Questo articolo è stato supportato da NSERC di Grant # 299280, IRSST come una borsa di studio di padre G. e FRSQ come premio di laurea di ricerca studente di M. Cyr. Ringraziamo Yoan Lemieux-Laneville per eseguire le manipolazioni registrate su video.

<html> Prima di qualsiasi manipolazione, è necessario identificare il gruppo di tendini da utilizzare a seconda della sperimentazione si sta conducendo e l&#39;apparato a vostra disposizione. Per i nostri scopi, i tendini ventrale sono stati scelti perché sono più piccoli e quindi più facili da manipolare quando si misura la sezione trasversale e montaggio li nella camera bioreattore. Si prega di notare che tutti gli strumenti vengono sterilizzati in autoclave o sterilizzato con il 70% di etanolo. Inoltre, un flacone spray contenente etanolo al 70% è collocato accanto a ogni postazione di lavoro per sterilizzare i guanti sperimentatori prima di ogni operazione. Parte 1: Estrazione Dopo la resezione, la coda è attentamente manipolato dalla sua estremità per evitare di danneggiare i tessuti. Inoltre, per conservare la vitalità cellulare, tutte le manipolazioni sono eseguite a freddo una soluzione salina. 1A) Materiali: <ul><li> Freddo una soluzione salina (D-PBS) </li><li> Ghiaccio tritato </li><li> Superficie protettore </li><li> Tagliere </li><li> Piastre di manipolazione individuale </li><li> 2 500 piatti ml </li><li> 2 piatti di vetro 2L </li><li> Nastro adesivo </li><li> 1 pinzette </li><li> 1 Pinza </li><li> 1 Pinzette stare </li><li> 1 paio di forbici chirurgiche </li><li> 1 bisturi </li><li> 1 paio di forbici chirurgiche <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Manipolazione individuale con l&#39;identificazione di orientamento (&quot;P&quot; per &quot;prossimale&quot;) </li></ul> 1B) stazione di lavoro: <ol><li> Stendere il protettore superficie e mettere il tagliere in cima. </li><li> Riempire ogni due piatti di vetro più grande per metà con ghiaccio tritato e metterle sulla carta. </li><li> Bastone un pezzo di nastro in un angolo della piastra di manipolazione e di identificare con una lettera per indicare la fine prossimale. </li><li> Riempire i due piatti di vetro a metà e tutte le scanalature delle piastre manipolazione a freddo con soluzione salina. Metterli nei piatti di vetro di grandi dimensioni contenente ghiaccio. </li><li> Organizzare tutti gli strumenti sterili il protettore superficie. </li><li> Trasferire la coda in uno dei piatti di vetro contenente una soluzione salina. </li></ol> 1C) Manipolazioni: <ol><li> Osservare l&#39;anatomia alla fine prossimale della coda di distinguere il lato ventrale dal lato dorsale. Il lato ventrale ha un maggior numero di tendini e dei vasi sanguigni che possono essere verificate premendo delicatamente la coda per la produzione di piccole gocce di sangue. </li><li> Utilizzando le forbici chirurgiche, tagliare la pelle lungo il lato dorsale della coda, se si desidera estrarre i tendini ventrale (o lungo il lato ventrale se avete bisogno i tendini dorsali). </li><li> Aprire l&#39;incisione alla fine prossimale e togliere la pelle con pinze o con le dita e manipolando con attenzione le estremità della coda. </li><li> Lavare via il sangue e capelli nella soluzione salina e trasferire il campione nel recipiente di vetro contenente restante soluzione fresca. Cambiare i guanti. Una sezione trasversale visto al microscopio ottico mostra i gruppi tendine sei. Un tendine di ogni gruppo è collegato alla fine di ogni vertebra caudale, per cui abbiamo tagliato il disco intervertebrale per esporre i tendini nuovo lungo il taglio. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Sezione trasversale della coda di ratto visto al microscopio ottico. </li><li> Tagliare l&#39;estremità distale attraverso le vertebre 2-3 cartilagine più breve con forbici chirurgiche. Mettere la coda sul tagliere per tagliare i tessuti molli con un bisturi e poi subito a sostituirlo nella soluzione. </li><li> Utilizzando le pinzette, estrarre uno tendine dalla coda distale. </li><li> Con una presa delicata ad entrambe le estremità, posto il tendine nella piastra di manipolazione individuale. Ripetere gli ultimi due passaggi fino a quando non più tendini possono essere presi in giro e tagliare fuori una vertebra più breve ogni volta che nuovi tessuti devono essere esposti. </li></ol> Parte 2: Sezione di misura 7 Quando il tessuto viene sottoposto caratterizzazione meccanica o la stimolazione, le sue proprietà meccaniche sono descritte normalizzando la forza all&#39;interno del tendine allo stress. Per questo motivo valutiamo sezione trasversale. 2A) Materiali: <ul><li> Micrometro ottico </li><li> Stereomicroscopio </li><li> Macchina fotografica digitale </li><li> Il riconoscimento dei bordi e gli algoritmi di ricostruzione profilo 5,6 </li><li> Freddo una soluzione salina (D-PBS) </li><li> 1 20-200μL Micro volume di pipette </li><li> 1 chiave esagonale per la regolazione micrometrica ottica </li><li> 2 Pinzette / &quot;Alt =&quot; files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. Micrometro ottico </li></ul> 2B) stazione di lavoro: <ol><li> Aprire il software (macchina fotografica digitale e gli algoritmi). </li><li> Posizionare il micrometro ottico in modo che vi sia spazio sufficiente per caricare il tendine nell&#39;apparato. </li><li> Organizzare gli strumenti e piatto di vetro contenente i tendini estratto a portata di mano. </li></ol> 2C) Manipolazioni: <ol><li> Riempire il vano di misura a freddo con soluzione salina fino a quando entrambi i sistemi di ancoraggio sono sommersi. </li><li> Trasferire il tendine nel vano tenendo le estremità con le pinzette. </li><li> Mediante aspirazione tramite il micro-volume pipetta, tirare una estremità in un momento nel tubo di silicone. Aspirare alla fine si estende oltre il collari per albero. </li><li> Serrare i collari per albero per comprimere i tubi e installare l&#39;apparato con lo stereomicroscopio. </li><li> Con ingrandimento 105X, allungare i tendini, osservando il tessuto fino a quando le pieghe non sono più percepibili. Tratto da ulteriori 0,40%. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Proiezione del tendine con ingrandimento 105X prima e dopo lo stretching. </li><li> Regolare la posizione e mettere a fuoco per mantenere una chiara immagine del tendine su una rotazione di 180 °. </li><li> Scattare una foto ad ogni rotazione di 10 ° senza modificare la tensione, messa a fuoco o la posizione. Utilizzare solo l&#39;albero rotante per effettuare la rotazione. Grazie alla sua forma conica, questi passaggi possono essere ripetuti in diversi punti lungo il tendine. </li><li> Attivare il riconoscimento bordo e algoritmi di ricostruzione profilo al fine di analizzare i dati che avete registrato. </li><li> Libero il tendine allentando le collari per albero e soffiando aria nei tubi di silicone con la pipetta micro volume. </li><li> Reinserire il tendine sulla piastra di manipolazione, ancora una volta la manipolazione da parte le estremità. </li><li> Verificare la forma del profilo ricostruzione ottenuti e il valore della sezione trasversale. </li></ol> Parte 3: risciacquo Per eliminare la contaminazione che possono essersi verificati durante le manipolazioni precedenti, i tessuti vengono risciacquati sotto biosicurezza cabinet. 3A) Materiali: <ul><li> Freddo una soluzione salina (D-PBS) </li><li> Multiple-scanalatura manipolazione piastra </li><li> Piastre di manipolazione individuale </li><li> Nastro adesivo </li><li> 2 Pinzette </li><li> 1 Pinzette stare </li></ul> 3B) stazione di lavoro: <ol><li> Accendere il ventilatore nell&#39;armadio biosicurezza 15 minuti in anticipo e pulire le superfici interne con il 70% di etanolo. </li><li> Portare tutti gli strumenti all&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza. </li><li> Stick pezzi di nastro su un angolo di ogni singola piastra per identificare la fine prossimale. </li><li> Riempire tutte le scanalature con soluzione salina sterile. </li></ol> 3C) Manipolazioni: <ol><li> Introdurre la piastra manipolazione contenente il tendine estratti nel cabinet. </li><li> Utilizzando le pinzette, rimuovere il tendine dalla sua piastra con una presa delicata su ciascuna estremità. </li><li> Immergere e mescolare dolcemente il tendine nella soluzione salina di ogni comparto della scanalatura multipla piastra manipolazione, a partire dalla più vicina e procedendo verso il solco più lontano. </li><li> Infine, immergere il tendine in una piastra di manipolazione individuale. </li></ol> Parte 4: Caricamento in bioreattore camera Per evitare ulteriore contaminazione, le manipolazioni sono anche condotte nel quadro di biosicurezza. 4A) Materiali: <ul><li> Bioreattore camera 4 </li><li> Ancoraggi sterile </li><li> 1 piatto di Petri sterili </li><li> Cellule in coltura media freddo (DMEM) </li><li> Cianoacrilato </li><li> 2 Pinzette </li><li> Pinzette stare </li><li> 0.5-10μl Micro-volume pipetta </li><li> 1 righello <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Bioreattore camera </li></ul> 4B) stazione di lavoro: <ol><li> Poiché il passo precedente è stato realizzato anche in materia di biosicurezza gabinetto, la rimozione di strumenti inutili vi darà più spazio di lavoro. </li><li> Portare tutti gli altri strumenti all&#39;interno del cabinet. </li></ol> 4C) Manipolazioni: <ol><li> Inserire un ancoraggio sulla piastra di manipolazione con il suo rocchetto centrato sopra l&#39;estremità del tendine e la ferita del tessuto e attorno al rocchetto. </li><li> Rotolare sopra l&#39;ancora e tenere l&#39;estremità libera, garantendo nel contempo che il tessuto rimane agganciato al di ancoraggio. Fermarsi dopo ¾ di giro. </li><li> L&#39;effettuazione della stessapassi con l&#39;altra estremità. </li><li> Rotolo sia ancore oltre allo stesso fino a quando non è di 6 cm tra loro centri 1. </li><li> Allentare il tendine di immergerlo nella soluzione e consentire le sezioni ancorata ad asciugare per breve tempo di migliorare le sue proprietà meccaniche 2-3. </li><li> Versare cianoacrilato nella piastra di Petri e disegnare 2.5μL nella pipetta del volume micro. </li><li> Applicare una goccia di cianoacrilato sulla ferita, i tessuti senza saltare nessun collante nella soluzione salina. Ripetere fino a 2 gocce sono state applicate a ogni ancora. </li><li> Con il tendine ancora completamente immerso, attendere 5 minuti per la colla si asciughi completamente. </li><li> Durante questo tempo, riempire il vano camera con soluzione salina. </li><li> Reidratare tutto il tessuto con una soluzione salina per evitare danni. </li><li> Manipolando solo le ancore, trasferire il tendine nella camera di bioreattori e chiuderlo per evitare perdite e contaminazioni durante il trasferimento. </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante: Il risultato del protocollo dimostra che quando eseguito correttamente, il nostro isolamento dei tessuti rigorosa procedura di preparazione e permettono di mantenere la sterilità dei tessuti, la vitalità e l&#39;integrità. In primo luogo, utilizzando il metodo di estrazione semplice e ripetitivo, siamo in grado di estrarre i tendini coda senza danneggiare la rete di collagene, come si può osservare da un analisi microscopica di sezioni H &amp; E contaminato realizzata dopo l&#39;estrazione. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Rete di collagene del tendine dopo l&#39;estrazione (5 micron sezione longitudinale colorate con H &amp; E). Abbiamo poi i tendini in coltura per un massimo di dieci giorni e test di sterilità condotta. Ogni giorno, placcato soluzione cultura utilizzati su agar e incubato per 24 ore. Poiché non è stata osservata la crescita batterica, abbiamo concluso che le nostre manipolazioni non provochino contaminazione. Con l&#39;algoritmo di ricostruzione profilo e micrometro ottico, siamo in grado di stimare la sezione trasversale all&#39;interno di un margine di errore del 2% 7. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Ricostruzione Profilo di un RTT. Infine, abbiamo valutato la vitalità usando il Live / Dead Fattibilità / citotossicità Kit per le cellule di mammifero dopo la fase di risciacquo e, dopo dodici giorni di cultura. Dal momento che la grande maggioranza dei verdi fluorescenti cellule vive sono state evidenti, possiamo confermare che le nostre procedure di isolamento sono riuscito a preservare il tessuto vivo. Lo stesso test è stato eseguito due ore dopo collegare il tendine nella camera bioreattore. Abbiamo verificato che la disidratazione e la colla a l&#39;ancora non si era diffuso nel tessuto tra le due ancore. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Vitalità del tessuto al di ancoraggio (verde = cellule vive, rosso = le cellule morte)

<ol>
	<li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons.">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li><li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> D&#233;shydratation de matrices collag&#233;niques reconstruites in vitro: effets sur les propri&#233;t&#233;s m&#233;caniques et histologiques [dissertation]. , 114-114 (1981).</li><li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon.">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li><li>Hupp&#233;, N., Lessard, J. -. L., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Design+for+the+Mechanobiological+Study+of+Soft+Tissue+Damage+and+Repair+in+Conditions+that+Provide+the+Best+Approximation+of+Actual+Use.">A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use.</a> , (1985).</li><li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements.">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li><li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues.">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li><li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Langelier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Techniques+for+the+Evaluation+of+Cross-Sectional+Area+in+Rat+Tail+Tendons+Generate+Significant+Errors.">Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors.</a> , (1985).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mediante l&#39;applicazione di tali procedure sperimentali, siamo in grado di condurre una vasta gamma di studi in vitro su questo tipo di tessuti. Come per esempio, uno studio sulla degenerazione dei tessuti è stata effettuata con l&#39;applicazione di sotto-stimolazione per RTT per un periodo di dieci giorni. Ogni giorno, abbiamo valutato le proprietà meccaniche del tessuto in stress test non distruttivi relax. Alla fine, siamo stati in grado di osservare variazioni RTT stress e quindi di analizzare la prog...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-PBS </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>311-410-CL</td>
<td>Saline solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose </td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc. </td>
<td>609-037-EL </td>
<td>Saline solution
 1g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics </td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062 </td>
<td>Saline solution
 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>12800-017</td>
<td>Culture solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>600-105-CG</td>
<td>Culture solution 3.7g/L</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Wisent inc.</td>
<td>090150</td>
<td>Culture solution 10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Antibiotics-antimycotics</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen Corp.</td>
<td>15240-062</td>
<td>Culture solution 1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Optic Micrometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulation plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioreactor chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom-made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies

Tendini coda di topo (RTT) è un modello comune biologici utilizzati in studi sperimentali in vitro nel campo della fisiologia dei tendini e tendinopatie. Lavorare con questi tessuti è impegnativo perché sono molto fragili, e fino ad ora non c&#39;era protocollo rigorosamente dettagliato per il loro isolamento. Di fronte a queste sfide, abbiamo sviluppato metodi e strumenti per facilitare la manipolazione di RTT e tessuto di controllo vitalità, sterilità e l&#39;integrità. In questo articolo vengono descritte le procedure sperimentali utilizzati per la preparazione RTT per gli studi di biomeccanica e mechanobiological. Il nostro lavoro è diviso in quattro fasi principali: estrazione, sezione di misura zona, il risciacquo e il caricamento nella camera bioreattore. Ad ogni passo, tutti, i materiali procedure e le manipolazioni sono presentati in dettaglio in modo che possano essere facilmente riprodotti. Inoltre, gli strumenti specifici sviluppati sono presentati: un piatto di manipolazione utilizzata per separare RTT, un micrometro ottico per posizionare il tessuto durante la sezione di misurazione dell&#39;area e un sistema di ancoraggio per fissare la RTT su un bioreattore. Infine, descriviamo i risultati ottenuti dopo le prove multiple per validare i nostri metodi. Valutazioni la vitalità, la sterilità e l&#39;integrità dimostrare che le nostre procedure siano sufficientemente rigorosi per le manipolazioni dei tessuti fragili come i tendini coda di topo.

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Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

In questo articolo vengono descritte le procedure sperimentali utilizzate per preparare i tendini coda di topo per studi di biomeccanica e mechanobiological. Diverse caratteristiche dei passi principali nella preparazione sono dimostrati, a cominciare da estrazione, sezione di misura zona, il risciacquo e il caricamento nella camera bioreattore.

Preparazione dei tendini coda di topo per studi di biomeccanica e Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

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Biology

16.8K Views.  Université de Sherbrooke. In questo articolo vengono descritte le procedure sperimentali utilizzate per preparare i tendini coda di topo per studi di biomeccanica e mechanobiological. Diverse caratteristiche dei passi principali nella preparazione sono dimostrati, a cominciare da estrazione, sezione di misura zona, il risciacquo e il caricamento nella camera bioreattore.

Video: Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Interview: Protein Folding and Studies of Neurodegenerative Diseases

In this interview, Dr. Lindquist describes relationships between protein folding, prion diseases and neurodegenerative disorders. The problem of the protein folding is at the core of the modern biology. In addition to their traditional biochemical functions, proteins can mediate transfer of biological information and therefore can be considered a genetic material. This recently discovered function of proteins has important implications for studies of human disorders. Dr. Lindquist also describes current experimental approaches to investigate the mechanism of neurodegenerative diseases based on genetic studies in model organisms.

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Intervista: Protein Folding e lo studio di malattie neurodegenerative

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Biologia

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  Following division, these cells migrate posteriorly, where FGF diffusing from the retina induces them to differentiate into a posterior array of elongated lens fiber cells, which compose the bulk of the lens.  Differentiation of lens epithelial cells into lens fibers can be induced in vitro by culturing explants of the central region of the anterior epithelium in the presence of FGF-2.  Explants are prepared from lenses of neonatal rats by removing the lens from the eye and grasping the lens capsule on the posterior side with dissecting tweezers.  The posterior capsule is then gently torn open and pressed down into the plastic bottom of a tissue culture dish. The peripheral regions of the explant are removed with a scalpel and the central area is then cultured in the presence of 100ng/ml FGF-2 for as long as 2-3 weeks, depending on the parameters to be studied.  Since epithelial cells in cultured explants differentiate in approximate synchrony over a period of days to weeks, the time course of signaling and gene expression can be determined using molecular, biochemical, and pharmacological techniques.  Immunofluorescence microscopy is a powerful adjunct to these methods as it demonstrates the subcellular localization of proteins of interest and can reveal the physiological consequences of experimental manipulations of signaling pathways.

Explants of the central region of rat lens epithelia differentiate synchronously when cultured in the presence of FGF-2. Immunofluorescence microscopy of such cultures can provides novel information about gene expression and signaling events associated with terminal differentiation.

La preparazione e la cultura di espianti Lens Rat epiteliali per lo Studio differenziazione terminale

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

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Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Preparazione del Cuore Rat altamente Accoppiato mitocondri

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparazione di Rat Siero Adatto per mammiferi tutta la cultura Embrione

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Prelievo di sangue dalla vena della coda laterale del Topo

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.