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1。手術手技<ol><li>実験は無菌操作を使用して、特定の機関の動物使用のプロトコールに従って実施されるべきである。生体組織と接触する楽器と材料（ソリューション、テスト物質、トレーサー、針、など）動物福祉と研究上の潜在的な負の影響に感染して悪影響を防ぐために無菌でなければならない。 </li></ol> 2。麻酔<ol><li>ラットは、獣医イソフルラン気化器のシステムを使用して麻酔になります。イソフルランガスを気化させるために0.8 L / minの速度で、医療グレードの酸素を使用してください。呼吸が鈍化していると動物が落ち着いたようになるまで4％のイソフルラン濃度で接続されている麻酔ボックスとダイヤルで動物を置きます。 </li><li>次に、定位フレーム用ガスマスクの添付ファイルへのガスの流れを切り替え、定位固定装置に動物を配置。 2％、モニターの麻酔にイソフルラン濃度を下げてください。大型動物（&gt; 300グラム）はイソフルランの濃度が高いが必要な場合があります。麻酔は手術中に監視し、イソフルラン投与量は適宜調整する必要があります。呼吸の深さと速度は、常に評価されなければならない、と深い苦痛の欠如のためのつま先のピンチの評価は（5分ごとに）実行する必要があります。 </li><li>手術が完了したら、イソフルランをオフにすると定位装置から取り外す前に数分間、息の酸素に動物を可能にする。体温は、手術の毛布及び/または手術中に規制加熱毛布を使用してある動物をカバーすることによって維持されるべきである。 </li></ol> 3。眼内注射用の注射器の準備<ol><li>最初に、眼内注射を行うための注射器システムを組み立てます。 10μLRNガス密閉1701ハミルトンのシリンジは、注入に使用されます。注射器の端上の任意​​の針またはRNナットの存在を取り外します。 </li><li>圧縮継手のフェルールPEEKカップにPFAフェルールを挿入します。その後、注射器の端に完全なフィッティングを挿入し、ゆるく上からRNのナットをねじ込みます。 </li><li> RNナットの開口部を通して、圧縮フィッティングに1 / 16インチPEEKチューブの一端を挿入します。 PEEKチューブが完全に装着されていることを確認します。 PEEKチューブをシール、フェルールを圧縮するためにRNのナットを締めます。 </li><li>デュアルRNガラスカプラーの両端にステップ3.2を実行してください。 RNのナットを締めて、デュアルRNガラスカプラーの一端にPEEKチューブの自由端を取り付けます。 </li><li>プルガラスのマイクロピペットは、噴射システムのための針とバレルを形成します。ガラスピペットを作製し、デュアルRNガラスカプラーの自由端にガラスピペットを挿入するために1.5 mm外径肉厚ガラスキャピラリーチューブを使用してください。場所にピペットを修正するためにRNのナットを締めます。 </li><li>プルガラスのマイクロピペットの先端の細い眼内注射を行うために一般的には小さすぎます。適切な直径の先端を作成するために、手術用顕微鏡を使用して、視覚的な指導の下でガラスピペットの先端を破る。ガラス標本スライドのつや消しの終わりは、よくピペットを分解するのに適しています。角度でピペットを保持し、ブレークを作成するには、ガラスのフロスティングに沿って先端をこする。理想的には、最後の先端は少し斜めしてください。それは良いヒントを生成するためにいくつかの試みがかかる場合がありますので、使用前に複数のピペットを引く。 </li><li>インジェクションシステムは油圧式です。そのため、注射器、PEEKチューブのリンカ、デュアルRNガラスのカプラーとガラスのマイクロピペットは、使用前にミネラルオイルで満たされている必要があります。ハミルトンシリンジ株式会社（PRMKIT）からプライミングキットを使用して、ミネラルオイルでプライミングの注射器を埋める。粘性油の簡単な通過を可能にする大径の針を使用してください。 10μLハミルトンのシリンジの注射筒内に収まるハミルトン90030針で針を交換してください。次に、鉱物油を注入しながらシールを提供するために、ハミルトン90030針を介してゴム隔膜を置きます。 </li><li>噴射システムの10μLハミルトンシリンジのバレルの後部にプライミング注射器のハミルトン90030針を挿入します。シールを作成するために注射器の端にしっかりとセプタムを押してください。 </li><li>ゆっくりプランジャーを押し下げる。あなたは、インジェクションシステムのガラス素子を通して、鉱物油のパスを参照してください、と最後にガラスピペットに充填される。管に沿って気泡を除去するために、射出システムを介してオイルのすべてをプッシュする。充填シリンジは鉱物油が不足している場合、常に空気の気泡の形成を防ぐためにオイルを塗布しながら、ゆっくりと針を撤回。リフィルプライミング注射をし、再度注入。 </li><li>全体システムは無料のミネラルオイルと泡で満たされている場合、10μLハミルトンシリンジのオリジナルプランジャーを挿入します。システムから追加のミネラルオイルを除去するために、その旅の終わりまで、プランジャーを押し下げ。ガラスマイクロピペットクリーンと70％エタノールで清潔なシリンジの端を拭きます。 </li><li> Withdraワットバレルの2μLマークにシリンジのプランジャー。ガラスのマイクロピペットの最後には空気が鉱油と注入されるように、目的の流体の間に緩衝地帯を提供することで入力されます。ピペットのバレルは、現在必要なソリューションにマイクロピペットの先端を配置し、ハミルトンシリンジのプランジャーを取り出すことにより埋めることができます。成体ラットの目にソリューションの以上4から5μLを注入しないでください。 </li></ol> 4。眼内注射の方法：グローバル網膜を対象に<ol><li>定位フレーム（セクション2で説明したように）で麻酔し、安全な動物で、Alcaineの目が局所的に角膜を麻酔に低下します。あなたの指と場所角膜の表面に麻酔液の1滴でまぶたを開きます。 </li><li>硝子体腔内にガラスピペットを挿入し、必要なソリューションを提供シリンジにプランジャーを押し下げるためにピペットの位置、および別のを維持するためにいずれかの注射は、2人が必要です。 </li><li>手術用顕微鏡、グリップガラスマイクロピペットと指でデュアルRNガラスカプラーの下に。注射部位の反対側の&quot;V&quot;の形を形成し、もう一方の手の指でまぶたを広げ。まぶたにトラクションを適用することにより、眼は角膜輪部の背後にある後面を露出させる、軌道から昇格されます。注射部位の反対側の指で&quot;V&quot;形状を作成することによって、クレードルは、注入時の安定性を提供する目のために形成される。 </li><li>ゆっくりと下向きの角度で、強膜を通して血管を欠い領域で、結膜を通してガラスのマイクロピペットの先端を挿入し、。ピペットは、強膜を貫通するときには、小さな&quot;ポップ&quot;を感じてください。やや下向きの角度でピペットを挿入すると針を挿入するときにレンズを打つ可能性が少なくなります。 </li><li>注射器を持っている人は今シリンジで2μLのマークにプランジャーを押すことによって溶液4μLを注入してください。注射は合計で約1〜2秒かかります。非常に遅い速度で注入することは&gt; 3秒硝子体腔を通じて、ソリューションの初期拡散を低減します。あなたは、それによって手続きの成功を検証する、顕微鏡下で硝子体腔を通じてフラッシング注入溶液を見ることができます。 </li><li>約5秒間安定したマイクロピペットを保持し、針が挿入されたと同じ方向に、撤回。結膜が強膜穿刺を密封するために助け、小さな開口部にバックフラップになります。 </li><li>リカバリ中に角膜の乾燥を防ぐため、および回復のケージに動物を戻すために、眼科の眼軟膏（涙ナトゥPM）で角膜の表面を覆う。 </li><li>手術後の鎮痛薬は、動物のケアの当局のガイドラインにしたがって投与されるべきである、と動物は、慎重に手術後に監視する必要があります。 </li></ol> 5。選択的に視神経の断端から網膜神経節細胞を標的<ol><li>軸索切断に続く、視神経の切り株にトレーサー、薬物、プラスミド、siRNAまたはウイルスベクターを適用し、直接逆行性輸送を介して網膜神経節細胞をターゲットとしています。これは、最初の&quot;視神経切断プロトコル&quot;22によると視神経切断を行うことによって実現されます。 </li><li>視神経にgelfoamを使用して、または直接注入の2つは、この手順を達成する主な方法があります。 </li><li> gelfoamメソッドがトレース逆行に似ていますが、視神経で実験的な治療を配信するときには、軸索切断前上丘1週間に逆行トレーサーを注入することにより、網膜神経節細胞に事前にラベルすることが望ましいです。これは、一部のインスタンスで神経トレーサー実験物質またはその逆の逆行輸送を妨げることができる、ため、セルのトレースのために重要です。 </li><li>視神経が切断された直後に、実験的な溶液に浸漬gelfoamの小片はtransected視神経の切り株の上に配置されています。軌道の内容は、以前の場所に戻されます。目は、それが視神経の端の上に保つこと、それが軌道にgelfoamの部分をプッシュダウンする鉗子を使用する必要が中立位置に戻されます。 </li><li>注入法は、逆行性軸索流によって輸送されるためには軸索の細胞質へのアクセスを得る必要がある物質を送達するためのより効果的です。これは、siRNAとプラスミド、及び場合によってはウイルスベクターが含まれています。 5〜10μlのハミルトンシリンジはtransected視神経に必要なソリューションをインジェクトするために使用されます。 </li><li>ファインチップデュモン鉗子による視神経のエッジグリップ。ベベルが表示されなくなるまで、平行神経で、視神経に針の先端を挿入。挿入された針は神経によってすべての側面に包まれる。短いベベルと針が望ましい。 </li><li> nを一度eedleが神経に挿入され、穏やかに先端の細いピンセットで神経の両側をつまんで注射器4分の1回転を時計回りまたは反時計回りに回転させながら、ソリューションの4分の1を注入する。 </li><li>あなたが針の完全な回転を完成し、注射器の内容全体を注入するまで、ステップ5.7を繰り返し続ける。最良の結果を得るためには気密10μLハミルトンシリンジを用いて溶液10μLの合計を注入する。 </li><li>神経からシリンジの先端を削除します。これは軸索の末端による取り込みのための追加のプールを形成するように軌道内神経から還流している余分な注入液を残す。 </li><li>彼らの元の位置に軌道の内容を返す、傷口を閉じ、そして動物が回復することができます。 </li><li>手術後の鎮痛薬は、動物のケアの当局のガイドラインにしたがって投与されるべきである、と動物は、慎重に手術後に監視する必要があります。 </li></ol> 6。代表的な結果： 眼内注射は、世界的に網膜内のすべてのセルを対象とし、神経節細胞が硝子体腔に隣接する網膜の最も内側の神経層、に置かれているので、負傷RGCsに配信物質のためによく働く。 RGCsも直接transected視神経の切り株に物質を提供することで、ターゲットとすることができます。 Fluorogold逆行標識されたRGCsは、図1に示すように、神経切り株からペプチド、薬物、ベクター、プラスミド、またはsiRNAを用いてターゲットとすることができます。図1A - Cは、上丘にFluorogoldを注入することによって事前に標識されたRGCsのsomaの複数形でCy3標識ペプチドの局在を示しています。 Cy3で標識されたペプチドは、すぐに軸索切断後の視神経に注入され、そして網膜は、固定時の組織の外浸出からペプチドを防ぐために生きて画像化した。図1D - Fは、Cy​​3標識siRNAとaxotomized RGCsでFluorogold逆行性トレーサーの局在を示しています。 Cy3標識siRNAはすぐに軸索切断後の視神経の切り株に注入し、網膜が生きて画像化した。 <img src="/files/ftp_upload/2261/2261fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。視神経の切り株に標識されたペプチドまたはsiRNAのどちらかの軸索切断と注射後1日でflatmounted網膜におけるRGCsの落射蛍光顕微鏡写真。標識ペプチドの逆行性輸送、視神経への軸索切断し、ペプチド注入1日後に続くRGCsでaxotomized RGCsの（）Fluorogold逆行性標識法1日のpostaxotomyで（B）Cy3蛍光。の（C）オーバーレイ（A）と（B）Fluorogoldラベル付けRGCsでCy3標識ペプチドの選択的局在を証明しています。 （DF）Fluorogoldラベル付けRGCs（D）の細胞体はまた、オーバーレイ（F）に示すように24時間以前の視神経の切り株に注入Cy3標識siRNAは（E）で充填される。 AC中のスケールバーは50μmである。 DFでのスケールバーは20μmである。

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M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+Nerve+Transection:+A+Model+of+Adult.">Optic Nerve Transection: A Model of Adult.</a> J Vis Exp. , .</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

視神経切断は、成体中枢神経系ニューロンのアポトーシスの高度に再現可能なモデルです。この原稿で実証実験操作は、損傷後のRGCアポトーシスのメカニズムの研究を可能にする。 眼内注射は、網膜の全世界をターゲットするのに便利です。それはガラスピペットの先端にレンズを傷つけないよう重要であるとして、この手順では、いくつかの練習が必要です。レンズ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alcaine Eye Drops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2&#x201D;/2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>80030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch Compression Fittings</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55751-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supelco, Bellefonte, PA</td>
<td>Z226661</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual RN Glass Coupler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>55752-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Syringe Co.</td>
<td>PRMKIT</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

methods for experimental manipulations after optic nerve transection in the mammalian cns

網膜神経節細胞は（RGCs）視神経を経由して、網膜から脳にその出力を視覚情報CNSニューロンです。視神経は、全体RGC​​人口の軸索を切断、目と完全にtransected（axotomized）の軌道内でアクセスすることができます。視神経切断は、成体中枢神経系1-4のアポトーシス神経細胞死の再現可能なモデルです。眼の硝子体腔は眼内注射を介して実験操作を可能にして、網膜への薬物送達のためのカプセルとして機能するので、このモデルは特に魅力的です。硝子体液を介して化学物質の拡散は、彼らが全体のRGCの人口に基づいて行動することを保証します。ウイルスベクター、プラスミドまたは短い干渉RNAは（siRNAが）も5-12を網膜細胞に感染またはトランスフェクトするために硝子体腔に配信することができます。アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの高い親和性は、注射部位6、7、13-15近くの細胞の90％に近い感染率で、ターゲットRGCsに有益です。また、RGCsが選択的に標的上丘10に視神経16から19または注入ベクトルの切り口にしたsiRNA、プラスミド、またはウイルスベクターを適用することにより、トランスフェクションすることができる。これは、研究者は他のバイスタンダーの神経細胞または周囲のグリア細胞上で交絡の影響なしに負傷した神経細胞集団のアポトーシスのメカニズムを研究することができます。 RGCのアポトーシスは、細胞死、細胞が急速に退化した後、3〜4日のpostaxotomyを遅延さにより時間経過特性を持っています。これは、アポトーシスに関与する経路に対して誘導実験操作のためのウィンドウが用意されています。直接transected視神経の切り株からRGCsをターゲットの操作はすぐに神経を切断した後、軸索切断時に実行されます。これとは対照的に、物質が眼内経路を介して配信されるとき、それらはaxotomized RGCsのアポトーシスの開始の前に、手術前または手術後3日以内に注入することができる。現在の記事では、視神経切断後の実験操作にはいくつかの方法を示しています。

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

視神経切断は、成体中枢神経系の損傷の広く使用されているモデルです。このモデルは、世界的に網膜をターゲットにするか、直接網膜神経節細胞の損傷した神経細胞集団を対象に実験操作の数を実行するための理想的です。

哺乳類の中枢神経系における視神経切断後の実験操作のための方法

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K ビュー.  University of Toronto. 視神経切断は、成体中枢神経系の損傷の広く使用されているモデルです。このモデルは、世界的に網膜をターゲットにするか、直接網膜神経節細胞の損傷した神経細胞集団を対象に実験操作の数を実行するための理想的です。

ビデオ: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

視神経切断：中枢神経系における成人ニューロンのアポトーシスのモデル

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

神経科学

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

網膜神経節細胞の生存を研究するために視神経挫滅モデルマウス

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

マウスにおける造影MRIによる視神経線維の整合性in vivoイメージング

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

ラット視神経への注入のための低侵襲テクニック

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

実験視神経の脱髄のラットモデルにおける視覚誘発電位の記録

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.