私たちのプロトコルは、生体内に存在する可能性が高い方法と同様に、栄養および物理的な環境で抗生物質耐性細菌を研究する方法を提供します。この技術の最大の利点の1つは、感染関連の集団サイズで細菌の高解像度画像とフェノールトデータをキャプチャする能力です。これは、約 10 ~ 1,000 個のセルの集計です。
この手順を実証することは、私の研究室の大学院研究助手であるAlexa Gannonです。まず、ムチン含有培地を紫外光下で4時間殺菌する。UV処理されたムチンを無菌条件下で無菌1.7ミリリットルチューブに移し、マイナス20°Cでチューブを保管します。
緩衝塩基を調製した後、テキスト原稿に記載されているように、DNAを含む緩衝塩基にムチンのストック溶液を加える。実験前の夕方、LB寒天プレートを含む抗生物質から緑膿菌PAO1 pMRP91のいくつかのコロニーを含むLBスープの5ミリリットルを接種し、毎分250回転で攪拌して摂氏37度で細菌を一晩培養する。翌朝、実験を開始する少なくとも2時間前に、共焦点レーザー走査顕微鏡をオンにして、関連するイメージングソフトウェアでインキュベーションモジュールを開きます。
500マイクロリットルの培養液を5ミリリットルの新鮮なLBスープで希釈し、細菌懸濁液を摂氏37度、1分あたり250回転で60~90分間インキュベートします。細菌が対数相に入ると、遠心分離により細菌細胞をペレット化し、フィルター滅菌されたPBSで細胞を3回洗浄する。最後の洗浄後、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。
600ナノメートルで細菌細胞懸濁液の吸光度を測定し、合成嚢胞性線維症痰培地2の5ミリリットルで0.05の光学密度に必要な培養体積を決定する。4チャンバー光学培養皿の各チャンバーに1ミリリットルの細胞を加える前に、培地および渦中の細菌細胞懸濁液の計算量を穏やかに接種し、37°Cの静的条件下で4時間細菌をインキュベートする。共焦点レーザー走査顕微鏡による緑膿菌凝集体を画像化するには、インキュベーションの終わりに、抗生物質治療が複製する培養プレートの3つのウェルと、治療制御なしと1つを指定し、顕微鏡の加熱段階にプレートを置きます。
63X油浸漬目的を選択し、位置タブを開いて、明視野内の細菌凝集体を特定します。各ウェル内のイメージング領域を定義し、位置モジュールを使用してエリア位置を保存します。励起波長を488ナノメートル、発光波長を509ナノメートルに設定します。
取得モジュールで Z-stack オプションを選択して画像を取得し、ライン平均モジュールを使用して Z スタック画像の総容量内で GFP チャネルのバックグラウンド蛍光を低減します。時系列オプションを設定して、各ウェルの60個のスライスを18時間15分間隔でキャプチャし、明確なフォーカス戦略を使用して、実験中の各時点で再画像化される各位置の焦点面を保存します。画像実験を設定してから4〜1/2時間後、各位置を画像化し、抗生物質を添加する前に4つのウェルのそれぞれ内の総量を決定した。
6時間後、各井戸の中央に最小阻害濃度を2回下回る2回で抗生物質を穏やかに加え、空気液界面を吹き飛ばし、実験を開始して抗生物質後の治療イメージングを開始します。生きた細胞を単離するには、18時間のイメージング期間の終わりに、メーカーの勧告に従って適切な量のヨウ化プロピジウムを各ウェルにラベル付けします。インキュベーションの最後に、断熱容器を使用してプレートをフローサイトメーターに転送し、70ミクロンのノズルを使用してGFPとヨウ化プロピジウムを検出するためにサイトメーターを設定し、各培養上清の1ミリリットルのアリコートを最も低い流量で実行して、実行可能なGFP陽性および非生存性のプロピジウムヨウ化基体負性プロパチウム性のプロピドウム性の偽素基を並べ替えます。
集合ダイナミクスを定量化するには、画像を適切な画像解析ソフトウェアプログラムにロードし、GFPチャネルで未処理の制御および抗生物質処理培養物のために生成された数のヒストグラムを作成して、バックグラウンド蛍光の定量を可能にします。検出されたGFPボクセルが細菌バイオマスに相関していることを確認するには、GFP陽性ボクセルをGFPバックグラウンドカウント値の1.5倍以上と定義します。残りのすべてのボクセルに対して ISO サーフェスを生成し、個々の集約を検出するには、分割オブジェクトオプションを有効にして、集計をオブジェクトとして定義します。
見晴らしの良いモジュールを使用して、個々のオブジェクトのボリューム XYZ と GFP ボクセルの合計を計算します。このデータを外部の統計プラットフォームにエクスポートします。エクスポートされたデータをサイズでフィルタリングし、5立方メートル以上のボリュームを持つオブジェクトを定義します。
0.5立方メートル未満のオブジェクトを除去し、見晴らしの良いモジュールを使用して、各画像内の他のオブジェクトとの相対距離を計算します。あるいは、距離を式を使用して計算し、次に合計と平均計算を使用して、平均総質量量の総バイオマスを決定することができます。抗生物質塗布の4時間後に複数の生存可能な細菌凝集体が残るが、抗生物質処理された培養物内の総集団の総バイオマスは、未治療の培養物と比較して有意に減少する。
抗生物質治療後の高感度ヨウ化プロピジウム陽性および耐性GFP陽性集合体の間の空間パターンを決定するために、時系列顕微鏡を使用することができる。異なるサイズの集合体が全体の集団にどのように寄与するかを計算することによって、その大きさ、形状、位置に関連して、骨材が抗生物質治療にどのように反応するかのパターンを特定することができます。抗生物質治療後、生存可能な凝集体と生存不可能な凝集体は、蛍光シグナル発現に応じて正常に分離することができる。
私たちは、このプロトコルが同様の解像度で選択した生物を研究するために他の研究者を鼓舞することを願っています。私たちの目標は、感染部位に関係なく、これらの複雑なコミュニティで一般的な生物学的糸を見つけることです。
