我々は、これらのモデルの開発に指導および提案のためG. Oトゥールに感謝したいと思います。この作品は、嚢胞性線維症財団（GGA、STANTO07ROとSTANTO08GAにBASにANDERS06F0）、国立衛生研究所（GGAとR01 - HL074175にBASにT32A107363）、および生物医学研究の卓越性のための研究資源センターのナショナルセンターによってサポートされていました（コブルBASへP20 - RR018787）。

1。静的な共培養バイオフィルムモデル<ol><li>静的な共培養バイオフィルムモデル1は、もともとΔF508- CFTR変異2,3,4用CFホモ接合と個々の開発した細胞を不死化しているCFBE41o -細胞（CFBE細胞）、使用しています。 CFBE細胞/ウェル、6ウェル組織培養プレートまたは2 10％ウシ胎児血清を添加した最小必須培地（MEM）で24ウェル組織培養プレートのX 10 5、10 6細胞の濃度で播種してください2mMのL -グルタミン、50 U / mlペニシリン、および50μg/ mlのストレプトマイシン。我々は、6ウェルプレート、24ウェルプレートにウェル当たり0.5mLの培地に1ウェルあたり1.5 mLの培地を使用してください。 </li><li>細胞は、7〜10日のため℃、5％CO 2 -95％空気細菌を接種する前にコンフルエントな単層を形成するために37℃で成長させることがあります。培地は2〜3日ごとに変更する必要があります。これらの条件は、コンフルエントな単層とタイトジャンクショ​​ンの形成につながることが示されている。 </li><li> 37℃で18時間、5 mLのLBで緑膿菌を育てる℃〜200 rpmでインキュベーターシェーカーで。これらの条件の下で、P.緑膿菌の培養は、通常、5 × 10 9 CFU / mLの密度に達する。 </li><li>細菌接種の場合は、CFBE細胞から培地を除去し、2mMのL -グルタミン（顕微鏡の培地）を添加したフェノールレッドを含まないMEMの等量を、追加してください。コンフルエントCFBEの単層を、P.を接種するもともと播種CFBE細胞の数に対して約30:1相対の感染多重度で緑膿菌 。これは、1.5 mLのMEMで/ウェル、6ウェルプレートおよび24ウェルプレート用0.5mLのMEM /ウェルで1.2 × 10 7 CFU / mLのための2 × 10 7 CFU / mLに相当します。 </li><li> 37℃および5％CO 2 -95％空気を1時間プレートをインキュベートする。 </li><li> 1時間のインキュベーション後、上清を0.4％アルギニンを添加した新鮮な顕微鏡の培地を除去し、交換する必要があります。 </li><li>さまざまなタイムポイント（最大約8時間まで）のための℃、5％CO 2 -95％空気で37インキュベートすると、位相差顕微鏡を使用してCFBE単分子層の整合性を分析する。気道細胞が非コンフルエントな場合は、P.緑膿菌は急速に（数分以内に）細胞の側底表面にアクセスして、細胞の完全性を破壊します。 P.接種恒常的に落射蛍光または共焦点顕微鏡により可視化できる蛍光バイオフィルムmicrocoloniesでGFPの結果を表現する緑膿菌株。 </li><li>バイオフィルム内の細菌のCFUは、浮遊細菌を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）との共培養2〜3回洗浄することにより決定することができます。洗浄に続いて、0.1％が10-15分のためのPBSまたはMEMのトリトンX - 100上皮細胞を溶解し、バイオフィルムを分散させるために扱う。 </li><li> 3分間ボルテックスし、溶解液の希釈系列を用意する。プレートは、これらのLB寒天培地上に希釈し、37℃で一晩インキュベート℃、 CFUを決定するために次の日にコロニーを数える。 </li></ol> 2。フローセルの共培養バイオフィルムモデル<ol><li>フローセルの共培養バイオフィルムモデル（フローアッセイ）は、5 CFBEセルを収容するために標準的なバイオフィルムフローセルの装置の変更を伴います。 </li><li>クリーン100mLのビーカーに、いくつかの40mm径のガラス製カバースリップを配置。 20分間、乾燥サイクルのアルミ箔とオートクレーブの2層でしっかりとカバー。 </li><li>細胞培養のフードでの作業、滅菌60 mmの直径のプラスチックシャーレにエタノール洗浄鉗子と場所を使用してビーカーから一滅菌カバースリップをつかむ。 </li><li>下敷きにどんなバブルを除去するため、プラスチック皿の底にカバースリップを強制的にピペットの先端にカバースリップを押して、予め温めておいた培養液3 mLを追加します。 </li><li>種子皿あたり2 × 10 6個の細胞と前後に軽く料理を振る。皿の側面から細胞を遠心分離することを防止するために渦巻く避けてください。 </li><li> 37 ° Cと8〜10日で3 mLの新鮮な増殖培地で一日おきに細胞を養うには、5％CO 2 -95％空気インキュベーターに皿を置きます。細胞はガラスのカバースリップ上にコンフルエントな単層を形成します。 </li><li> P.を拡大37℃18時間、5 mLのLB〜200 rpmでインキュベーターシェーカー上にC言語の緑膿菌 。これらの条件の下で、P.緑膿菌の培養は、通常、5 × 10 9 CFU / mLの密度に達する。我々は、Pを使うGFP 6の構成的発現のためにpSMC21プラスミドを有する緑膿菌の菌株のPAO1。 </li><li>滅菌した微量遠心チューブに細菌培養液1 mLを加え。 3分間6000rpmで遠心し、顕微鏡の培地1mL中に二回、細菌ペレットを洗う。 </li><li> 〜5 × 10 8 CFU / mLの濃度を達成するために4.5mLの顕微鏡の培地に洗浄し、再懸濁した細菌の0.5 mLを希釈する。 </li><li>生きた細胞の観察リアルタイムで蠕動ポンプ（時間の延長長さの栄養物の流れを確保する）と温度コントローラに結合イメージングチャンバーを必要とします。我々は、FCS2室のコントローラを介して適切な長さに切断し、不妊のためにオートクレーブし、温度調節さ1 / 16 C -フレックスチューブと低流量マイクロ灌流ポンプに接続Bioptechs FCS2（フォットライブセル）チャンバーを使用してください。我々は、顕微鏡の横にある右にある37℃の水浴で培地の入力ソースを保持。 </li><li>フローチャンバーを組み立てます。 FCS2室はセルフロッキングベース（撮像中にステージアダプタに座っている）と灌流チューブとチャンバーのコントローラに接続されて上半分が含まれています。裏返しとステージアダプタ上に配置される前にチャンバーは逆さまに組み立てられています。灌流チューブが表示されるように逆さまにチャンバーの上半分をホールドし、灌流チューブに0.75 mm厚のゴム製のガスケットの隙間の穴を合わせます。溝側がアップしていることを確認して、ゴム製のガスケットの上室に付属してmicroaqueductスライドを積み重ね、そしてスライドの上に別のゴム製のガスケットを置きます。この第二のガスケットの厚さと内部の形状は、チャンバの容積を決定します。我々は通常、30 mmの円形の内部形状を持つ0.75 - mm厚ゴム製のガスケットで動作します。 </li><li>スライドの中央に予め温めておいた（37℃）顕微鏡の培地1mLを追加。 </li><li>細胞培養インキュベーターから60 - mmディッシュを取得、使用済み培地を除去し、予め温めておいた顕微鏡培地3mLで細胞を1回洗浄する。このステップでは、細胞増殖培地中に存在するフェノールレッドと抗生物質の除去を確実にします。抗生物質は、P.を根絶できる一方フェノールレッドは、軽度の蛍光であり、画像処理に干渉することが緑膿菌がバイオフィルムを確立する前に。 </li><li>エタノール洗浄鉗子を使用して、皿からカバースリップを取得し、チャンバー内に配置された顕微鏡媒体のビーズの上に逆さまに下ろします。カバースリップは2番目のゴム製のガスケットに着くと気道細胞の単層は下方に直面している。 </li><li>片方の手で組み立てられた部品を保持している、スタックの一番上にチャンバーのベースを配置し、すべてが右側上になるように、急速に上のチャンバーを回します。リングを回して所定の位置にベースをロックします。 </li><li>マイクロ灌流ポンプの低流量にインレットチューブを接続し、20mLの/ hの速度で流れを開始し、この流量は、P.の水泳のスピード能力の範囲内です。 緑膿菌 。チューブのリンクの2番目の要素顕微鏡の横にある右にある37℃の水浴中に置かれた顕微鏡の培地のフラスコにポンプ。 </li><li>チャンバーの入口および出口灌流チューブに滅菌済みのカット1 / 16 C -フレックスのチューブを取り付ける、倒立蛍光顕微鏡の顕微鏡ステージに組み込まれたチェンバーを配置し、温度コントローラを接続する。 </li><li> 1 mLの使い捨て注射器を使用して、ポンプとチャンバとの間にインラインで配置された二方弁を使用して、チャンバー内に予め用意された細菌懸濁液を注入する。私たちの特定の設定では、それはチャンバーに到達するための細菌懸濁液0.6 mLのボリュームを取ります。特定のチューブの長さに応じてこのボリュームを調整します。我々はまた、流れに逆らって泳ぐと、入力フラスコを汚染から細菌を防ぐために、ポンプと二方弁との間のフィルタのインライン使い捨て0.22μmのを配置すると便利です。 </li><li>細菌は、気道の細胞に付着できるようにするには、2時間のためにポンプを停止します。流れは、実験の残りのための再実行および20mL / hで維持することができます。 </li><li>単分子層への損傷の徴候を調べるために実験を通して微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡による気道細胞の整合性を監視します。同時に、GFPで標識したP.の発展に従ってください反転共焦点またはワイドフィールド蛍光顕微鏡で画像を取得することにより気道細胞の頂端表面における緑膿菌のバイオフィルム。 </li></ol> 3。代表的な結果我々は、P.の菌株を使用GFP 6の構成的発現を可能にするプラスミドpSMC21を含む緑膿菌 。このような理由から、CFBE単層上に成長しているGFPで標識したバイオフィルムは、落射蛍光顕微鏡で可視化することができる。また、バイオフィルムの可視化は、ラベルのないP.を染色することによって達成することができます37 ° C 1で1時間に1％calcofluor白のソリューションと緑膿菌 。 フローアッセイにおけるCFBE細胞のイメージングバイオフィルム形成のために、我々は、カスタムメイドのステージアダプタを使用しますが、いくつかの企業は、現在特別にフィットステージアダプタを提供することができます。我々は、ORCA - AGの深い冷却CCDカメラとX60の油浸対物レンズ（開口数1.40）を装備したオリンパスIX70倒立顕微鏡で動作。フィルタありヒールは40分の480 nmのバンドパス励起フィルターと30分の535 nmのバンドパス発光フィルターを装備しています。デジタル画像は、オープンラボ4.0.3ソフトウェアパッケージ（即興）で買収されたとボリュームがVolocity 3.5.1ソフトウェア（即興）を使用して復元を反復により、デコンボリューションされた。 3Dバイオフィルム構造の定量的な分析は、犯罪統計システムの画像解析ソフトウェアパッケージ7.8で達成された。 考慮したいずれの共培養モデルでは、一つのモデルのコンポーネント間の開発細胞毒性に特に注意を払う必要があります。静的およびフローセルアッセイの両方で、我々はCFBE単層は、Pの存在を耐えることがわかった変化の兆候なしに接種後、最大8時間のための緑膿菌 。上皮単層の整合性は、倒立顕微鏡1（図1A）を使用して位相差顕微鏡により、または実験5を通して微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡によって評価することができる。時間が経つにつれて、P.緑膿菌が蓄積し、完全にまたはセクション（図1B - 1C）における上皮細胞の単層に損傷を与える可能性毒素および病原性因子を生成します。細胞毒性を定量的に上皮細胞から乳酸脱水素酵素（LDH）の放出を測定するために様々なキットを用いて評価することができる。 LDHは細胞溶解または細胞死の際細胞外環境でリリース済みの安定細胞質ゾルの酵素である。 気道の単分子層の整合性が損なわれること（通常は〜8時間以下の接種のため）、P.緑膿菌のバイオフィルムは、正常に形成し、説明した共培養モデルの両方の気道細胞の先端面（図2A - 2B）で開発することができます。 3次元再構成（図2C）と定量化に続いて、バイオマスの蓄積を正確に決定することができます。我々はまた、いくつかの表現型アッセイではこれらの共培養のバイオフィルムを使用している。上記のように例えば、、バイオフィルムCFUは簡単に、上皮細胞を溶解し連続的に溶解液を希釈し、寒天プレート上で平板培養することにより決定することができます。私たちは、抗生物質治療に異なる系統の抵抗を決定する際にこの手法が有利発見した。さらに、上皮細胞に向かってバイオフィルムの毒性は、市販のLDHの検出キットを用いて測定することができます。このように、バイオフィルムの毒性の毒性因子の役割を評価することができます。これらのモデル系でもプロモーターの融合学、RT - PCR、およびマイクロアレイ解析1,5,9を含む遺伝子発現のアプリケーションの数を、サポートしています。 <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 CFBE細胞とP.による侵害及び損傷気道の細胞単層の代表的な画像の単分子層緑膿菌のバイオフィルムの成長。（A）組織培養プレートで培養CFBE細胞のコンフルエントな単層の代表的なイメージは、位相差顕微鏡で評価した。スケールバー、120μmの。侵害CFBEの単分子層の（B）の例。単分子層は、まだ被害の明らかな目に見える兆候が表示されないにもかかわらず、P.緑膿菌は上皮細胞と側底膜に獲得するアクセスのタイトジャンクションの間に広がって見られている。バイオフィルム形成は、一般的に悪化単層のため、これらの条件下で達成されていません。スケールバー、20μmである。草に覆われたPの（C）の例緑膿菌のバイオフィルムは、24時間後の接種を観察した。成功したバイオフィルム形成を支援した後、CFBEの単層を修復できないほど壊れていると今事実上存在しないされました。細菌の平らな層として成長している残存バイオフィルムは、ガラスのカバースリップに取り付ける示されています。スケールバー、20μmである。 <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig2.jpg" alt="図2" /> 図2 P.緑膿菌のバイオフィルムは、静的な共培養バイオフィルムモデルとフローセルの共培養バイオフィルムモデルを用いてコンフルエントCFBE細胞の頂端表面に成長。GFPを発現するPをの（）代表画像緑膿菌のバイオフィルムは、落射蛍光顕微鏡で評価した静的な共培養バイオフィルムモデルを、使用してCFBE細胞のコンフルエントな単層上に成長。画像は、位相コントラストチャネルと蛍光チャンネルのオーバーレイです。スケールバー、35μmである。 GFP標識したP.の（B）代表画像緑膿菌のバイオフィルムは、フローセルの共培養バイオフィルムモデルを用いてCFBE細胞のコンフルエントな単層上で6時間増殖させた。気道の単分子膜の可視化を容易にするために、核はP.の接種前に30分間10μg/ mLのヘキスト33342（Molecular Probes）で染色した緑膿菌 。マージされたと疑似画像は微分干渉コントラスト（DIC）で表示され、そして対応する蛍光像が表示されます。 CFBE細胞の頂端表面に付着した緑の塊として提示するバイオフィルムは、気道の細胞に分散されています。スケールバー、20μmである。 （C）三次元形状を復元6時間前のPの典型的なキノコのような構造を示すZシリーズの画像スタックのる緑膿菌のバイオフィルムは、CFBE細胞単層を形成する。スケールバーは10μm。

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	<li>Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+analysis+of+tobramycin-treated+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+cystic+fibrosis-derived+airway+epithelial+cells.">In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells.</a> Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).</li><li>Bruscia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CF+cell+lines+corrected+at+DeltaF508-CFTR+locus+by+SFHR-mediated+targeting.">Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting.</a> Gene Ther. 9, 683-685 (2002).</li><li>Cozens, A. 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利害の衝突は宣言されません。

バイオフィルムは、環境刺激に応答して形成する細菌のコミュニティです。これらの環境シグナルは、世界的な規制表面に結合することで、その結果、各細菌内の変更、集約、exopolysaccharidesの生産、及びそのような増加抗生物質耐性10のような他の表現につながる。ここ数十年にわたって、多くの証拠はバイオフィルムは、慢性感染症の病因に大きな役割を果たすという仮説をサポー...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS2 (Focht Live-Cell) chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319131616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS2 chamber controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319-2-0303</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 mm glass coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>PH 40-1313-0319</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>#10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM without phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

co-culture models of pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells

細菌バイオフィルムは、さまざまなヒト疾患の番号に関連付けされているが、バイオフィルムの開発は、一般的に非生物表面上で検討されている。本稿では、文化の中で増殖したヒト気道上皮細胞（CFBE細胞）の緑膿菌のバイオフィルムを形成するためのプロトコルについて説明します。最初の方法で（静的共培養バイオフィルムモデルと呼ばれる）、P.緑膿菌は、標準組織培養プレート上にコンフルエントな単層として成長CFBE細胞とともにインキュベートする。細菌が上皮細胞に非常に有毒であるが、アルギニン遅延単層の破壊のほかには、十分な長さバイオフィルムのためにCFBE細胞を形成する。第二の方法は、（フローセル共培養バイオフィルムモデルと呼ばれる）、CFBE細胞のコンフルエントな単層を支持するガラスのカバースリップに対応するために、しばしばバイオフィルムの研究で使用されるバイオフィルムのフローセルの装置、の適応を含む。この単分子膜は、P.を接種する緑膿菌と蠕動ポンプは、細胞全体に新鮮な培地を流れる。両方のシステムでは、細菌のバイオフィルムは、接種後6-8時間以内に形成する。バイオフィルムの可視化は、P.の機能を使用することで改善され緑膿菌株は、構成的に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する。静的およびフローセルの共培養バイオアッセイは、初期のPのモデル系です。 緑膿菌の嚢胞性線維症（CF）肺の感染症、およびこれらの技術は、Pの異なる側面を許可するバイオフィルム細胞毒性、バイオフィルムCFUの測定、およびバイオフィルムを染色し、可視化を含め、検討する緑膿菌のバイオフィルム形成と病原性。

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

本論文では、成長の異なる方法を説明します<em&gt;緑膿菌</em&gt;培養ヒト気道上皮細胞上のバイオフィルム。これらのプロトコルは、バイオフィルムの可視化を含むバイオフィルム形成の異なる側面を、研究するために適応、バイオフィルムの染色、バイオフィルムのコロニー形成単位（CFU）を測定し、バイオフィルム細胞毒性を勉強することができます。

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

co-culture-models-pseudomonas-aeruginosa-biofilms-grown-on-live-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

22.1K ビュー.  Dartmouth College. 本論文では、成長の異なる方法を説明します緑膿菌培養ヒト気道上皮細胞上のバイオフィルム。これらのプロトコルは、バイオフィルムの可視化を含むバイオフィルム形成の異なる側面を、研究するために適応、バイオフィルムの染色、バイオフィルムのコロニー形成単位（CFU）を測定し、バイオフィルム細胞毒性を勉強することができます?...

ビデオ: Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

免疫・感染学

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

緑膿菌誘発肺傷害モデル

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

共培養モデルの緑膿菌バイオフィルム

要約

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フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

長期的な慢性

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価

緑膿菌誘発肺傷害モデル

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量

慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル

P. アフルギノーサ抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

共培養モデルの緑膿菌バイオフィルム

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フローセル内の緑膿菌と出芽酵母のバイオフィルム

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

長期的な慢性

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価

緑膿菌誘発肺傷害モデル

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

緑膿菌の小コロニー変異体の培養とアルギン酸の定量

慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル

P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

P. アフルギノーサ抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー