この作品は、LJMCに国立衛生研究所からの補助金R01 - HL87290、R01 - HL87290 - S1とR01 - AI082610によってサポートされていました。

1。開頭術 8〜10週齢のマウスの開頭術では、チタンのバーは、動物の頭部に配置されていないことを除いて、前述の1として事前に実行する必要があります。慢性頭蓋ウィンドウが注入された後、軟膜微小循環にも数ヶ月の検査を可能にする安定な製剤である。通常、我々は2〜3週間頭蓋窓の移植後に研究を行う。 2。生体顕微鏡検査<ol><li>開頭後の2〜3週間、体温をチェックしてから、マウスは軽く（誘導は4％、メンテナンスのため1〜2％）イソフルランで麻酔です。光麻酔は、実験手順の間に動物のストレスや不快感を防ぐために使用されます。 </li><li>動物は、定位固定フレームと慎重に耳のバーを使って安全に頭の上に腹臥位に配置されます。レベルは、右と左のレバーを使用して調整されます。中核体温は、加熱パッドを使用して維持されます。脳マラリアとマウスは低体温を開発しているので、温度設定は、各動物のために調整する必要があります。 </li><li>頭蓋窓上にカバースリップを静かに綿棒がウィンドウの下に鉱物油と容器のパノラマ画像で湿らせた綿棒でクリーニングされる実体顕微鏡の助けとデジタルカメラ（ニコンCOOLPIX 995、日本）で取得されます。画像は、印刷同定され、日付と血管径と赤血球（RBC）速度の測定のためのマップとして使用されますされています。 </li><li>マウスは、生​​体内顕微鏡ステージ（ライカ-マクベインカスタマイズ、サンディエゴ、CA）に転送されます。一滴の水がよく歯のアクリルで形成されるのを利用して頭蓋ウィンドウ上に配置され、フォーカスが調整されます。測定値は、20X（LUMPFL - WIR、開口数0.6、オリンパス）水浸対物レンズを用いて実施されています。同船舶は、そのベースラインのレベルへの直接の比較は小さなサンプル集団のための、より堅牢な統計を可能に実行できるように続いている。画像はデジタル低光を高速度カメラ（浜松ホトニクスC9300 - 221、日本）、またはビデオデッキのテープに接続された低光のアナログのカメラ（COHU 4815サンディエゴ、カリフォルニア州）（JVC、日本）、タイムスタンプが（縮小映像のビデオを使用してキャプチャされますシステム、ボイヤー、PA）とカラーモ​​ニター（PELCO、クロービス、CA）。テープが適切に記録を開始する前に識別、およびタイムスタンプは、このようなイベントが再コーディングされれるまでの期間を文書化することで、イベントの識別を可能にしています。 </li><li>船の最初のチェックは準備の質を評価するために作られ、血液はすべての血管に流れている場合。その後、測定しようとする船舶の選択が行われ、それは、異なる直径の細静脈と動脈を（私たちのマウス軟膜の準備で、ほとんどの船が20と80μmの間の範囲）が含まれますと、ウィンドウによって公開されているエリア内の別の場所をカバーする必要があります。細動脈と細静脈は、容易に容器の影響で血流（それが配布や血液を収集するかどうか）の方向をチェックすることによって区別す​​ることができます。我々の研究では、測定は12隻で行われます。測定する各スポットの正確な場所は、軟膜血管系の画像に注釈が付けられます。 </li><li>各スポットには、血管の直径は、画像のせん断装置（画像せん断、Vistaのエレクトロニクス、サンディエゴ、カリフォルニア州）2を用いて測定されます。スポットを選択すると、容器の画像が垂直位置に整列されており、反対の極端が並んでいると読書が文書化されるまで、画像は、傾斜が設定されます。この値は、レチクルキャリブレーションステージのマイクロメータ（エドモンドオプティクス社、バーリントン、NJ）を使用して、各特定の倍率のため、以前のキャリブレーションを実行することでマイクロメートルに変換することができます。 </li><li>各スポットは、赤血球の追跡のために少なくとも30秒間に記録されます。追跡のために、血液のサンプルを採取し、赤血球は、蛍光色素DILを（Molecular Probes社、カールスバッド、カリフォルニア州）カルボシアニンと〜0.4から0.5パーセント3の生体内濃度を得るために尾静脈から注入で標識されています。 、標識のない注入、緑色蛍光タンパク質を発現する原虫berghei ANKA（PBA）（CJジェンシーとAPウォーターズによって堆積PBA - GFP、マラリアの研究とレファレンス試薬リソースセンターMR4、マナサス、バージニア州からの寄付）に感染した動物にセルが必要です。ビデオ画像は、毎秒150フレームで記録されます。この速度は、最大8 mm / sに速度を測定するための1つのビデオフレームにセルのいずれかに6つのイメージを取得するために設定されていますビデオ画像は、アドビプレミア4.0ソフトウェアを使用してパソコンでデジタル化され、各セル画像のXY座標データはSigmaScanプロ4.0ソフトウェア（SPSSシカゴ、イリノイ州）4を使用して得られる。セルの位置は、訓練を受けた観察者の眼がどの、セルの中心の位置の良い推定を与えることが示されたことを考えると、画像解析によって手動ではなく、決定される一般的にhはほとんどの細胞の向きのために観察された最大蛍光の位置に対応しています。位置と速度の複数の測定は、各セルに対して行われ、平均赤血球速度を得るために平均化されます。 </li><li> RBCの速度測定がオフラインで実行されるときに、各マウスの総観測時間は、麻酔のcardiodepressiveの影響を最小限に10〜15分を超えることはありません。 </li><li>血管径と赤血球速度の測定値が利用可能になると、各血管における血流の計算は、式を使用して行うことができます：Q = V Xπ（D / 2）2、ここで、Q =血流、V = RBC速度とD =血管の直径。 </li><li>これらの手順は、時間をかけて繰り返すことができます。例えば、脳マラリアのマウスモデルでは、我々は、感染の4日目に始まる毎日の測定を行います。各マウスのために毎日得られた値を100％としています0日目との関係（感染前）、で正規化されます。 </li><li>血管径や血流の測定に加えて、追加の評価は、インスタンスの改善血流の評価と軟膜血管の白血球及び/または血小板のローリングと接着の分析のために、実行することができます。これらの測定は、蛍光標識マーカーの助けを借りて行われます。マラリアの場合には、我々はまた、GFPを発現しPBAの菌株を使用しての手段によって循環または付着寄生虫を検出することができます。 </li><li>血流評価のために我々はのソリューションを使用してFITC標識（シグマ、セントルイス、ミズーリ50μg/mouse）アルブミン、そして我々はテキサスレッド（TXR）で標識された汎白血球マーカーCD45に対する抗体を使用して軟膜血管への白血球付着を定量化する（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州4μg/mouse）。アルブミン- FITC（2mg/mL）と20μLの抗CD45 - PE抗体（200μg/mL）を混合し、予め温めておいた尾静脈に注入される。この、25μlのためのマウスは、その後15分間循環させることが許可されている漏れの測定値はアルブミン- FITCかかるしかし、もし、すぐにイメージングすることができます。 XF100 - 2（オメガオプティカル、ブラトルバロ、バーモント州）、および抗- CD45 - TXR蛍光（615nm）を終了しています：アルブミン- FITCとGFP（PBA - GFP pRBC）によって放射される緑色蛍光（518nm）を使用し、鮮やかなALPHAキャプチャされます。 XF42：ビビッド標準で捕獲した。 </li><li>蛍光標識アルブミンが貫通血管を含む血管網の改良可視化を可能にし、それはそのような非灌流または下で灌流血管をチェックするために脳マラリアなどの疾病状態に特に便利です。また、血管漏出5を測定するために使用することができます。 </li><li>蛍光標識した抗CD45抗体は、軟膜血管への白血球のローリングと接着を識別し、定量化が容易になります。定量化のバイアスを避けるために、我々は、同じ箇所の血流を測定するために事前定義されたのローリングと接着性を定量化する。白血球付着の定量は、100μmの血管の長さが白血球の数をカウントすることによって行われます。ローリングは、30秒の間に、同じ100μmの長さで血液の速度よりもはるかに遅い速度で走行白血球の数をカウントすることにより定​​量される。 </li></ol> 3。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。頭蓋窓を介してアクセスできるマウス軟膜血管のネットワークの（ステップ2.6）写真。 <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。マウス軟膜微小循環の生体顕微鏡用に設定されたの（ステップ3.1から3.5）回路図の表示。 1：生体内顕微鏡、2：20倍水浸対物レンズ、3：光源、4A：デジタル低光量、高速カメラ、4B：アナログカメラ、5：定位フレームのマウス、6：コンピュータモニター、7：アナログシアラー画像のせん断（矢印）が血管の直径を測定するために行われる方法を示す監視。 <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。高速蛍光ビデオ録画からの細胞の追跡により（ステップ3.6から3.8）微小血管の赤血球速度測定。 Fまでの画像をカメラで顕微鏡フィールドの区切りを越えて、単一の移動RBCを示すone軟膜血管のシーケンスの画像です。そのプレキャリブレーションの距離で、フィールドを横断する15以上のセルの枠の位置でフレームの手動決定は、Excelスプレッドシートの助けを借りて、各容器内の平均赤血球速度の計算が可能になります。 <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 マラリア原虫berghei ANKA（PBA）に感染したマウス（n = 5）で、時間の経過と非感染コントロールマウスの軟膜血流の変化を示す代表的な実験の（ステップ3.9）のデータ（N = 5）。対照マウスに軟膜の血流が時間とともに比較的安定であるのに対し、PBA感染マウスは、血流の著しい減少を示す脳マラリアの開発（6日目）の時。データは平均± SEMである。 <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。 （ステップ4.3）などの抗CD45 -テキサスレッド蛍光抗体で染色によって明らかにされたマラリア原虫berghei ANKAに感染したマウスの軟膜血管への接着白血球の数が多い。

<ol>
	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで説明する生体顕微鏡法は、マウスの軟膜微小循環の詳細な観察のためのユニークで強力なツールが用意されています。それは個々の細動脈と細静脈を疎かし、そのような血管径、赤血球の速度、血流、白血球、血小板などの血液の要素の遵守とローリング、血管漏出、組織のpHとPO2のようなパラメータの数の変化を測定し、潜在的に多くのことが可能となりますアプリケーション。 ...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>FDG9623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbocyanine dye Dil </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>D306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin-FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A9771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD45-TxR Ab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>MCD4517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P. berghei ANKA-GFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MR4</td>
<td>MRA-865</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

この実験モデルは 、in vivo蛍光顕微鏡で使用して、急性および慢性の、生理学的および病態生理学的血行動態、炎症、代謝状態のときにマウスの軟膜微小循環を評価するために設計されました。閉じた頭蓋ウィンドウは、マウスの左頭頂後頭葉皮質の上に配置されています。地元の微小循環は、エピと蛍光の照明を使用してウィンドウを使ってリアルタイムに記録されており、血管径と赤血球（RBC）速度の測定が実行されます。 RBCの速度は、リアルタイムの相互相関および/または蛍光標識赤血球を用いて測定されます。軟膜血管と血流と血管の漏出の評価に白血球や血小板の付着は、アルブミン- FITCおよび抗CD45 - TXR抗体などの蛍光標識マーカーの助けを借りて作られています。微小循環は、数日間にわたって繰り返して、ビデオを記録することができます。我々は、血液中の深遠な減少をマウスのマラリアberghei ANKAの感染症の経過中に動的な変化に追従する軟膜微小循環を研究し、CMの発現は血管収縮を特徴と微小循環機能不全に関連付けられていることを示すために最初にウィンドウを閉じるの脳生体顕微鏡を用い流れと最終的には血管虚脱。

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Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K ビュー.  University of California, San Diego. 軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。

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An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

ブレインマシンインタフェースの閉ループ性能を研究する実験プラットフォーム

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

神経科学

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFPを発現クリアマウス脳の多光子顕微鏡

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

再固定ウィンドウの間に絶滅の訓練は恐怖の回復を防ぎ

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

で閉鎖性頭部外傷性脳損傷を負わせる方法<em&gt;ショウジョウバエ</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated thinning of the skull. Cranial window surgery is typically performed with a high speed rotary drill, and many investigators find it challenging to prevent the drill from damaging the delicate dura and blood vessels. Extensive training and practice is required to remove the bone without damage to underlying tissue and thus cranial window surgery can be difficult, time consuming, and produce tissue damage. Piezoelectric surgery, which is extensively used for maxillofacial and dental surgery, utilizes ultrasonic vibrations to remove bone without damaging soft tissues. We have developed a method applying piezoelectric surgery to improve cranial window surgery in mice in preparation for multiphoton imaging. Comparisons within our lab find that the method requires less surgery time and has a lower average rate of complications due to dural bleeding than cranial window surgery with a rotary drill.

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelectric surgery has led to improvements in human maxillofacial and dental surgery. We have developed a protocol to optimize piezoelectric surgery for cranial window surgery in mice.

ピエゾ高精度手術小片除去 (フェーザ): マウスの改良された頭蓋ウィンドウ術のテクニック

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

マウスにおける線込みおよび脊髄窓移植

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...