règle <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Bioréacteur </li></ul> 4B) station de travail: <ol><li> Depuis l&#39;étape précédente a également été réalisé en enceinte de sécurité biologique, l&#39;enlèvement d&#39;outils inutiles vous donnera plus d&#39;espace de travail. </li><li> Apportez tous les autres instruments à l&#39;intérieur du coffret. </li></ol> 4C) Manipulations: <ol><li> Placez un point d&#39;ancrage sur la plaque de la manipulation avec son tiroir centré sur l&#39;extrémité du tendon et le tissu enroulé et autour de la bobine. </li><li> Rouler l&#39;ancre sur et maintenez l&#39;extrémité libre tout en s&#39;assurant que le tissu reste attaché à l&#39;ancre. Arrêt après ¾ de tour. </li><li> Effectuer les mêmesétapes avec l&#39;autre extrémité. </li><li> Rouler les deux ancres plus égale jusqu&#39;à ce qu&#39;il y est de 6 cm entre leurs centres 1. </li><li> Desserrez le tendon de l&#39;immerger dans la solution et permettre les sections ancré à sécher brièvement pour améliorer ses propriétés mécaniques 2-3. </li><li> Verser dans le plat cyanoacrylate Pétri et dessinez 2.5μL dans la pipette du volume micro. </li><li> Appliquez une goutte de cyanoacrylate au tissu liquidé sans laisser tomber la colle dans la solution saline. Répétez l&#39;opération jusqu&#39;à 2 gouttes ont été appliquées à chaque point d&#39;ancrage. </li><li> Avec le tendon reste complètement immergé, attendre 5 minutes pour que la colle sèche complètement. </li><li> Pendant ce temps, remplir le compartiment de chambre avec une solution saline. </li><li> Réhydrater les tissus avec une solution saline pour éviter tout dommage. </li><li> En manipulant que les ancres, le transfert du tendon dans la chambre de bioréacteur et le fermer pour empêcher les fuites et la contamination pendant le transfert. </li></ol> Partie 5: Résultats du représentant: Le résultat du protocole montre que lorsqu&#39;elle est effectuée correctement, notre isolement rigoureux et tissus procédure de préparation permettent de maintenir la stérilité des tissus, la viabilité et l&#39;intégrité. Tout d&#39;abord, en utilisant la méthode d&#39;extraction simple et répétitive, nous sommes en mesure d&#39;extraire tendons de queue sans endommager le réseau de collagène comme il peut être observé par une analyse microscopique des sections H &amp; E contaminé réalisé après l&#39;extraction. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Réseau de collagène des tendons après extraction (5 um section longitudinale colorés avec H &amp; E). Nous avons ensuite tendons cultivées pendant jusqu&#39;à dix jours et mené des tests de stérilité. Chaque jour, nous plaqués solution de culture utilisé sur de l&#39;agar et incubée pendant 24 heures. Comme aucune croissance bactérienne a été observée, nous avons conclu que nos manipulations ne pas entraîner de contamination. Avec l&#39;algorithme de reconstruction le profil et le micromètre optique, nous sommes en mesure d&#39;estimer la surface transversale au sein d&#39;une marge de 2% d&#39;erreur 7. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Figure 7" /> Figure 7. La reconstruction d&#39;un profil de RTT. Enfin, nous avons évalué la viabilité utilisant le Live / Dead viabilité / cytotoxicité Kit pour les cellules de mammifères après l&#39;étape de rinçage et après une période de douze jours de culture. Depuis la grande majorité des vert fluorescent des cellules vivantes étaient évidents, nous pouvons confirmer que nos procédures d&#39;isolement sont réussi à préserver les tissus vivants. Le même test a été effectué deux heures après la fixation du tendon dans la chambre de bioréacteur. Nous avons vérifié que la déshydratation et de la colle à l&#39;ancre ne s&#39;était pas propagé dans le tissu entre les deux ancres. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Figure 8" /> Figure 8. Viabilité des tissus à l&#39;ancre (vert = cellules vivantes, rouge = cellules mortes)

<ol>
	<li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons.">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li><li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> D&#233;shydratation de matrices collag&#233;niques reconstruites in vitro: effets sur les propri&#233;t&#233;s m&#233;caniques et histologiques [dissertation]. , 114-114 (1981).</li><li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon.">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li><li>Hupp&#233;, N., Lessard, J. -. L., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Design+for+the+Mechanobiological+Study+of+Soft+Tissue+Damage+and+Repair+in+Conditions+that+Provide+the+Best+Approximation+of+Actual+Use.">A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use.</a> , (1985).</li><li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements.">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li><li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues.">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li><li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Techniques+for+the+Evaluation+of+Cross-Sectional+Area+in+Rat+Tail+Tendons+Generate+Significant+Errors.">Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors.</a> , (1985).</li></ol>

En appliquant ces procédures expérimentales, nous pouvons mener une grande variété d&#39;études in vitro sur ce type de tissus. Comme par exemple, une étude sur la dégénérescence des tissus a été réalisée par l&#39;application de la sous-stimulation à la RTT, pour une période de dix jours. Chaque jour, nous avons évalué les propriétés mécaniques dans les tissus des essais non destructifs de relaxation des contraintes. A la fin, nous avons pu observer des variations de stress RTT et ...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-PBS </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>311-410-CL</td>
<td>Saline solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc. </td>
<td>609-037-EL </td>
<td>Saline solution
 1g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics </td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062 </td>
<td>Saline solution
 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>12800-017</td>
<td>Culture solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>600-105-CG</td>
<td>Culture solution 3.7g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>090150</td>
<td>Culture solution 10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062</td>
<td>Culture solution 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Optic Micrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulation plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioreactor chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies

Tendons de queue de rat (RTT) sont un modèle commun biologiques utilisés dans études expérimentales in vitro dans les domaines de la physiologie des tendons et des tendinopathies. Travailler avec ces tissus est difficile car ils sont très fragiles, et jusqu&#39;à présent il n&#39;y avait pas de protocole rigoureusement détaillées de leur isolement. Face à ces défis, nous avons développé des méthodes et des instruments pour faciliter la manipulation des RTT et des tissus de contrôle de viabilité, la stérilité et l&#39;intégrité. Cet article décrit les procédures expérimentales utilisées pour préparer RTT pour les études biomécaniques et mécanobiologique. Notre travail est divisé en quatre grandes étapes: l&#39;extraction, la mesure de la superficie transversale, le rinçage et le chargement dans la chambre de bioréacteur. A chaque étape, toutes les procédures, les matériaux et les manipulations sont présentés en détail afin qu&#39;ils puissent être facilement reproduits. Par ailleurs, les instruments spécifiques développés sont présentés: une plaque de manipulation utilisée pour séparer RTT, un micromètre optique à la position du tissu pendant la mesure de la superficie transversale et un système d&#39;ancrage pour attacher les RTT sur un bioréacteur. Enfin, nous décrivons les résultats obtenus après plusieurs tests afin de valider nos méthodes. Évaluations de la viabilité, la stérilité et l&#39;intégrité de démontrer que nos procédures sont suffisamment rigoureux pour les manipulations des tissus fragiles tels que les tendons de queue de rat.

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Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Cet article décrit les procédures expérimentales utilisées pour préparer les tendons de queue de rat pour les études biomécaniques et mécanobiologique. Plusieurs caractéristiques des principales étapes de préparation sont démontrées, à commencer par l&#39;extraction, la mesure de la superficie transversale, le rinçage et le chargement dans la chambre de bioréacteur.

Préparation des tendons de queue de rat pour les études biomécaniques et mécanobiologique

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

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Research

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Biology

16.8K vues.  Université de Sherbrooke. Cet article décrit les procédures expérimentales utilisées pour préparer les tendons de queue de rat pour les études biomécaniques et mécanobiologique. Plusieurs caractéristiques des principales étapes de préparation sont démontrées, à commencer par l'extraction, la mesure de la superficie transversale, le rinçage et le chargement dans la chambre de bioréacteur.

Vidéo: Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Interview: Protein Folding and Studies of Neurodegenerative Diseases

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

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Interview: repliement des protéines et des études de maladies neurodégénératives

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Recherche

Biologie

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Préparation des cultures de cerveau de rat d&#39;agrégation pour Neuron et études sur le développement Glia

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  Following division, these cells migrate posteriorly, where FGF diffusing from the retina induces them to differentiate into a posterior array of elongated lens fiber cells, which compose the bulk of the lens.  Differentiation of lens epithelial cells into lens fibers can be induced in vitro by culturing explants of the central region of the anterior epithelium in the presence of FGF-2.  Explants are prepared from lenses of neonatal rats by removing the lens from the eye and grasping the lens capsule on the posterior side with dissecting tweezers.  The posterior capsule is then gently torn open and pressed down into the plastic bottom of a tissue culture dish. The peripheral regions of the explant are removed with a scalpel and the central area is then cultured in the presence of 100ng/ml FGF-2 for as long as 2-3 weeks, depending on the parameters to be studied.  Since epithelial cells in cultured explants differentiate in approximate synchrony over a period of days to weeks, the time course of signaling and gene expression can be determined using molecular, biochemical, and pharmacological techniques.  Immunofluorescence microscopy is a powerful adjunct to these methods as it demonstrates the subcellular localization of proteins of interest and can reveal the physiological consequences of experimental manipulations of signaling pathways.

Explants of the central region of rat lens epithelia differentiate synchronously when cultured in the presence of FGF-2. Immunofluorescence microscopy of such cultures can provides novel information about gene expression and signaling events associated with terminal differentiation.

Préparation et de la culture d&#39;explants Objectif Rat épithéliales pour l&#39;étude de la différenciation terminale

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenèse et analyse fonctionnelle des canaux ioniques hétérologue exprimée dans les cellules de mammifères

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Préparation de coeur de rat fortement couplées Mitochondries

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Préparation du Rat Serum Convient pour la culture d&#39;embryons de mammifères entier

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

L&#39;échantillonnage de sang de la veine caudale latérale de la Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.