著者は、原稿を編集するための彼らの財政支援のために博士FanieBarnabé-ハイダーにADIR（法人住所AUX Insuffisants Respiratoires有料補佐官）と財団ドゥアベニールを承認したいと思います。

1。嗅粘膜および嗅球の初代培養<ol><li>解剖の前に<ol><li>ペニシリン/ストレプトマイシンのウシ胎児血清（FBS）の5ミリリットルと1ミリリットルを補足したカルシウムを含まないダルベッコ改変イーグル/ハムF12培地（DMEM/F12）の44ミリリットルを追加することで、50ミリリットルのために、メディアを作る。 </li><li>ポリ-L-リシンでコート75cm 2のフラスコ（50μg/ mlの、1.5μgの/ cm 2）を 、室温で1時間。 </li><li> PBS 1Xでフラスコを洗浄します。 </li><li> 1週間まで冷蔵庫でコーティングしたフラスコに保管してください。 </li></ol></li><li>解剖<ol><li>安楽死のいずれかの方法は、金融機関の動物管理使用委員会が事前に承認され、有資格者が行ってください。 </li><li>このようなフィッシャーラットなどの近交系ラットを選択してください。 </li><li>ラットは、ペントバルビタールナトリウムや、ケタミン/キシラジン麻酔などの他の注射可能な形態で深麻酔を入力していることが確認された後、彼とRの首を切る肌を残したまま削除。 </li><li>前部から後部に頭蓋骨を開きます。 </li><li>髄膜を避けるように注意しながら、OBを削除します。 </li><li>同じラットで、鼻腔sagittalyを開きます。 </li><li>呼吸器粘膜を避けるように注意しながら、OMを削除します。 OMの上皮が簡単に黄色がかった色で識別することができることに注意してください。 </li><li> OMの解剖についての更なる詳細なプロトコルは、前に見つけることができ<a href="https://www.jove.com/video/2762/isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans">J. VIS。 EXP</a> 。出版13。 </li></ol></li><li>文化<ol><li> 37℃で45分間、0.1％のトリプシンを含有するハンクス緩衝塩溶液（HBSS）中OBを配置する</li><li> 37℃で45分間0.05％コラゲナーゼAを含有するHBSSの代わりOM </li><li>温かい培地2mlを添加して、酵素消化を停止する。 </li><li>培地で細胞を洗浄し、3分間300×gで、それらを遠心する。 </li><li> 2の粉砕物のサンプル均質な細胞懸濁液が得られるまでP1000ピペットを用いて培地1ml。 </li><li>プレート暖かい培地25mlでプレコートフラスコ（5〜10×10 6細胞/フラスコ）内のセル。 </li><li> 5％のCO 2、37℃で細胞をインキュベートし、培養。 </li><li> 2日ごとに培地の半分を変更します。 </li><li> インビトロで 6-8日後、小細胞試料上のp75陽性細胞の割合を確認し、フローサイトメトリーまたは免疫細胞化学により、げっ歯類であると仮定したOEC。これらの分析のために、他のマーカーは、GFAPおよびS100βとして研究することができる。 </li></ol></li><li>フローサイトメトリー分析<ol><li> 「細胞移植」（セクションの下に2.2）で説明したように、細胞を収集します。 </li><li> 4℃で15分間でp75の一次抗体（1:100）でそれらをインキュベートする</li><li> PBS-EDTAを2ミリリットルで細胞を洗浄し、3分間300×gで、それらを遠心する。 </li><li> 15時のPE結合抗マウス二次抗体で細胞をインキュベートする（1:200）暗所において4℃で分。 </li><li> PBS-EDTAを2ミリリットルで細胞を洗浄し、3分間300×gで、それらを遠心する。 </li><li> PBS-EDTAを500μlの細胞を再懸濁。 </li><li>フローサイトメーターで10月30日×10 3個の細胞を分析します。 </li></ol></li><li>免疫細胞化学分析<ol><li> 「培養」（下記セクション1.1.2）に記載のように48時間プレコート6ウェルプレートに細胞をプレート。 </li><li> PBSで細胞を洗浄。 </li><li>室温で15分間4％PFAで細胞を固定します。 </li><li> PBSで細胞を洗浄。 </li><li> RTで15分間、PBS /トリトンX100（0.1％）で細胞をインキュベートする。 </li><li> PBSで細胞を洗浄。 </li><li> 4℃で一晩P75、S100βおよびGFAP：一次抗体（1:200）で細胞をインキュベートします</li><li> PBSで細胞を洗浄。 </li><li>暗闇の中で室温で1時間の間、二次抗体（1:500）で細胞をインキュベートする。 </li><li> PBSで細胞を洗浄。 </li><li> Rにおけるヘキスト10分で細胞を培養する暗闇の中のT。 </li><li> PBSで細胞を洗浄。 </li><li>蛍光顕微鏡を用いて細胞を分析します。 </li></ol></li><li> GFP標識細胞<ol><li>五日、移植前に、強化されたGFP（：20感染多重度）を保有するレンチウイルスベクターを用いて、一晩、OBとOMの文化に感染する。 </li><li>少量のサンプル「文化」（セクション1.1）で、前述のように、フローサイトメトリーによるGFP陽性細胞の割合に移植チェック前。 </li></ol></li></ol> 2。手術と移植<ol><li>反回神経吻合<ol><li>動物とのすべての実験は、金融機関の動物管理使用委員会が事前に承認され、有資格者が行ってください。 </li><li>手術のオートクレーブの前にすべての機器や外科的手技を通して無菌性を維持する。 </li><li>塩酸ケタミンの腹腔内注射（12.5ミリグラム/ kg）および塩酸クロルプロマジン（によってラットを麻酔0.625 mg / kg）を。手術前に足指のピンチで麻酔の妥当性を評価する。 </li><li>背臥位にラットを配置します。 </li><li>メスで2センチメートル垂直ミディアム子宮頸皮膚切開を行う。 </li><li>中央白線次舌骨下筋の縦切開を行う。 </li><li>舌骨下筋の間の自動静的リトラクターを使用して喉頭を公開します。 </li><li> RLNを公開します。 </li><li>微視的な制御の下で、第七の気管リングのレベルでmicroscissorsに完全に神経を切った。 </li><li>微視的な制御の下で11.0縫合糸の1ポイントを使用して吻合を行う。 この手術は喉頭の具体的な運動神経除去につながる。 </li></ol></li><li>細胞移植<ol><li>ただ、移植前に、37℃で5分間0.05％トリプシンEDTAを用いて皿から細胞を除去する</li><li>温かい培地2mlを添加して、酵素消化を停止する。 </li><li> 3分間300×gで遠心分離する。 </li><lI&gt;顕微鏡下で血球計数器を用いて細胞をカウントし、特定のプロトコルに応じて細胞内濃度を調整します。このモデルでは、所望の濃度は、DMEM/F1230μlの1.2から6×10 6個の細胞の間であった。 </li><li>移植する前に、1.5mlチューブ内DMEM/F12-Matrige Lの1時02ミックス（本実験では30および60μL）で携帯の準備を行い、氷の上に置きます。 非特異的効果を回避するために、マトリゲルを低減成長因子を用いる。 </li><li>ただ移植前にマトリゲル媒体ミックスをウォームアップして数秒間手でチューブを保持します。 </li><li>ピペットを用いて吻合部位でのミックスを解任し、損傷神経に混合自己集合するまで待ちます。 </li><li> 4.0縫合糸で筋肉と皮膚を閉じます。 </li><li>ハウス個別ラットと24時間加熱ランプの下に保つ。 </li></ol></li></ol> 3。評価<ol><li>喉頭鏡検査法<ol><li> intraperitでラットを麻酔塩酸ケタミン（12.5 mg / kg）をし、クロルプロマジン塩酸塩（0.625 mg / kg）をのoneal注入。ラットを確定する前のプロトコルを進めるために、TOEのピンチで麻酔する。 </li><li>背臥位にラットを配置します。 </li><li>喉頭の最高の眺めを提供するように調節30°videolaryngoscopeを挿入します。各記録のための同じビューを再現するために解剖学的ランドマークを決定します。 </li><li> videolaryngoscope（5-10シーケンス/動物）を使用して、声帯の動きを記録します。各動物について、連続する最大転および最大拉致3つのシーケンスを選択します。 </li><li>画像解析ソフトウェアを用いて喉頭機能を分析する。最大拉致や声帯の最大転の動きの違いを測定することにより、絶対的な角運動を決定する。運動の振幅を測定することにより、動的なスコアを決定する。共同運動と逆説的な動きを測定することにより、機能的なスコアを決定する。 </li></ol></li><li>電図（EMG） <ol><lI&gt;電気的絶縁のためのラットのハムストリングの筋肉に電極を配置します。 </li><li> 「反回神経吻合」（セクション2.1）で、前述のように皮膚や筋肉を開くことによって、喉頭、気管を公開します。 </li><li>輪状甲状軟骨を公開します。 </li><li> microscissorsを使用して後部輪状披裂（PCA）は、筋肉を露出するように輪状甲状軟骨を開きます。 </li><li> PCA筋における単極電極針（38×0.45 mm）をご紹介します。 </li><li>自発換気中収集システムを使用して、PCAの筋肉の電気的な筋活動を記録します。 </li><li>呼吸と豊かさと同期の点で筋活動を分析します。 、より豊かな活動をトレース押韻：増加吸気とトレース押韻が、貧しい人々のトレース（Neurogenの）、2：インスピレーション、1時に無韻トレース、増加なし：0：筋電図を分析するには、以下の基準を使用して0から3までの定性的スコアを割り当て3：私を構成する、非常に豊かなトレース押韻最大意図的行動と同様nterferenceパターン。 </li><li>レイテンシと電位持続時間を測定するために、迷走神経を公開します。 RLNは、その小さなサイズのため、刺激中に破損することができるため、迷走神経を刺激のサイトとして選ばれる。 </li><li>電極と迷走神経を刺激する。 </li><li> PCAの筋肉に電気信号を記録します。レイテンシと電位持続時間を測定します。可能であれば、筋肉活動、そのようなパワーラブシステムなどの待ち時間や電位持続時間を記録するために取得モジュールを使用しています。 </li></ol></li><li>組織学<ol><li>ペントバルビタールの過剰摂取を用いて動物を安楽死させる。 </li><li>微視的な管理下にRLNの遠位断端を外します。 RLNの遠位部分は、吻合と喉頭との間の部分として定義される。 11.0縫合糸は非吸収性縫合糸であるので、それは数週間、手術後吻合部位を発見することが可能であることに注意してください。 </li><li> 0.1 Mリン酸を2％グルタルアルデヒド中RLNの遠位部分を配置する液（pH = 7.3）で4℃で2時間</li><li>慎重に冠状断面を実現するためにサンプルを向ける。 </li><li>リン酸緩衝液でサンプルを洗浄します。 </li><li> 1％カコジル中、室温で60分間小さなセグメント（3-4 mm長）とPostfixのにカットのOsO 4とエタノールで脱水し、バッファリング。 </li><li>オリエントシリコン金型内のサンプルや、POLYBED 812、DDSAとMNAになる樹脂中に埋め込まれた加速器BDMAの2％を添加した。 </li><li> Pyramitome超薄Systemを用いた半薄横断切片（1μmの厚さ）を作る。 </li><li> 70℃で75秒間、1％の四ホウ酸ナトリウムの0.1％トルイジンブルーで染色</li><li>計数分析システムでRLNサンプルを分析する。繊維の数をカウントし、ミエリン鞘の外側及び内側境界を決定することによって有髄神経線維のプロファイルを測定する。 </li></ol></li><li>移植<ol><li>移植用の細胞を調製し、前述のように細胞を移植「細胞移植」（セクション2.2）であった。 </li><li>分析</li><li>ペントバルビタールの過剰摂取を用いて動物を安楽死させる。動物の固定は、4％PFAの心臓内注射を用いて行うことができることに留意されたい。 </li><li> RLNの約2cmに削除します。 RLNの近位および遠位の部分を使用してください。 </li><li>液体窒素中でRLNサンプルを修正します。 </li><li> -80℃でのサンプルの保存</li><li>カットサンプルは縦方向にクライオスタット（10〜20ミクロンの厚さの）を使用して。 </li><li> GFP陽性細胞を検出するために蛍光顕微鏡下で試料を分析する。抗GFP抗体は蛍光発光を増大させるとcostainingsを実行するために用いることができる。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia.">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+of+olfactory+ensheathing+cells+from+olfactory+bulb+and+olfactory+mucosa.">Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa.</a> Glia. 58, 1570-1580 (1002).</li><li>Honore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+genetic+profiling+of+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+from+the+olfactory+bulb.">Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb.</a> Glia. 60, 404-413 (2012).</li><li>Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+glia:+their+contribution+to+primary+olfactory+nervous+system+regeneration+and+their+regenerative+potential+following+transplantation+into+the+injured+spinal+cord.">Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.</a> Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).</li><li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes.">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li><li>Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+olfactory+ensheathing+cells+express+nerve+growth+factor,+brain-derived+neurotrophic+factor,+glia+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+their+receptors.">Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).</li><li>Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+nodal+formation+of+regenerated+peripheral+nerve+fibers+following+transplantation+of+acutely+prepared+olfactory+ensheathing+cells.">Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells.</a> Brain Res. 1125, 1-8 (2006).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+promotes+axonal+regeneration+and+functional+recovery+of+peripheral+nerve+lesion+in+rats.">Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats.</a> Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).</li><li>Guntinas-Lichius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+stimulates+the+collateral+sprouting+from+axotomized+adult+rat+facial+motoneurons.">Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons.</a> Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).</li><li>Makoukji, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+enhances+remyelination+of+peripheral+nerves.">Lithium enhances remyelination of peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+mucosa+and+bulb+origin+enhances+functional+recovery+after+peripheral+nerve+lesion.">Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion.</a> PloS one. 6, 22816 (2011).</li><li>Paviot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+laryngeal+motor+nerve+repair+is+greater+with+bulbar+than+with+mucosal+olfactory+ensheathing+cells.">Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells.</a> Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).</li><li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+nasal+olfactory+stem+cells+from+rodents+or+humans.">Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+purification+for+establishing+primary+cultures+of+ensheathing+cells+from+the+adult+olfactory+bulb.">New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb.</a> Glia. 34, 81-87 (2001).</li><li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose.">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li><li>Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Although+olfactory+ensheathing+cells+have+remarkable+potential+to+sustain+nerve+regeneration,+they+cannot+be+applied+to+a+severe+vagus+nerve+section/resection+model.">Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model.</a> Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで紹介するテクニックは、たOEC末梢神経損傷モデルにおいて細胞移植を研究するための有用なモデルにする。細胞培養プロトコルは比較的簡単であり、容易に行うことができる。一方、外科的手技は、RLNの特定のセクション/吻合で、経験を必要とし、有資格者が行ってください。 このプロトコルに記載の手順は、可能な最良の結果を得るために焦点を当てる重要な?...

嗅粘膜（OM）は、中枢神経系、末梢神経系および嗅球（OB）において、一次嗅覚系は、2つの異なる部分から構成されている。一次嗅覚系は、哺乳動物種での生活を通して、自己再生への一次嗅覚ニューロン（PON）の容量を特徴としている。この能力に起因OMにおける神経幹細胞の存在により可能となる。 OMからOBへ​​のPONの成長と再生を嗅覚神経鞘細胞と呼ばれる特殊化したグリア細胞（たOEC）によって促進される。たOECは1を OBにOMからPONの神経発生に有利な微小環境を作成する神経堤細胞である。これにより、たOECは、OMで、細胞の2,3の異なる亜集団を構成しているOBで見つけることができます。たOECの異なる特性は、いくつかの神経系病変パラダイム4における細胞移植のためにそれらを使用するために、鉛の科学者を持っている。実際に、広報たOECは、グリア瘢痕を低減し、増殖因子を産生表参道軸索の再成長、そして自由にアストロサイト5,6と混ざります。しかし、これらの研究の大部分は、脊髄損傷（SCI）に基づくものである。それらのいくつかは、末梢神経損傷（PNI）の後に7,8たOECを使用している。 末梢神経系は、神経損傷後に再生するのに最適な容量を持っていますが、完全なセクションでは、異常な軸索再生を誘導する。実際、（RLN）フェイシャルまたは反回神経の完全な離断後に誤ってルーティング軸索は、共同運動と呼ばれる筋肉cocontractionsを引き起こす。したがって、軸索の再成長を定量化するだけでなく、筋肉収縮の効率を評価するために、PNIのモデルを提案することで最も重要である。文献に記載されている最も一般的なモデルは、顔面神経病変9,10に基づいています。このモデルでは、機能的な評価は、ウィスカの動き10の回収に基づいています。しかしそれは楽章の効率を実証するために複雑であるementsと筋肉cocontractions現象を判別する。ここではRLN病変に基づいてモデルを提案する。このモデルは、軸索の再成長と声帯の動きだけでなく、携帯移植11,12の後、これらの動きの効率性と機能性だけでなく、評価することができます。このプロトコルは、RLNセクション/吻合モデルにOMやOBからの文化や移植たOECにステップの手順でステップを提供し、手術後、動物を評価すること。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="591">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">E3521T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E3387M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1152-8876</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M3467Y</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M3513P</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cacodylate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03256.0100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DDSA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00563-450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MNA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00886-450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDMA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00141-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">POLYBED 812</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>08791-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-mouse&#160;</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>550589</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel GFR</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>356231</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti P75</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB 365</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11.0 Wire</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>FG 2881</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Toluidine Blue&#160;</td>
			<td>RAL DIAGNOSTICS</td>
			<td>361590-0025</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Sigma 2-16PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td>Faster</td>
			<td style="width:197px;">BH-EN 2003 S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>FACSCalibur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Videolaryngoscope</td>
			<td>Karl Storz Endoskope</td>
			<td>Telecam SL NLSC 20212120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition system</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Powerlab system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramitome Ultramicrotomy System&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Leica</td>
			<td>Ultracut S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis system</td>
			<td>Explora Nova</td>
			<td>Mercator</td>
		</tr>
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transplantation of olfactory ensheathing cells to evaluate functional recovery after peripheral nerve injury

<html>嗅神経鞘細胞（たOEC）が、一次嗅覚神経細胞の成長や再生を可能にする神経堤細胞である。実際に、一次嗅覚系であっても成体動物における新しいニューロンを生じるその能力によって特徴付けられる。この特定の機能は、部分的に神経発生に有利な微小環境を作成したOECの存在によるものである。たOECのこの特性は、例えば、脊髄損傷モデルにおいて、細胞移植のために使用されている。末梢神経系は、中枢神経系よりも神経損傷後に再生するためのより大きな容量を持っていますが、完全なセクションでは、喉頭神経切断の顔の後に、特に軸索再生の際に悪意のある経路変更を誘導する。具体的には、反回神経（RLN）の完全な切片は、声帯の共同運動、その結果、異常な軸索再生を誘導する。この特定のモデルでは、移植たOECを効率的に軸索の再成長を増加させることを示した。 ve_content &quot;&gt;たOECは、嗅粘膜（OM-たOEC）と嗅球（OB-たOEC）の両方に存在するいくつかの亜集団で構成されている。私たちはここでのたOECのこれらの異なる部分集団の使用に基づいて細胞移植のモデルを提示RLN傷害モデル。このパラダイムを用いて、OB-たOECとOM-たOECの初代培養は、RLNのセクションと吻合後にマトリゲルに移植した。二ヶ月手術後、我々はvideolaryngoscopyに基づいて補完的な分析によって移植動物を評価した、筋電図（EMG） 、および組織学的研究はまず、videolaryngoscopyは、特定の筋肉cocontractions現象で、私たちは喉頭の機能を評価することができました。続いて、筋電図が実証豊かさと筋肉の活動の同期化を分析しています。最後に、トルイジンブルー染色に基づいた組織学的研究は、数とプロファイルの定量化を可能にした有髄線維の。 すべて一緒に、我々は、IDE、文化を分離する方法をここで説明するntifyとRLNセクション·吻合する方法と、軸索の再成長と喉頭の機能でこれらの移植細胞の効率を評価し、分析するの後、OMやOBから移植たOEC。

コントロールとreinnervated（セクション/吻合）とイラスト動物が結果として選択されています（OM、OBやOM + OB）が行わ携帯移植によって異なる場合があります。 細胞培養 細胞がプラスチック表面に迅速に付着し、又は細長い先細り、三角形、多極、又は紡錘状である細胞の平行な帯状に分離なった（ 図1Aおよび1B）。サイトメトリー分?...

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Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

嗅神経鞘細胞（たOEC）が、一次嗅覚ニューロンの成長を可能にする神経堤細胞である。この特定のプロパティは、細胞移植のために使用することができる。ここでは喉頭神経損傷モデルでたOECの使用に基づいて細胞移植のモデルを提示。

末梢神経損傷後の機能回復を評価する嗅神経鞘細胞の移植

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

transplantation-olfactory-ensheathing-cells-to-evaluate-functional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K ビュー.  University of Rouen. 嗅神経鞘細胞（たOEC）が、一次嗅覚ニューロンの成長を可能にする神経堤細胞である。この特定のプロパティは、細胞移植のために使用することができる。ここでは喉頭神経損傷モデルでたOECの使用に基づいて細胞移植のモデルを提示。 

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An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

網膜神経節細胞の生存を研究するために視神経挫滅モデルマウス

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

神経科学

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em&gt;インビトロ</em末梢神経再生を研究するために&gt;共培養モデル

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

生きているアフリカツメガエルのオタマジャクシ嗅覚経路の機能評価

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

ラットの急性脳卒中後の脳回復を評価する前臨床モデル

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

坐骨神経クラッシュ損傷のラットモデルにおける機能的評価のための3D運動学的解析

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

体外における感覚神経と運動神経からの線維芽細胞およびシュワン細胞の精製

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

末梢神経または脊髄損傷を伴うげっ歯類の機能回復を評価する自動歩行分析

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Motor Dual-Tasks for Gait Analysis and Evaluation in Post-Stroke Patients

Eighteen stroke patients were recruited for this study involving the evaluation of cognition and walking ability and multitask gait analysis. Multitask gait analysis consisted of a single walking task (Task 0), a simple motor dual-task (water-holding, Task 1), and a complex motor dual-task (crossing obstacles, Task 2). The task of crossing obstacles was considered to be equivalent to the combination of a simple walking task and a complex motor task as it involved more nervous system, skeletal movement, and cognitive resources. To eliminate heterogeneity in the results of the gait analysis of the stroke patients, the dual-task gait cost values were calculated for various kinematic parameters. The major differences were observed in the proximal joint angles, especially in the angles of the trunk, pelvis, and hip joints, which were significantly larger in the dual motor tasks than in the single walking task. This research protocol aims to provide a basis for the clinical diagnosis of gait function and an in-depth study of motor control in stroke patients with motor control deficits through the analyses of dual-motor walking tasks.

This paper presents a protocol specifically for dual motor task gait analysis in stroke patients with motor control deficits.

脳卒中後の患者の歩行分析と評価のための運動デュアルタスク

Eighteen stroke patients were recruited for this study involving the evaluation of cognition and walking ability and multitask gait analysis. Multitask ...