この方法は、嚢胞性線維症肺感染症で見るのと同様の細胞生理学およびバイオフィルム形態を引き起こす環境で細菌を増殖させることができます。肺は食肉業界の廃棄物なので、倫理的な懸念はありません。このモデルは、生きた動物モデルを必要とせずに人間の感染を模倣するプラットフォームを提供します。
この技術は、嚢胞性線維症肺に形成されるバイオフィルムに入り、破壊する可能性のある候補薬物をスクリーニングする新しい方法を研究者に与える。さらなる開発と検証により、EVPRモデルは特殊かつ個別化された抗生物質感受性試験に潜在的な使用を持つことができると考えています。殺処分直後に肺を入手し、国内の涼しい箱の中の実験室に運ぶ。
殺菌された表面および炎の下で働く。オートクレーブアルミホイルで覆われたきれいなプラスチック製のまな板の上に肺を置き、気管支がそのまま残っていることを確認します。肺は、アバトワールや輸送中に損傷があった場合、使用に適していません.
パレットナイフを炎の下に熱し、気管支を取り巻く肺の領域にナイフを非常に短時間触って組織の表面を殺菌する。無菌に取り付けられたカミソリの刃を使用して気管支を取り巻く表面組織を切り取り、切開を気管支に平行にして損傷を防ぎます。気管支が露出したら、最も高い点で気管支を通して断面切開を見えるようにします。
滅菌鉗子を使用して、気管支の自由端を軽く保持し、滅菌取り付けられたカミソリの刃を使用して残りの不要な組織を切り取ります。肺から気管支を取り除くために分岐が見える前に、気管支を横切って最終的な断面切開を行います.最初のDMEM RPMI 1640洗浄に気管支を入れる。
同じ肺から気管支の追加のセクションを洗浄し、収穫して、計画実験に十分な組織切片を得る。同じ肺から追加の気管支切片を洗浄に入れ、少なくとも2分間洗浄に残します。最初の洗浄から気管支を取り出し、滅菌ペトリ皿にサンプルを入れます。
滅菌鉗子で各気管支を軽く保持し、組織に損傷を与えないように注意してください。できるだけ多くの残りの軟部組織を取り除き、滅菌解剖はさみを使用して5ミリメートル幅のストリップに組織を切断します。気管支組織ストリップをすべて第2 DMEM RPMI 1640洗浄に入れる。
少なくとも2分間洗浄に入れ、滅菌鉗子を使用して2回目の洗浄からティッシュストリップを取り出し、清潔で無菌のペトリ皿に入れます。気管支に付着した残りの軟部組織を取り除き、滅菌解剖ハサミを使用してストリップを正方形に切ります。3番目のDMEM RPMI 1640ウォッシュをペトリ皿に加え、皿を渦巻いて洗浄中のティッシュピースを軽く混ぜます。
ペトリ皿から3回目の洗浄を行い、ティッシュピースを取り除かずに注ぎます。最後のSCFM洗浄を加え、すべての組織片が覆われていることを確認します。SCFMの組織をUV光下で5分間殺菌する。
滅菌された鉗子を使用して、各滅菌された気管支組織片をSCFMアガロースパッドを含む24ウェルプレートの個々の井戸に移します。各組織片を所望の細菌株で感染させるには、無菌0.5ミリリットルのインスリン注射器に取り付けられた29ゲージ針の先端を持つ寒天板上で成長したコロニーに触れ、コロニーを組織片に触り、表面を静かに刺します。感染していないコントロールの場合は、針の先端で組織片の表面をそっと刺し、ピペットを使用して各ウェルに500マイクロリットルのSCFMを加えます。
紫外線下の24ウェルプレートごとに通気性のあるシール膜を10分間殺菌します。24ウェルプレートから蓋を取り出し、通気性のある膜に交換し、揺れることなく37°Cでプレートをインキュベートします。少なくとも2つの独立した肺からの肺片の複製セットを設定し、陰性対照に1セット、検査する抗生物質の濃度ごとに1セットを使用する。
48時間のインキュベーションの後、感染していない組織片を視覚的に検査して内因性細菌の増殖を検査し、これらの切片の周りの培地が濁る原因となる。選択した研究種の典型的な成長が観察された場合は、新鮮な肺で実験を再開する。感染していない組織切片が細菌の増殖を示していないか、または最小限に示す場合は、1つの24ウェル洗浄プレートと1つの24ウェル治療プレートを調製する。
治療プレートの各ウェルには、抗生物質なしで、または関心のある抗生物質を含む新鮮なSCFMの500マイクロリットルが含まれるべきです。炎滅菌鉗子でインキュベーションプレートから各感染した組織片を取り除きます。洗浄板の新鮮な井戸で短く旋回して、非バイオフィルム関連細菌細胞を除去し、処理プレートの適切なウェルに移します。
新鮮な通気性の膜で処理プレートを密封し、18〜24時間振ることなく摂氏37度でインキュベートします。24ウェルプレートから各肺片を取り除き、PBSの1ミリリットルと金属ビーズの1グラムを含む無菌2ミリリットル均質化チューブに入れて、炎滅菌鉗子を使用してください。ビードは毎秒4メートルで40秒間打った。
PBSを使用して肺ホモゲンを連続的に希釈し、LB寒天にプレートし、個々の、未処理、および抗生物質処理組織片のコロニー形成単位を決定する。元生体豚肺またはEVPLで増殖すると、P.aeruginosaおよびS.aureusのバイオフィルムは、標準的な、業界公認のブロスMICおよび標準的な媒体を用いたディスクアッセイの感受性と比較して抗生物質に対する耐性の増加を示す。EVPL確立バイオフィルムに対する異なる抗生物質の様々な効果は区別可能である。
例えば、P.aeruginosaの殺死は、4〜16X MICシプロフロキサシンを有するEVPLでは達成されるが、4〜8X MICクロラムフェニコールでは達成されない。ディスクアッセイでリネゾリドの影響を受けやすいS.aureus集団は、EVPLにおいて標的血清濃度以上を生き残ることができる。最適化されたインビトロアッセイでさえ、EVPLのコリスチンに対するP.aeruginosa感受性を正確に予測することはできません。
EVPL増殖細菌の3つの丸太10の殺死を達成するために必要な抗生物質の量は、多くの場合、標準的なインビトロアッセイから計算されたMICまたはMBECよりも有意に高い。抗微生物剤の違いを区別することに加えて、このモデルは、異なる細菌増殖段階および異なる抗生物質投与間隔における感受性の変化を強調することができる。成熟したメルペネムに対するP.aeruginosaバイオフィルムの耐性の増加がここに示されている。
S.アウレウス生存率はフルクロキサシリンへの曝露後4時間と24時間で測定され、時間および分離株間の細菌細胞数の減少の違いを観察することを可能にした。細菌負荷の変動は、培養時間の延長に伴って増加することが多い。これは、48時間のバイオフィルム開発と抗生物質投与間隔を考慮したさらに24時間の暴露に続く未治療のコントロールで見ることができます。
解剖を通して優れた無菌技術を維持することが重要であるため、研究室や微生物学の仕事には決して使用しない研究室の領域で解剖を行うことをお勧めします。我々は最近、バイオフィルムへのコリスチンの参入を探求するためにモデルを使用し、モデルはバイオフィルムへの薬物送達を改善するための研究に使用する良い可能性を秘めている。
