この方法は、バイオフィルムの成長や開発中の行動特性に影響を与える主要な環境条件の特定方法など、バイオフィルム開発に関する重要な質問に答える上で役立ちます。この技術の主な利点は、多チャネルのマイクロ流体プレートが、統計的に有意な結果の迅速な取得を可能にすることです。この方法は、バイオフィルム構造に関する洞察を提供することができますが、抗生物質治療、およびバイオレメディエーションの研究にも適用できます。
一般的に、この方法に新しい個人は、プロトコルの詳細と細心のスキルに注意が必要であるため、苦労します。ソフトウェアへの機器の接続エラーを回避するには、まずPCワークステーションをオンにし、次に蛍光モジュールをオンにします。蛍光シャッターがオンになっていることを確認し、ハードウェアコントローラの電源を入れます。
次に、撮像システムコントローラとCCDカメラの電源を入れます。次に、イメージングステーションの電源を入れます。すべての機器の準備ができたら、制御アプリケーションを起動し、プレートの側面のラベルにあるプレート番号を入力します。
プライミングの場合は、まず、プレートの底部にあるガラス表面に触れることなく、パッケージから48ウェルマイクロ流体プレートを取り出し、プレート下部のガラススライドをレンズティッシュで洗浄します。マイクロ流体チャネルをプライミングするには、37°Cのピペット200マイクロリットルの最小限の媒体を出力ウェルに入れ、気泡を避けるように注意してください。その後、プレートをプレートステージに置きます。
インターフェースをエタノールで拭き取り、エタノールが乾燥したらプレートステージにシールします。コントロールモジュールの手動モードでは、流体をルリア・ベルタニブロスを摂氏37度、最大シウ素を1平方センチメートルあたり5回のdymとして設定します。出力ウェルをクリックして出力から入力ウェルへのフローをアクティブにし、チャンネルをプライミングします。
5分後、フローを一時停止して播種の準備をし、プレートをステージから慎重に取り除きます。次に、マイクロ流体チャネルにつながる内円から任意の媒体を除去することなく、出力ウェルから任意の残留媒体を吸引する。実験チャネルをシードするには、最小限の培地を300マイクロリットルずつ入力ウェルに加え、その後300マイクロリットルの細菌培養液を出力ウェルに添加します。
プレートをイメージングステージに戻し、プレートに置く前にエタノールでインターフェースを拭き取り、ライブカメラフィードを使用して単一のチャンネルに焦点を当てます。ライブフィードを目視でモニタリングしながら、約2〜4秒間1〜2日数センチメートルで流れを再開し、細胞がサーペンタインチャネルではなく実験チャネルに入ることを可能にし、温度制御されたステージにプレートを1時間放置して、細胞が付着するようにします。取り付け期間の終わりに、慎重にステージからプレートを取り出し、チャネルを乱すことなく、出力ウェルから細菌を吸引します。
次に、新しいピペットチップを使用して、入力ウェルから媒体を取り除きます。ソフトウェアでは、多次元取得を開いて顕微鏡画像取得を制御し、タイムラプス、多段位置、および複数波長を選択する。保存タブで、単純なベース名を作成し、ファイルが存在する場合は、ベース名がチェックされていることを確認します。
実験の基本的な詳細を説明に含めます。[ディレクトリの選択] をクリックして、すべてのファイルが保存されるフォルダを選択して[時間経過]タブで、実験時間の期間を24時間に調整し、実験全体を通して5分ごとに画像を取得する時間間隔を設定します。ライブカメラフィードと10xの目標を使用して、プレートに刻まれたチャンネル番号の上または下に位置するチャンネルの中心に焦点を合わせ、ステージ位置を設定します。
20xの目標に切り替え、チャネル内の最適な表示領域と焦点面を見つけます。次に、新しい設定でステージの位置をリストに追加します。波長メニューの下で、波長の数を3に設定し、最初の波長をFITC 100%カメラに設定し、10ミリ秒の露光時間、2番目の波長を明視野50%カメラ50%可視に設定し、3ミリ秒の露出時間を最小限に抑え、3番目の波長を閉じたままにします。
[AutoRun の編集] メニューで、[プロトコル設定] タブを開き、適切な実験せん断速度でフローを順方向に設定した 24 時間の期間で新しいプロトコルを設定します。[追加] をクリックして名前を付けて保存し、プロトコルを保存し、[シーケンス設定] タブを開きます。新しいシーケンスを設定するには、すべてのチャネルのデフォルトの流体として、37 度のルリア-ベルタニブロスを選択します。
チャンネル 1 ~ 12 のステップ反復 1 で、最初の実験せん断速度でプロトコルを選択し、すべてのチャネルを有効にします。チャンネル 13 ~ 24 では、第 2 実験せん断速度でプロトコルを選択し、すべてのチャネルを有効にします。次に、[適用] と [名前を付けて保存] を選択してシーケンスを保存し、[自動実行] メニューを開いて、自動実行に使用する保存済みのシーケンスを選択します。
時取り成長バイオフィルム実験をセットアップするには、最大1300マイクロ流体プレートの入力ウェルに無菌最小培地を加え、そのプレートをイメージングステージに戻します。その後、インターフェースをエタノールで拭き取り、プレートを密封します。プロトコルとシーケンスが正しく設定されていることを確認します。
[開始]を選択して自動実行を開始し、すぐに[取得]をクリックして顕微鏡画像コレクションを開始します。最初の画像取得の最後に、一時停止をクリックし、明視野の波長でライブ画像モードを選択します。[移動] を選択して各ステージ位置を表示し、[現在に設定] を選択して新しい設定を設定します。
次に、次の予定取得を開始する前に、[再開] をクリックします。この代表的なタイミング付きバイオフィルム成長実験において、バイオフィルムカバレッジ、または閾値表面積パーセントは、3つのせん断設定すべてで異なっていたが、せん断がバイオフィルム表面カバレッジに直接影響を与えたことを示す。バイオフィルム蓄積の総相対測定は、時間の関数として増加し、成長速度は最も高いせん断応力から最も低いせん断応力まで減少した。
それぞれの条件の下で、定量的な成長率を計算できる指数関数的成長の明確な期間もあった。全体として、すべてのせん断条件下で時間の経過とともに粗さ係数が低下し、バイオフィルム表面のすべてが滑らかになったことを示しています。ただし、最も低いせん断に比べて、せん断設定が高いほど、時間の経過とともにサーフェスが滑らかになっており、より速いせん断流がより滑らかで均一なサーフェスに寄与することを示しています。
また、このテクスチャエントロピー、または形態におけるランダム性は、すべてのせん断条件に対して時間の経過とともに増加した。この手順を実行する場合は、指定されたシーケンスに従い、各手順を正確に実行する時間を取ることを忘れないでください。必要なスキルは、マスターにいくつかの実行を取ることができます。
この手順に従って、HBLCまたはGCMSのような他の方法は、グルコースなどのサブストレートの濃度に関する追加の質問に答えるために、消費される。開発後、この技術は、バイオフィルム分野の研究者が制御された実験条件とハイドロセラピーサンプリングで一般的なフロー環境をリアルタイムで探索する道を開きました。BSL2細菌株での作業は非常に危険であり、適切な保護具の着用や適切な廃棄物プロトコルの使用などの予防措置は、この手順を実行する間は常に行われるべきであることを忘れないでください。
