研究は、カナダの自然科学と工学研究評議会でサポートされている。

1。はじめに<ol><li>マッキントッシュの研究室では数年前から内側腓腹筋の準備を使用していて、その前に、全体の腓腹筋の準備、などの博士フィルガーディナーで開発されました。1 </li></ol> 2。麻酔<ol><li>アダルトSprague-Dawleyラット（200-300 g）を一般的にin situで収縮特性の研究のために私たちの研究室で使用されています。ラットは、市販、またはタオルでカバーし、保持することによって、プレキシガラスデバイスに制約を付けることができます。 </li><li>私たちは85:15で混合（100mgを·ml -1の 、それぞれ）、キシラジン/ケタミン使用し、筋肉2,3ラット体重100g当たり0.1ミリリットルを管理します。ペントバルビタール（50〜60ミリグラム·kg -1で 、intraperiteneal）またはイソフルランナトリウム（2から3.5パーセント、吸入）は4を使用することもできる。 </li><li>麻酔薬が効果を取っているものの、正確な重量が得られ、左後肢を剃毛することができます。また、これは良いティムですeすべての電子機器の電源が入っており、準備がされていることを確認します。これは、コンピュータ、ひずみゲージアンプ、オイルヒーターなどが含まれます。 </li><li>定期的に反射反応のリターンのために確認し、必要に応じて麻酔を補う（100グラム当たり0.05〜0.1ミリリットル）。 </li></ol> 3。手術を開始<ol><li>我々は、手術のためにラットを固定化する上のプレキシガラスのプラットフォームを使用しています。シンプルなマスキングテープは、仕事をしていません。動物が左後肢から右前肢に引き伸ばされていることを確認します。目への潤滑剤のドロップを追加します。我々は、パラフィンオイルを使用しています。そうしないと、目がケタミン麻酔で完全に乾くでしょう。 </li><li>小さな外​​科光が​​便利です。この1つは動物を暖かく保つために十分な熱を放出する。あるいは、水加熱毛布を使用することができます。続行する前に、角膜やつま先のピンチ反射神経が欠席していることを確認してください。この手順では、急性であるため、無菌操作は必要ありません。動物が麻酔から回復しません。私たちは、麻酔したラットを安楽死させる全ての手続きが完了している過剰摂取（0.2ミリリットル、心臓内）。 </li><li>最初の切開は、かかとから脊柱に皮膚を介して行われます。カットの深さを制御することが可能とハサミは、基礎となる組織から皮膚を分離するのに使用されるので、私たちは、はさみを使用しています。ラットは優れた止血を持っているので、限り、あなたは大きな血管を避けるように、出血が制限されます。等張食塩水に浸したガーゼで覆われ露出された表面は、可能な限り保つ。 </li><li>皮膚が下層の結合組織から分離された後、浅筋層が切断される。あまりにも深くしないように注意してください、あなたは坐骨神経や血管、または関心のある筋肉を傷つけたくはありません。腓腹筋にわたって始まると皮膚切開と同じラインに沿って、近位にカットします。 Peekは下に坐骨神経を見つけて回避する。一度神経を参​​照してください、あなたの切開で、その道をたどるが、よく神経の上に滞在することができます。三菱UFJ証券との間に明確な継ぎ目があるクレス。これを見つけて、膝に向かってその継ぎ目に沿ってカットします。を監視し、血管を避けてください。 </li></ol> 4。骨用ピン大腿骨にパイロット穴を準備<ol><li>裸の骨を露出させ、大腿骨の尾側の側面の上の筋肉の薄い層を介してカットします。手持ち回転工具、ドリル、またはピン万力、（0.9ミリメートル炭素鋼いが）を使用して、皮質を経て、そしてちょうど髄質に小さな下穴を作る。あまり深く掘り下げていない場合、または過度の出血が発生します。この穴はミオグラフベースに大腿骨を固定するためにピンを配置するために後で使用されます。 </li></ol> 5。内側腓腹筋の神経支配を隔離<ol><li>次のステップは、解剖顕微鏡を必要とします。膝窩神経は内側腓腹筋の後ろに隠れる場所を探します。優しく様々な枝を広げて、内側腓腹筋を支配しないことをすべて切断してください。神経支配は、微小によって決定することができる。 THIでのステージは、また、坐骨神経の浅枝が切られていることを確認します。 </li><li>今すぐ坐骨神経から離れて結合組織をクリアするので、神経カフ（以降）に転落することができます。穏やかに神経を治療するようにしてください。神経の任意のストレッチはinexcitabilityにつながり、途中で実験を終了することができます。 </li></ol> 6。アキレス腱と腓腹筋を隔離<ol><li>鈍的切開は、はさみから時折助けを借りて、他の組織から腓腹筋を分離するために使用することができます。足底の腱はアキレス腱の下から引き出し縛ってカットすることができます。タイは単に腱を保持するのを助けるために使用され、腱が切断されると足がかなりの長さのために腓腹筋から分離された後すぐにカットすることができます。アキレス腱周囲＃1絹糸結紮を置き、本結びで結びます。きつく引っ張らないでください、または腱が損傷します。我々はcalcanをカットする骨Rongeursを使用<html>まだアキレス腱に取り付けられた骨の小片を残しEUS、。骨は腱だけではなく、カットされていることを確認するには、水平切断面を保つ。これはアキレス腱が後でミオグラフに貼付することができますを保証します。 </li><li>腓腹筋の下側に沿って、ヒラメを見ることができます。繰り返しになりますが、鈍的切開は腓腹筋からヒラメ筋を分離するために使用することができます。我々は内側腓腹筋を隔離したいので、それはまだアキレス腱に付随している唯一の筋肉です。遠位端に近い、ヒラメ筋腱を切った。次に、内側と外側腓腹筋を分離し、アキレス腱に添付ちょうど内側腓腹筋を残して、横方向の腱を切ることができる。その長さの約50％に沿って、先に内側から横腓腹筋肉離れを起こす。この長さを超えて、繊維が交差するとダメージはさらに引っ張るからなります。筋肉は結合組織の自由であることを確認してください。 </li></ol>E &quot;&gt; 7。脛骨をカット<ol><li>ちょうど中間点の上に、シャンクの周りに字を配置します。これは、組織の中に切断せずに、タイトにする必要があります。抱き合わせの前に第二のループが滑るのを防ぐのに役立ちます。再び確保するために正方形の結び目を使用しています。 </li><li>小さなのこぎりを使って、離れて下肢を切断してください。このカットは脛骨に沿ってほぼ中間にあるべきである。 </li><li>脛骨の髄質に鋭い探針を挿入します。このプローブはミオグラフベースに脛骨を固定するために使用されます。 </li><li>ミシェル·クリップを使用して、皮膚に2ゴムひもを取り付けます。これらおよび追加のゴムひもは、温められたパラフィン油で満たされる容器を形成する筋肉の周りの皮膚を保持するために使用されます。 </li></ol> [オプション] 8。 sonometric結晶（オプションのステップ）5を挿入<ol><li>低設定での加熱パッドに動物を置きます。直腸プローブは、すでに挿入されていない場合は、この時点で挿入することができます。潤滑するためにパラフィン油の小滴を使用しています。 </li><li>微小使用して、筋肉内に束の両端を識別します。筋肉の原点と挿入の両方のサイトに21ゲージの針を突く。 </li><li>針、獣医結合手術接着剤でシールすることにより作られた穴にsonometric結晶をスライドさせます。接着剤の非常に小さなドロップを使用する、それが結晶の上で右に配置されることを確認すること。鋭角で紙のカットの部分に接着剤を適用することは、正確に接着剤を適用する際に役立ちます。我々は、微小によって同定された束の挿入で追加の1結晶を配置している。 </li></ol> [CONTINUE] 9。装置内のマウント（図1を参照） <ol><li>レバー志向脛骨プローブで、ミオグラフベースにラットを配置します。足を固定するために、ホルダーにプローブを置きます。 </li><li>容器を形成し、ゴムひもで固定し、両側の皮膚を引き上げます。 </li><li>パイロットを使用して、大腿骨にドリルビットを（1/16インチ）を設定手術準備中に作成された穴。あなたは大腿骨の破損などのドリルビット（ピン万力）に置くようにあなたが前方部分に大腿骨をサポートしていることを確認しますが途中で実験を終了する可能性があります。大腿骨を固定するためのクロスバーに貼り付けてピン万力を。 </li><li>筋肉の原点に戻って近くの神経を刺激するカフ（筋肉に向かって陰極）とタックを通じ坐骨神経の遠位断端を置きます。これらのワイヤに刺激装置を接続します。 </li><li>その上に歪みゲージセンサを持ってレバーにアキレス腱を取り付けます。ぴったりと結ぶが、後に調整の余地を残す。筋肉のアライメントはレバーで垂直であることを確認してください。 </li><li>温められたパラフィン油で皮膚によって形成された容器を満たす。 </li><li>ヒートランプ、動物の頭の上にアルミ箔で作られた位置の盾、力変換器の電源をオンにします。追加のフォイルシールドは、動物のコア温度はexceていないことを確認する必要があるかもしれませんED 38℃文字列のたるみが内側腓腹筋と力変換器との間の接続から削除されるまで、筋肉の長さを調整することができます。 </li></ol> 10。最大電圧と基準長さを設定する<ol><li>筋肉がウォームアップしている間は、刺激を設定し、刺激電圧をテストします。刺激は非常に短いパルス持続時間で設定されていることを確認することが重要です。我々は、50μsを使用しています。収縮の振幅が増加しなくなるまでの最大電圧は0.5 Vで開始未満1 Vである必要があり、電圧を増加させる。最大電圧は、すべてのモータユニットを活性化する最低電圧である。我々は一般的に二重の最大電圧で刺激したり、いずれか高い方3 V。 </li><li>通常、実験は最大単収縮を与える長さで筋肉から始まります。けいれんは、単一刺激パルスが得られる。筋の長さは、別のけいれんのために1mm程度ずつ増加します。これは、単収縮振幅限り繰り返される増加している。一度振幅が減少するけいれん、長さが最大振幅けいれんを与えた1に戻されます。 </li><li>長さのこの初期設定の後、我々は &quot;コンディショニングテタヌス収縮&quot;と呼ぶものを使用してシステムをテストします。刺激装置は、500ミリ秒ごとに200 Hzのパルスを供給するように設定されている。この刺激の配信は完全に融合した強直性攣縮になります。筋が発生する力は、筋肉の結び目を含め、すべての接続を締めます。増強4の消費に適した休憩の後、筋肉の基準長さ（一部9.2を参照）がリセットされます。通常、空調テタヌス収縮がいくつか束の長さを短縮することを許可されていますので、筋肉が最大振幅単収縮を与える長さに戻って取得するために少しを伸ばしてする必要があります。 </li></ol> 11。実験を開始<ol><li>典型的な実験では、長さadjustmが含まれていますENTおよび/または刺激の様々なパターンでの刺激。データ収集は、長さ、束の長さと筋電図で、ちょうど力、または力を伴うことがあります。 </li></ol> [オプション] 12。力周波数の関係2 <ol><li>十分な長さの関心の任意の周波数での力のプラトーに到達する列車の時間を設定します。最大等尺性力は200Hzで内側腓腹筋で達成される。列車の時間は少なくとも200ミリ秒である必要があります。長く低い周波数のために良いですが、いくつかの収縮は力周波数の関係の完全な範囲を決定するために使用されている場合、いくつかの疲労になります。我々は一般的に0、20、40、60、80、100、200 Hzで収縮を使用しています。この周波数範囲では、力の周波数関係の完全な範囲を説明することができます。収縮の間に適当な残りは（1-10分）、疲労を避けるために許可する必要があります。 </li></ol> 13。フォース長relationshIP 6 <ol><li>以前に確立された推定最適な長さと、力の長さの関係を系統的に-4 mmからサーボモータ装置を用いて、4ミリメートルに筋肉の長さを調節することにより決定することができる。これは、最大刺激（200 Hz）を使用して行われるべきであるが、我々は非常に簡潔な収縮が同じ真の最適な長さ7が得られることを見出した。最大下収縮は、けいれんのように、使用することができますが、これは力8の異なる長さ依存性をもたらすでしょう。 </li><li>力 - 長さ関係の決定の重要な側面は、測定された力が発生する束の長さで受動力を推定する必要があるということです。アクティブな力が合力して、適切な受動的な力の差として計算されます。並列弾性構造は受動力を負担し、これらが一連の弾性構造と直列になっているので、全体の力に受動力の寄与はシリーズELAとして減少しなければならないSTIC構造は収縮3時に引き伸ばされます。受動的な力は、関連するすべての筋肉の長さのために知られていると、適切な受動的な力が、または測定システムのコンプライアンスや筋腱単位の直列構造を推定することによってsonomicrometryを使用して束の長さの連続測定で推定することができる。これを行わない場合は、準備とピーク力の最適な長さは、過小評価されています。 </li></ol> 14。力-速度関係9 <ol><li>あなたは力 - 速度関係を決定したい場合は、長さ変化の負荷や速度のいずれかの制御を可能にするシステムに力変換器を接続する必要があります。最も簡単で費用対効果の高い方法は、制御された負荷にショートニングを制限する空気圧を使用することです。我々のシステムでは、筋肉は、支点の片側にレバーに取り付けられており、空気の圧力は反対側に長さの変化を妨げる。長さセンサーねので、等張性収縮時の筋長の変化を検出することができることを採用するEDS。この配置は、空気抵抗とafterloaded収縮を可能にします。デュアルタンクは等張負荷にリリースと等尺性収縮を許可することができます。 15から20収縮の合計はほぼ無負荷から最大等尺性力まで負荷の下で、得られるべきである。式にデータをフィットする際に、アイソメトリックの90％以上の負荷では9を使用するべきではありません。 </li></ol> 15。代表的な結果： サンプルの収縮は、図2に示されている。これらの収縮は力周波数の関係を説明するために得られた。これらの収縮のピーク時のアクティブな力を算出し、周波数に対して活性力をプロットし、収量図3;力周波数の関係。図2に示されたデータは、次の式に適合することができます：AF = C /（1 + E（（AF）/ B）+ D）、AFがアクティブな力であり、Fは周波数であり、<html> b、c、dは定数である。 ラット内側腓腹筋の場合は、刺激の半最大周波数は、疲弊していない筋肉2に一般的に50から60 Hzです。結果は、上記の方程式で記述されるラインに密接にフィットします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig1.jpg" /> 図1装置および筋肉セットアップ：空気圧セットアップは、右側のアイソメトリック、左側に表示されます。動的な収縮が望まれるとき左に示すレバーシステムは（13から適応）変換テーブルに取り付けられています。ステッピングモータは、コンピュータ（14から適応）によって制御されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig2.jpg" /> 図2は、スーパーインポーズ等尺性収縮：20、40、60、80、100、200 Hzです。 200Hzの収縮の振幅は8.13 Nです。 les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg &quot;/&gt; 図3フォース周波数の関係：図2の収縮の活性力をプロットし、ラインがベストフィットのラインを表しています。

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biphasic+force-velocity+relationship+in+whole+rat+skeletal+muscle+in+situ.">The biphasic force-velocity relationship in whole rat skeletal muscle in situ.</a> J. Appl. Physiol. 102, 2294-2300 (2007).</li><li>Drzymala-Celichowska, H., Krutki, P., Celichowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summation+of+motor+unit+forces+in+rat+medial+gastrocnemius+muscle.">Summation of motor unit forces in rat medial gastrocnemius muscle.</a> J Electromyogr. Kinesiol. 20, 599-607 (2010).</li><li>Petrofsky, J. 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特別な利害関係は宣言されません。

良質収縮の結果は手術準備に注意を払って得ることができ、装置および良質の電子機器に取り付けて固定します。学生は、この手術を学習されている場合、いくつかの一般的なスリップは、次のとおり、坐骨神経を伸ばして血流を中断すると、過度の出血。神経が損傷を防ぐために注意して取り扱う必要があります。あなたが最適な長さで最大テタヌス力が実質的に図3に示したものよりも小さい、または最大限にすべてのモーターユニットをアクティブにするために必要な刺激電圧は5ボルト以上である場合であればあなたが神経を痛めている知っているだろう。これは、手術中にこの筋肉を楽しめる血管を避けることは比較的容易である。ドリルビットは、大腿骨の尾側の表面に配置されているとき、これらの血管に混乱が発生する可能性があります。パイロット穴は、大腿骨の平坦面上にない場合は、ドリルが滑ることがあります。これが起こるとき、膝窩動脈血管が破壊されてしまうという可能性があります。場合セットアップ後の筋肉の周りの血液プール、それはあなたがこれらの船を破壊しているというサインです。大静脈を切断し、縛られていない場合は、過度の出血が発生することもあります。に注意すべき大静脈は足首の周りのものです。 現場筋標本の筋収縮特性の研究に貴重なアプローチです。個々の運動単位は、10を活性化することができるが、通常はすべてのモーターユニットは、同期に活性化される。これは自発的な運動単位の動員によって発生する正常な非同期の活性化に相対不利なので、制限を表します。ただし、正の側には、同期の活性化は、すべての運動単位の平均応答の定量化を可能にします。 同期アクティベーションを回避するために使用されている2つのアプローチがあります。一つは、刺激的なワイヤーのいくつかのペアで電極カフを使用することです。これは、各ペアで運動単位の部分の活性化が可能にそして刺激が非同期活性化を達成するためにペアを介して回転させることができます。活性化するこの方法は、規模の原理12に応じて、適切な順序でのモータユニットを活性化しようとする陽極ブロック11と組み合わせることができます。このアプローチでは、すべてのモータユニットは電極の近位対を用いて活性化され、ブロックが直接電流刺激で課される。ブロックのための刺激の振幅は、活性化が望まれないためにモータユニットを阻害するために変調することができる。どうやらブロックが最低電圧で大きな軸索に影響を与え、徐々に小さい単位に影響を与えます。 現場ラット腓腹筋製剤中の健康と疾患における骨格筋の収縮および生化学的特性の研究に貴重な生理的なアプローチです。

<table border="1"><tbody><tr><th>機器の名称</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（オプション） </th></tr><tr><td>バリカン</td><td></td><td></td><td>良質ペットバリカン</td></tr><tr><td>手術用ランプ</td><td>ダイナLUME </td><td></td><td>いくつかのいずれかの操作を実行します</td></tr><tr><td>ミオグラフ</td><td></td><td></td><td>カスタム構築された</td></tr><tr><td>ミュレータ</td><td>草</td><td> S-88 </td><td>いくつかのいずれかの操作を実行します</td></tr><tr><td>ゲージアンプのひずみ</td><td> CWE </td><td> PM-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Telethermometer </td><td> YSI </td><td> YSI-400 </td><td></td></tr><tr><td>ロボットプラットフォーム</td><td> Arrickロボティクス</td><td> MD-2 </td><td></td></tr><tr><td> Sonometricアンプ</td><td> Sonometrics </td><td> Sonolab </td><td></td></tr><tr><td>コンピュータとデータ収集</td><td> NIボアを搭載したPCRD </td><td></td><td>カスタムソフトウェア（LabVIEWを） </td></tr><tr><td>蓄熱ヒーター</td><td>ラボ·ライン</td><td>マルチブロック</td><td></td></tr><tr><td>神経カフ</td><td></td><td></td><td>カスタムメード</td></tr><tr><td>超小型</td><td></td><td></td><td>カスタムメード</td></tr></tbody></table>

procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties

体温で正常な循環、そのまま全体の筋肉、：それは生理的な状況下では骨格筋の収縮反応を得ることが望ましい多くの状況があります。これは、反復刺激後増強、階段や疲労のような収縮反応の研究が含まれています。さらに、疾患、廃用、傷害、トレーニングや薬物治療の結果は関心を持たれることです。このビデオでは、この貴重な筋標本を設定および使用するための適切な手順を示しています。 この準備を設定するには、動物を麻酔しなければならず、内側腓腹筋は、外科的に無傷の元を使用して、絶縁されています。ケアは、血液や神経の供給を維持するために注意しなければなりません。坐骨神経の長いセクションは結合組織クリアされ、近位に切断されます。内側腓腹筋を支配しない遠切り株のすべての枝が切断されています。遠位の神経断端はinserですステンレス鋼ワイヤー刺激が並んでカフにテッド。踵骨はまだアキレス腱に取り付けられた骨の小片を残して、切断されます。 Sonometric結晶および/または筋電図用の電極を挿入することができます。大腿骨と脛骨の金属プローブによる固定化は、筋肉由来の移動を防止する。アキレス腱は、力変換器に接続されていると緩んで皮膚を温めたパラフィン油で満たされている容器を形成する両側にプルアップされています。オイルは熱を均等に分散し、蒸発熱損失を最小限に抑えることができます。ヒートランプが筋肉に導かれ、筋肉やラットを37℃に温め、アールそれが温暖化している間は、最大電圧と最適な長さを決定することができる。これらは、そのまま全体の筋肉にどんな実験のための重要な初期条件である。実験は、標準的な収縮特性の決定、力周波数の関係のような、力の長さの関係、力 - 速度関係を含むことができる。 </P&gt; 外科的分離、力変換器と筋腱単位の筋肉とアライメントの起源の固定化、および適切なデータ解析には慎重に、高品質の測定は、この筋標本を得ることができる。

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Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

このビデオでは、外科的な準備やラット内側腓腹筋の筋標本の収縮反応を研究するために必要な手順を示しています<em&gt;その場で</em&gt;。この製剤は、生理的条件下で骨格筋収縮特性の測定を可能にする。動物は麻酔や筋肉は、その遠位端で、周囲の組織から分離されている。アキレス腱は、無傷の循環と37度Cで筋肉の収縮反応を測定することができるように、力変換器に接続されています。

ラットのための手順<em&gt;その場で</em&gt;骨格筋収縮特性

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

28.6K ビュー.  University of Calgary. このビデオでは、外科的な準備やラット内側腓腹筋の筋標本の収縮反応を研究するために必要な手順を示していますその場で。この製剤は、生理的条件下で骨格筋収縮特性の測定を可能にする。動物は麻酔や筋肉は、その遠位端で、周囲の組織から分離されている。アキレス腱は、無傷の循環と37度Cで筋肉の収縮反応を測定することができる?...

ビデオ: Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

イントラ不可欠な顕微鏡による骨格筋のin vivo微小循環測定における

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

生物学

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

骨格筋からのミトコンドリア単離

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

骨格筋からの前駆体の精製

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

組織トリアージや骨格筋疾患のモデルのために凍結

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

ラットの骨格筋における線維-刺激性前駆腫(FAPs)および筋原性前駆腫(MP)の同定、分離、および特徴付け

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

ラットのための手順

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