この作品は、アメリカ心臓協会（AYSのポスドクフェローシップ）と国立衛生研究所（MH085499、EB003832、とOD006831 DKまで）によってサポートされていました。私たちは、原稿上でコメントをベス·フリードマンとパブロ·ブラインダーに感謝します。

1。手術の準備I <ol><li>超音波洗浄器でMaxizymeと外科ミルクの混合物に超音波処理により手術器具をきれいにします。各実験前に、手術器具をオートクレーブします。 </li><li>必要なすべての試薬と消耗品が使用可能であることを確認してください。試薬や消耗品のリストを表2に記載されています。曝露された組織に接触した試薬および消耗品は、可能な場合は、無菌でなければなりません。 </li><li>麻酔を誘導する。生存の研究に適した典型的な麻酔薬は、表1に記載されています。つま先ピンチ反射の欠如を確認することにより麻酔の外科的平面を確認してください。マウスの最適な年齢は3から6週間です。若いマウスの頭蓋骨は柔らかく薄いのが難しくなります。古いマウスは、間伐手順の間をもっと出血する厚い頭蓋骨を持っています。 </li><li>定位フレーム1に動物を保護します。手術用機器のリストは、表2に記載されています。 </li><li>ボディ温度を維持する37トゥーレ°Cのフィードバック調節直腸プローブと熱パッドを使用します。 </li><li>水分を保持するために目に眼軟膏を適用します。 </li><li>小型電気カミソリで頭皮を剃る。 </li><li> 70％（v / v）のイソプロピルアルコールで拭き取り、続いBetadineと頭皮をきれいにします。 </li><li>必要に応じて、心臓や呼吸速度がパルスオキシメータを使用して正常範囲内にあることを確認してください。マウスでは、これらの数字は、それぞれ約10センターと2 Hzのはずです。 </li><li> 37°C（125 mMのNaCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、3.1 mMのCaCl 2を 、1.3 mMのMgCl 2、pH7.4）中（Sigma社からのすべての化学物質）に滅菌濾過し、人工脳脊髄液（ACSF）のアリコートを温める2。 </li></ol> 2。ヘッドフレームの取り付け<ol><li>ピンセットと手術用ハサミで全体の背側頭蓋骨表面に頭皮を削除します。頭蓋骨の両側の側頭筋のエッジとポストに横方向に皮膚をトリミングする首の筋肉（ 図1A）にerior。 </li><li>頭蓋骨の表面から薄い骨膜を削除するには、外科用メスの刃を使用しています。 </li><li>湿った綿で頭蓋骨をきれいにアプリケーターをひっくり返しやほこりができからの空気の流れと頭蓋骨の表面を乾燥させます。その後、全体の頭蓋骨の表面にシアノアクリレート接着剤の薄い層を適用します。接着剤が完全に乾燥することができます。接着剤のこの層は、以降の手順では歯科用セメントの適切​​な遵守に必要とされています。シアノアクリレート系接着剤は滅菌する必要はありません。 </li><li>離れて目的のウィンドウの領域から、頭蓋骨の表面に金属製のコネクタに取り付けます。麻酔の準備のために、小さなナットは、後でボルトを用いた撮像セットアップ（ 図1B、1Lと1N）にねじ込むこともできシアノアクリレート接着剤のDABと頭蓋骨に固定することができます。接着剤が頭蓋骨に添付中のスレッドに入らないことを確認するためにテープでナットの裏面をシールします。ナットやテープは、滅菌すべきである<html>手術前にオートクレーブによって。 </li><li>目を覚ましイメージングの製剤は、2つのアタッチメントポイント（ 図1Mおよび1N）とより厳格なカスタムコネクタを接続します。 ½ミリメートルドリルバリと反対側の半球皮質上の頭蓋骨の2つの穴をドリルし、2つの＃000のセルフタッピングネジをご紹介します。これらのネジは頭蓋骨にヘッドマウントを固定するのに役立ちます。基本的な皮質に圧力をかけないようにするために、ネジの唯一つの完全なターンを適用します。その後、小脳上のシアノアクリレート系接着剤の小さなDABとカスタム金属製のクロスバーを取り付けます。シアノアクリレート系接着剤が完全に乾燥することができます。この金属製のコネクタは非常に自由度を減らし、長期的な研究でも同じイメージング分野の再配置を簡素化します。ワイドクロスバーは、電極の配置と鼻毛の刺激のための十分な余地を与えます。カスタムヘッドマウントおよび添付ファイルのデバイスを生成するための詳細な計画は、オンラインで入手できます（SICS / links.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html）。ネジとクロスバーは、手術前にオートクレーブで滅菌する必要があります。 </li><li>歯科用セメントの層（ 図1C及び1D）で、ウィンドウの位置を除いて、全体の頭蓋骨の表面をカバーしています。肌の露出エッジはセメントで覆われていることを確認してください。歯科用セメントの成分は、滅菌する必要はありません。 </li></ol> 3。ポリッシュの発生と間伐 - 頭蓋骨（ポート）ウィンドウを強化<ol><li>ドリルのバリがシャープであることを確認し、それらを再利用することは避けてください。 ½ミリメートルバリと体性感覚皮質上に2mmの地域別に歯科用ドリルで低速を使用して、薄い2mmである。 ACSFで頭蓋骨を湿潤し、ガスダスターからの空気の穏やかな流れと頭蓋骨の表面を乾燥させるとの間の代替、冷却のためのウェットと、間引きのために乾燥した。これは出血することが頭蓋骨の海綿層を介して間伐が必要ですが、細かく制御することができますACSF（ 図1E）で洗浄によってED。頭蓋骨は、〜50μmであるときに、ドリルのわずかな圧力の下でフレックスを開始し、軟膜血管が濡れた骨（ 図1F）を介して表示されるはずです。この厚さで、骨の中の小さな白い斑点は、乾燥頭蓋骨の表面は湿らされた直後に数秒間表示されるようになります。 </li><li>この時点で、骨の薄い、さらに。わずかなタッチで頭蓋骨の表面を削る低速ドリルの速度、すなわち、1000 rpmを使用しています。ペンのようなドリルを保持しながら、小さな制御された動きを使用してのみ横方向に力を適用します。骨は、その最終的な厚さ（ 図1G）で10から15ミクロン〜ザなければなりません。乾燥頭蓋骨表面を湿らされたときに骨が十分に薄い場合には、骨に小さな白い斑点が見えなくなりません。 </li><li>酸化スズ粉末とウィンドウ領域を磨く。シリコン水族館シーラントやと浸しました既製ドリルビットを取り付けますテーパー鞭（ 挿入図、図1H）を残して、描画されます。シリコンホイップは、少なくとも一日手術前に準備し、使用する前にイソプロパノール70％滅菌する必要があります。 ACSFの低下（ 図1H）と一緒にウィンドウ上に粉体の小さなピンチを配置します。そっと頭蓋骨表面への移動鞭の先端に触れることによって、最大10分のためにウィンドウの上にスラリーを攪拌してください。 ACSFを使用して、ウィンドウから徹底的に酸化スズ粉末を洗い流すと空気の穏やかな流れで徹底的に骨を乾燥させます。前の手順で掘削によって残された表面の凹凸や接着性の骨チップは研磨（ 図1Hおよび1I）の後に削除する必要があります。酸化スズ粉末を滅菌する必要はありません。 </li><li>なしの正方形の部分を切り取ります。 0はウィンドウのサイズよりもわずかに小さいガラスをカバーしています。穏やかにストレートエッジを使用してカバースリップで区切られた水平線と垂直線を獲得するためにスクライブを使用しています。その後シャーレとKNにカバースリップを置きガラス片を分離するためにテーブルの端に皿をOCK。全体のペトリ皿は、その後無菌性を確保するためにオートクレーブ処理することができます。 </li><li>適切なサイズのカバーガラス近くの乾燥したウィンドウを配置します。壊れた木製の綿棒の先端を使用してウィンドウ上にシアノアクリレート接着剤の小さなDABを適用し、すぐに接着剤の上のカバーガラスのプレカットピースを押してください。カバーガラスの下に気泡を作成することは避けてください。静かに、頭蓋骨の表面に対してカバーガラスを押し、数秒（ 図1Jと1O）に保持します。接着剤は15分以上かけて徹底的に乾燥させます。それが乾燥された後に過剰なシアノアクリレート接着剤は、手術用メスの刃とカバーガラスの上面から削除することができます。歯科用セメントでカバーガラスの端を密封して形成してわずかに浸漬レンズ（ 図1Kおよび1O）の水を保持するためにも提起した。 </li></ol> 4。回復<ol><li>手術後の暖かいケージに動物を配置します。モニターそれは完全に麻酔から回復するまで定期的に動物。 </li><li>準備は1日以上生存することを意図されている場合は、鎮痛のためにブプレノルフィンを（gの齧歯類0.03μg）を提供しています。一般的に我々のイメージは、少なくとも一日、最初の移植後の動物。 </li></ol> 5。イメージングの準備<ol><li>ヘッドサポート（ 図1Lと1M）などのフレームを使用して、イメージングのための光学ブレッドボード上で動物を安定させます。拘束装置はQioptiqまたはThorLabsから市販されているオプトメカニカルコンポーネントから行うことができます。私たちの独立したプレートは、動物と一つのユニット3のように組み立てられたすべての生理学的モニタリングデバイスと外科と2光子イメージングスイート間で転送することができます。 </li><li>血流イメージングが必要な場合は、5％の0.05 mLの（w / v）の蛍光デキストラン色素が血液血清（ 図2Aおよび2C 2Hにラベルを付けるためにどちらかの尾静脈または眼窩静脈を通して滅菌生理食塩水に溶解して注入する</strong&gt;）4-7。これは全身麻酔下で行わなければなりません。デキストランのソリューションは、より粘性であるため眼窩静脈投与は、初心者のためのより簡単であるかもしれません。尾静脈は暗く着色されたマウスでは見つけるのが難しくなることができ、静脈注射が失敗した後に崩壊する傾向があります。緑色発光のイメージング血管系については、フルオレセインイソチオシアネートデキストランを使用しています。赤色発光については、テキサスレッドデキストランを使用しています。高分子量のデキストランを使用すると、色素は数時間の循環のままになります。また、内因性の蛍光標識を有する動物は、適切な二光子励起波長で直接撮像することができます。デキストラン溶液は、将来の使用のために分注して凍結することができます。 </li><li>優しく湿った綿の先端アプリケータとウィンドウの表面を清掃してください。 </li><li>麻酔の準備の長時間イメージングのための、体液やエネルギーの要件を維持するためにグラム当たり3μLの容量で2時間ごとに無菌の乳酸リンゲル液の腹腔内に注入します。&lt;/ LI&gt; <li>ときに覚醒状態のイメージングの動物は、ストレスレベルを低減するために、一度に少数の時間にヘッドレストを制限します。食糧と水のイメージングセッション間でのホームケージに動物を返します。 </li></ol> 6。代表的な結果成功したウィンドウには、数ヶ月のために軟膜表面下250μmで、イメージングの深さを設定できるようになります。このメソッドは、 生体内毛細血管の血流4、8、ミクログリアの活性化8、9、皮質実質8内の樹枝状構造で勉強するために使用されています。一例では、我々は血清がテキサスレッドデキストラン（ 図2A）の静脈内注射によって標識された後、麻酔THY1-黄色蛍光タンパク質（YFP）マウスの脳血管系を表示するために2光子イメージングを使用しています。硬膜の血管はやや硬膜（ 図2C、矢印 ）で皮質表面上に頻繁に表示されます。大軟膜細動脈と細静脈のLi皮質表面上の電子（図2D）。彼らは皮質組織を供給する緻密な毛細血管床（ 図2Eに2H）に分派する皮質にこの表面のネットワークとダイビングから貫通血管の分岐。皮質ニューロンを表現する深いYFP、このマウスラインへの信号の内因性の樹状アーバーは、第2のチャネル10（ 図2B 2Hまで ）で同時に撮像することができます。骨の第二高調波信号は、3番目のチャネルで収集され、画像スタックのコレクション（2Cに図2A）の後に薄く頭蓋骨の厚さを測定するために使用することができます。 皮質の血管の動態は、深く麻酔11の影響を受けています。二番目の例では、我々は慣れた目を覚まし、マウスから2光子顕微鏡によって収集された自発的vasoactivityのビデオが表示されます。内腔の直径の著名な血管の振動が軟膜細動脈ではなく、隣接する静脈と見られている。このvasoactivityの基底範囲は、ウレタン麻酔4に減少しています。血流の自然および誘発変化を定量化するために、我々は個々の血管の血管径と赤血球速度の両方をキャプチャするように適応ラインスキャン技術を使用しています。二光子顕微鏡を用いて定量的な血流イメージングに関する詳細なリソースは、12 3ご利用いただけます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> 図1。 Portsウィンドウの手順。 Portsウィンドウを生成するための手順で操作手順の（Kの）画像。詳細な手順については、テキストを参照してください。 β=ブレグマとλ=λ。麻酔の準備の撮像中に頭部を保護するための（L）ボルトとナットシステム。 （M）カスタム覚醒準備のためのクロスバーヘッドマウントを加工。この例では、コネクタがまた繰り返される脳波の記録に移植した。 （N）回路図は、さまざまなコンポーネントのヘッドマウントおよび位置の背ビューを示している。パネルLで使用されているナットがパネルM.で使用してクロスバーに代わるものとして意図され二つの＃000セルフタッピングネジが目を覚ましイメージング製剤で追加された安定性のためのクロスバーマウントで追加されます。 Portsウィンドウの断面を示す（O）の模式図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> 図2。マウス皮質の血管系と神経構造の2つの光子イメージング 。すべての画像は、ウィンドウの移植10日以降2日目にTHY1-YFPマウスでPortsウィンドウを介して収集された。血管（A）と樹状突起（B）との関係で薄く頭蓋骨を示すコロナの方向で組織の150μmの上の最大投影。骨（青）900 nm励起で450nmの発光で、第二高調波蛍光を収集することによって検出された<sup&gt; 8。血管系（赤）は静脈内注射70kDaのテキサスレッドデキストラン6で標識した。ニューロンの樹状突起のフィールド（緑）THY1-YFPトランスジェニックマウスのラインへの内因性があります。 PIA以下の異なる深さで水平方向に組織を50μm以上（CH）が最大と予測。データは、パネルに示すように、同じ画像スタックからのものであり、B.硬膜の血管は（Cの矢印 ）だけ皮質表面上に見えるかもしれません。 略語 ACSF =人工脳脊髄液 ポート=洗練された補強薄く頭蓋骨のウィンドウ YFP =黄色蛍光タンパク質 私が説明する手順は、あなたのローカル動物実験によって承認されていることを確認し、委員会を使用してください。

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開示するものがありません。

Portsウィンドウを介して2つの光子イメージングは薄く骨を介して伝送し、レーザ光 ​​を減衰させ、より大きな深さ8で光学収差を追加する硬膜を必要とします。しかし、この欠点にもかかわらず、軟膜表面下250μmでのイメージングの深さまでは900 nmの励起を実現することができます。大きな画像の深さは、原則的に13より長い励起波長を持つことも可能です。この方法の主?...

<table border="1"><tbody><tr><td> エージェント </td><td> 配達の経路 </td><td> マウスの用量 </td><td> 持続 </td><td> 注釈 </td><td> ソース </td><td> refの文献 </td></tr><tr><td> ペントバルビタール（ネンブタール） </td><td> IP </td><td> 90μg/ gで</td><td> 15〜60分間</td><td>狭い安全マージン。徐々に麻酔の適切な用量まで動作します。必要に応じて誘導量の10％を補う。 </td><td> 036093;バトラーシャイン</td><td> 7 </td></tr><tr><td> キシラジンと混合したケタミン（Ketaset）（Anased） </td><td> IP </td><td> 60μg/ gで（K） 10μg/ gで（X）（同じ注射器でミックス） </td><td> 20〜30分</td><td>キシラジンは、筋弛緩剤と鎮痛剤としての共同注入されます。必要に応じて誘導量の50％のみケタミン補う。 </td><td> （K）010177、（X）033198;バトラーシャイン</td><td> 7 </td></tr><tr><td> イソフルラン（Isothesia） </td><td>吸入</td><td> 4％の誘導のための肺胞内濃度（MAC）を意味し、メンテナンスのために1から2パーセントMAC </td><td> 4〜6時間。 </td><td> 70％酸素と30％亜酸化窒素の混合物で提供される。長時間の麻酔は、回復を遅らせることにつながる。 </td><td> 029403;バトラーシャイン</td><td> 26 </td></tr></tbody></table> 表1。生存研究のために麻酔薬を示唆した。 <table border="1"><tbody><tr><td> ITEM </td><td> COMPANY </td><td><stroNG&gt;カタログ＃/ MODEL </td></tr><tr><td> Betadine </td><td>バトラーシャイン</td><td> 6906950 </td></tr><tr><td>ブプレノルフィン（Buprenex） </td><td>バトラーシャイン</td><td> 031919 </td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネートデキストラン、2 MDA分子量</td><td>シグマ</td><td> FD2000S </td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>フィッシャー</td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td>乳酸リンゲル液</td><td>バトラーシャイン</td><td> 009846; </td></tr><tr><td>リドカイン溶液、2％（v / v）の</td><td>バトラーシャイン</td><td> 002468 </td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>バトラーシャイン</td><td> 009861 </td></tr><tr><td>手術のミルク</td><td>バトラーシャイン</td><td&gt; 014325 </td></tr><tr><td>テキサスレッドデキストラン、70 kDaの分子量</td><td>インビトロジェン</td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td>バトラーシャイン</td><td> 035646 </td></tr><tr><td> 使い捨て </td></tr><tr><td>カーバイドバリ、1/2ミリメートルのチップサイズ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 19007から05 </td></tr><tr><td> Cottoned先端アプリケータ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td>いや、ガラスをカバーしています。 0厚さ</td><td>トーマス科学</td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td>シアノアクリレート系接着剤</td><td> ND産業</td><td> 31428 H04308 </td></tr><tr><td>ガスダスター</td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td>グリップセメント粉末</td><td> Dentsply </td><td> 675571 </td></tr><tr><td>グリップセメント溶剤</td><td> Dentsply </td><td> 675572 </td></tr><tr><td>インスリン注射器、29.5ゲージの針で0.3 mLの</td><td>バトラーシャイン</td><td> 018384 </td></tr><tr><td>頭を保護するためのナットとボルト</td><td>閲覧</td><td>ナット、H723-ND、ボルト、R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td>眼科軟膏</td><td>バトラーシャイン</td><td> 039886 </td></tr><tr><td>手術用メス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td>ねじ、セルフタッピング＃000 </td><td> JIモリス会社</td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td>シリコン水族館シーラント</td><td>パーフェクトマニュファクチャリング</td><td> 31001 </td></tr><tr><td>スズ酸化物粉末</td><td>ママの鉱物</td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> 装置 </td></tr><tr><td>ガラススクライブ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08から675 </td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td> OPMI-1 FC </td></tr><tr><td>電動ドリル</td><td> Foredomまたは長田</td><td> K.1020（Foredom）またはEXL-M40（長田） </td></tr><tr><td>電気かみそり</td><td>ウォール</td><td>シリーズ8900 </td></tr><tr><td>鉗子、デュモンありません。 55 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11255から20 </td></tr><tr><td>フィードバック安定化された熱パッド</td><td> FHC </td><td> 40-90-8（直腸サーミスタ、40から90-5D-02、H）パッド、40-90-2-07を食べる</td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td>パルス酸素濃度計</td><td>スターライフサイエンス</td><td> MouseOx </td></tr><tr><td>ミニチュア、ドライバー</td><td>ギャレット·ウェイド</td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td>定位フレーム</td><td> Kopfは楽器</td><td>モデル900（マウスの麻酔マスクと非破裂耳バー付き） </td></tr><tr><td>外科はさみ、平滑末端</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14078から10 </td></tr><tr><td>超音波洗浄器</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> 表2特定の試薬 ​​、消耗品や機器のリストです。

a polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain

皮質機能のin vivoイメージングでは頭蓋内環境を中断することなく、脳への光アクセスする必要があります。我々は、直径数ミリメートルにまたがって、数ヶ月安定であるマウスの頭蓋骨で洗練された補強薄く頭蓋骨（ポート）ウィンドウを形成する手法を提案する。頭蓋骨は、光学的透明性を達成するためにドリルを開催し、シアノアクリレート系接着剤とカバーガラスで覆われている手で厚さ10から15ミクロンまで薄くされています。1）剛性、2を提供する）、骨再生を阻害し、3）光散乱を低減する骨表面の凹凸から。頭蓋骨が破られていないので、検討されてプロセスに影響を与える可能性の炎症が大幅に削減されます。アップ皮質表面下250μmのへのイメージングの深さは、二光子レーザー走査顕微鏡を用いて達成することができます。このウィンドウは、よく麻酔と覚醒の両方準備に脳血流と細胞機能を研究するのに適しています。それはさらにオペアンプを提供していますoptogeneticsを使用して、細胞の活性を操作するか、または循環する光感受性の照射により、標的血管の血流を妨害するportunity。

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A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

我々は、ミリメートルにまたがると、脳の炎症を伴わないヶ月間安定であるマウスの頭蓋骨の画像ウィンドウを形成する手法を提案する。このメソッドは、よく二光子顕微鏡を用いて血流、細胞のダイナミクス、細胞/血管構造の縦断的研究に適しています。

マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

a-polished-reinforced-thinned-skull-window-for-long-term-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.7K ビュー.  University of California, San Diego. 我々は、ミリメートルにまたがると、脳の炎症を伴わないヶ月間安定であるマウスの頭蓋骨の画像ウィンドウを形成する手法を提案する。このメソッドは、よく二光子顕微鏡を用いて血流、細胞のダイナミクス、細胞/血管構造の縦断的研究に適しています。

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

神経科学

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

再固定ウィンドウの間に絶滅の訓練は恐怖の回復を防ぎ

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

の長期嗅覚順応の分子読み出し<em&gt; Cエレガンス</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

ための間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ·テクニック<emインビボで&gt;</em&gt;光干渉断層イメージング

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...