この研究の一部は国立衛生研究所、助成金R01 EB007594、防衛乳がん研究プログラム、提案BCO74699P7、とスーザンG.コーメン財団の助成金98188972分の26152の部門によって資金を供給された。

1。 Microendoscopeアセンブリここで説明する高解像度microendoscope（図1a）は、アセンブリとアプリケーションで可能ないくつかのバリエーションがある基本構成として考慮されるべきである。ここでは詳細に蛍光造影剤としてのプロフラビンで使用するように設計されているプラ​​ットフォームの実施例を説明します。プロフラビンは、それぞれ445 nmと515 nmのピーク吸収および発光波長で染色明るい核があります。他の造影剤の使用は、ユーザーが適切に励起、発光、およびダイクロイックフィルタを選択することが必要になります。高解像度microendoscopeのいくつかの要素は汎用性があり、複数のベンダから入手することができます。例えば、オプトメカニカルコンポーネントの配置は、とりわけThorlabs、ニューポート、リノスから入手できます。コンパクトCCDカメラは、ポイントグレーリサーチ、Prosilicaは、とRetigaなどのメーカから提供され、カメラの感度は、使用する蛍光体の明るさだけでなく、目的のフレームレートを考慮して選ばれるべきです。ハイパワー発光ダイオード（LED）はとりわけのLuxeon、Cree社、日亜から得ることができる。光ファイバーバンドルは、住友、フジクラ、およびショットから入手可能です。特定のアプリケーション用のコンポーネントを選択するには、ユーザーは、照度、カメラの感度、ゲイン、および露光時間を退色、蛍光体の濃度との間の蛍光顕微鏡に関わる固有の関係を考慮する必要があります。 <ol><li> 7.5のペアを形成するために、ケージの棒&quot;を1.5にケージの棒&quot;6接続&quot;長い棒を。折り返しミラーユニットの一方の面にこれらのロッドをネジ0.5ねじ&quot;反対側の面に棒を。スルーホール下の2つを経由して、ケージの棒の上にケージのキューブをスライドさせます。ケージの立方体（図1b）の側面に2&quot;棒をねじ込みます。 </li><li> SM1アダプタにC -マウントを使用してケージのプレートにカメラを取り付けます。 0.5&quot;ケージの棒のケージプレートを固定し、折り返しミラーユニットの前面と平らに揃います。 </li><li> 3&quot;長いレンズチューブに&quot;チューブ&quot;のレンズを挿入し、保持リングとレンズを固定します。投影時にレンズの焦点距離は光ファイババンドルのコアが少なくとも2つのピクセルでサンプリングされるように選択されるべきであるカメラの上に。フィルターメーカーによって示される。の側に鏡筒をネジ第一保持リングの上にチューブに発光フィルターを削除し、代わりにフィルタを確保するために別のリングを追加。フィルターの向きの規則を守ってくださいケージのキューブのCCDカメラに近い。図1cに、このレンズとフィルターは、わかりやすくするために3&quot;のレンズチューブなしで表示されていることに注意してください。 </li><li>カメラとパソコンを接続し、画面上の画像を表示します。遠くのオブジェクトでケージアセンブリを指揮し、被写体にピントが表示されるまでレールに沿ってケージのキューブをスライドさせます。この場所でのケージのキューブをロックダウンできます。 （これは無限遠補正対物レンズと組み合わせるとチューブレンズは、フォーカス画像を形成することを保証する簡単な方法です）。 </li><li>ケージのキューブで45 °のホルダーと所定の位置にダ​​イクロイックミラーを挿入します。 </li><li>チューブレンズホルダー反対ケージの立方体の面に、SM1スレッドアダプタにRMSおよび調整可能なレンズチューブを介して、対物レンズをねじ込みます。 Z -翻訳者が容易焦点のための調節可能なレンズチューブの代わりに使用することができる。ケージのプレートにSMAコネクタをネジ込み、対物レンズの作動距離で約、棒でこれをマウントします。 </li><li> 2の終わりにケージプレートとスライド上のLEDマウントする&quot;棒。0.5にレンズを追加&quot;この管はケージの立方体の側面にネジ止めされている場合、それはLEDの画像を形成するようなレンズチューブそれは、対物レンズの背面開口部を埋める。この（ケーラー照明）の構成は、光ファイバー束の近位面が均一に点灯していることを保証します。 0.5&quot;のレンズチューブに励起フィルターを追加し、保持リング（図1c）との場所に固定します。 </li><li>光ファイバー束にSMAコネクタを取り付けます。ケージの棒に取り付けられたSMAレセプタクルにSMAコネクタ付きバンドルをねじ込みます。広帯域光源（蛍光灯で十分です）に向かってバンドルの先端を指示し、CCDカメラでバンドル近の顔の画像を観察。繊維束の画像がフォーカスされて表示されるまで、ケージのキューブからのネジ止めまたは外で対物レンズの位置を調整します。個々のコアは（図2）はっきりと見えるはずです。 </li></ol> 2。 GRINレンズアセンブリ microendoscopeの空間分解能は、繊維束の遠位先端にマイクロレンズまたはレンズアセンブリーを取り付けることによって増加することができます。これらの光学系は、代わりに直接組織へのバンドルの先端を置くことで、先端が、それによって光のGUIDによって課された空間サンプリング周波数を増加させる、縮小倍率で組織表面上に結像されるように構成されています繊維束のINGコア。縮小倍率の度合いは、空間分解能の増加、そして同時に、視野に比例して減少に対応しています。勾配インデックス（GRIN）レンズのコンポーネントは、光ファイバーと互換性があり、とりわけGrinTech、NSG、ショット、から入手可能である、と直接繊維束の遠位端に結合することができる。 <ol><li>あなたのアプリケーションのための所望の倍率と作動距離でGRINレンズを選択してください。レンズの直径は、で動作するように計画して繊維束のそれを超えていることを確認してください。我々は、繊維束とGRINレンズが前にボンディングに正確な位置合わせのための低消費電力の顕微鏡またはステレオスコープの下に独立した3軸手動位置決めステージにマウントすることをお勧めします。 </li><li>レンズまたはバンドルの顔のどちらかの光学接着剤（例えば、ノーランドのUV硬化接着剤）のドロップを置きます。手動のポジショナを使用して、連絡先に2つのコンポーネントをもたらす。メーカーが推奨用量のUV光へのインターフェイスを公開します。 </li><li> GRINレンズと束ねられたインタフェース、アルミキャピラリーチューブ（スモールパーツ（株））の短い長さを保護するためのジョイントを囲むために使用することができます。エポキシのある場所で共同して安全な上でチューブをスライドさせます。熱収縮チューブは、アセンブリを終了するために使用することができます。 </li></ol> 3。 Microendoscopeイメージング<ol><li>撮像される細胞または組織に造影剤を適用します。培養中の細胞の in vitroイメージングのプロフラビン（PBS中0.01％w / v）を、と短いインキュベーション（&lt;1分）で行われ、完全に洗い流すことができます。 生体外で組織標本のまたは生体組織のイメージングは、染料の可能な以下の局所適用になります。これらの条件の下でプロフラビンの取り込みは、数秒から数分間持続内で可能な撮影で、ほぼ瞬間的であることが判明している。 </li><li>イメージを作成するサンプルと軽い接触で光ファイバ束を配置。文化または ex vivoでの組織標本のときには、イメージング細胞、我々は、撮影時の安定性のためのXYZ軸の手動位置決めステージとのセキュリティで保護された治具に光ファイバ束の先端をマウントすることをお勧めします。 </li></ol> 4。代表的な結果： 正しく組み立てられると、microendoscopeは、コヒーレント光ファイバ束を介して中継された落射蛍光顕微鏡として動作します。最適な撮像結果を得るために、注意が3つの主要な条件が満たされていることを確実に注意を払う必要があります。 <ol><li>繊維束の近位面は、システムの完全な解決を達成するために、デフォーカスすることなくCCDカメラ上に結像されるべきである。図2a、b、cはそれぞれ、貧しい人々を中心としたイメージング繊維束の部分、わずかなデフォーカス、および良好なフォーカスを示しています。最適なフォーカスがバンドル面に対して相対的に対物レンズの軸方向位置を調整することによって発見されています。 </li><li>繊維束の近位面は一様にその完全な直径（視野）を介して点灯します。プロトコルのテキスト（1.7）で説明されているように、これは、ケーラー照明用の照明光学系を構成することによって達成されます。図2dは、均一な蛍光試料が重要な照明の下で対応する結果を示す図2Eに、この好ましい構成で点灯しているときに取得された画像を示しています。後者のケースでは、LEDの構造は、真の試料の構造に重畳この不要なパターンの出現で、その結果、繊維束の面上に結像される。 </li><li>繊維束の近位および遠位面の両方は、汚れや傷やチップの自由でなければなりません。図2fは、繊維の周囲の5時の位置に小さなチップの形でダメージを、バンドルの顔に接続された破片の存在を示しています。破片は、レンズの紙及びイソプロパノール、または標準の光ファイバのクリーニングツールを使用して、従来の光ファイバコネクタと同じ方法でクリーニングして直面しているバンドルから削除することができます。繊維束の両端は、傷や欠け、またはバンドルがその長さに沿って分解する場合、顔は標準的な手動、または機械的な研磨技術により、平坦な研磨することができますされている場合。我々は、0.5〜1.0μmの紙の上に最後の仕上げで、初期の粗い研磨紙をラッピング12月15日程度をお勧めします。 </li></ol>図3aは、プロフラビンとサンプルの塗装されていない繊維束の光の配置とラベリングに続く、in vitroで 1483細胞のイメージングを示しています。図3bは、空間分解能およびバンドルの先端に結合された2.5倍のGRINレンズが提供する視野の減少の改善を示しています。ムービー1は、マウスモデルにおける乳腺脂肪体のin vivoイメージングで示しています。ここでは0.5 mm外径（330μmの視野）と繊維束は、21ゲージの針を通し、組織に進出した。脂肪細胞は15で、今回の買収で明らかな心周期に起因する動きで、はっきりと見える秒あたりのフレーム数。図3cは、健康なヒトボランティアにおける口腔粘膜、1.5ミリメートル外径（1.4 mmの視野）を持つ大規模繊維束を使用して、この時の画像を示しています。に示すすべての例では、プロフラビン、核ラベリング蛍光造影剤として使用されました。 <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="図1" /> 図1高分解能microendoscope（HRMEを）組み立てる。 HRMEシステムの（a）の模式図。主なオプトメカニカル支持構造の（b）のアセンブリ。 （c）光学要素の追加、照明のLED、およびCCDカメラ。 10&quot;× 8&quot;× 2.5&quot;筐体にパッケージさHRMEシステムの（d）の写真、。 <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。HRMEを設定する。 （a）の貧しい焦点に光ファイバ束とイメージングの例としては、（b）の良好なフォーカスに近い、（C）理想的な焦点。 （d）に、バンドルの遠位先端の均一な蛍光ターゲットはケーラー（均一な）照明下で撮像される。 （e）の均一な蛍光ターゲットでは、オブジェクト上の明らかなソース構造で、重要な照明の下で撮像。 （F）ルース組織や細胞はまた、その周辺部に軽微な損傷を受けやすい繊維束の顔、に固執することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。HRMEとイメージング。 （）裸の繊維束（IGN-08/30）プロフラビン0.01％（w / v）の持つ以下のラベリングとイメージングをin vitroで 1483細胞、。 （b）に示すように、同じ1483細胞培養は、（a）、2.5倍のGRINレンズを付けた状態で、繊維束で撮像。プロフラビン0.01％（w / v）の局所適用は、次のin vivoでのヒトの正常口腔粘膜の（c）画像、。 ムービー1。イメージング組織に渡される21ゲージ針の内腔内に450μmの外径の繊維束の挿入を介してマウスの乳腺脂肪パッド。プロフラビン0.01％（w / v）をイメージングの前の繊維の挿入に同じ針を介して画像サイトに配信されました。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1 2306_Pierce_movie1.avi">ビデオを見るにはここをクリック</a>

<ol>
	<li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer.">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy.">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li><li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+in+Barrett's+esophagus:+a+novel,+low-cost+endoscopic+microscope.">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li><li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett's+esophagus.">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li><li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring.">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li><li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope.">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li><li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., L&#233;v&#234;que, J. -. L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle.">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li><li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li><li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses.">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li><li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope.">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li><li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+cost,+high+performance,+self-aligning+miniature+optical+systems.">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li></ol>

MPとDYは、開示することは何もない。 RRKはmicroendoscopicイメージングプラットフォームに関連する特許を取得しています。

ここで説明する高解像度microendoscopy技術は、 その場で携帯電話の詳細を可視化するための、柔軟で堅牢、そして費用対効果の高い方法で基本的な生物医学および臨床研究の分野で研究者を提供します。我々は、イメージングシステムを組み立てるためのプロトコルを記述し、そのin vitroでの細胞培養に、動物での使用、およびin vivoでのヒト組織を示している。ここで紹介するイメージング結果は蛍光造影剤としてのプロフラビンを使用しながら、他のグループ5-7他の色素の励起/発光スペクトルと一致するように選択されたLED照明の波長とフィルタを使用してシステムのバージョンを示している。 解像度と視野が最初にコア間の間隔と光ファイバ束の結像直径によって決定されます。我々は約4μmのコア - コアの間隔、および330μmの（動画1）、720μmの（図2、図3A、B）、および1400ミクロン（図3c）の像の直径とのバンドルを使用している。小さい束は狭いゲージの針に通し、大きな繊維よりもはるかに柔軟性がありますすることができます。我々と他の8は 、いくつかのケースでは、繊維束自体からの自家蛍光の排出量の外観を指摘している。 UV波長で蛍光体を励起する、または赤色のスペクトル範囲内の放射を収集しようとすると、注意が全体的な測定信号に寄与する繊維束の自家蛍光のレベルを払う必要があります。 高解像度microendoscopyの作業のほとんどは、最新の裸の繊維束を使用していると報告しながら、追加の倍率は、遠位端に結合されたGRINレンズの使用により提供することができます。 GRINレンズは、光学収差と限られたNAへの感受性がよく認識されているものの、空間分解能を向上させる簡単かつ経済的な方法を提供します。 GRINレンズの性能は、特定のアプリケーションには不十分である場合は、ハイブリッドGRIN /球面レンズの目標を9またはミニチュア対物レンズアセンブリ10から11を用いることができる。 高解像度のmicroendoscopeは本質的に広視野落射蛍光顕微鏡として動作ここで説明するので、光学セクショニングは、（共焦点または非線形顕微鏡のように）予想されるためです。我々の経験では、造影剤として455 nmの励起光と局所プロフラビンを用いて、光は主に少数の細胞層に相当する深さから収集されます。 このプロトコルは、読者が10のコンパクトなフットプリント&quot;× 8&quot;で、ベンチトップでの高解像度microendoscopeを組み立てるために有効にするはず。必要に応じて、システムは、ボックスとバッテリーパック（図1d）を搭載した電気部品（LEDとカメラ）で囲むことができます。多くのコンパクトカメラは、ホストコンピュータのIEEE - 1394（FireWire）とUSBポートから給電することができます。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Point Grey Research</td>
<td>GRAS-14S5M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>M455L2</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Excitation filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>452/45</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Emission filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>550/88</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>485 DCLP</td>
<td>Selected for use with proflavine &#x2013; other fluorophores may require different parts</td>
</tr>
<tr>
<td>Objective lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs (Olympus)</td>
<td>RMS 10X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tube lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>AC-254-150-A1</td>
<td>Select focal length to achieve required magnification to CCD</td>
</tr>
<tr>
<td>Condenser lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ACL2520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage cube unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cage rods and plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fold mirror unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>KCB1, PF10-03-G01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lens tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adapters / couplers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMA connectors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>SM1SMA, 11040A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LED driver</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thorlabs</td>
<td>LEDD1B TPS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fiber optic bundle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sumitomo</td>
<td>IGN-08/30</td>
<td>Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

high-resolution fiber-optic microendoscopy for in situ cellular imaging

多くの生物学的および臨床研究は、細胞レベルの分解能を持つ形態と機能の縦断的研究と分析が必要です。伝統的に、複数の実験は、光学顕微鏡による評価のためのシーケンシャル時点での研究から削除される個々のサンプルで、並列に実行されます。いくつかの生体内の技術が共焦点、多光子、および第二高調波顕微鏡はすべてその場 1 のイメージングに使用する能力を実証するとともに、開発されている。これらのシステムでは、しかし、必要なインフラは、走査型レーザーシステムや複雑な光源を含む、複雑で高価です。ここでは、5,000米ドルの下でのための既製のコンポーネントを使用して一日で構築することができる高解像度のmicroendoscopeの設計と組み立てのためのプロトコルを提示する。プラットフォームは、画像解像度、視野、および動作波長の面で柔軟性を提供し、我々はこれらのパラメータを簡単にエンドユーザーの特定のニーズに合わせて変更することができる方法について説明します。 我々と他の人は、in vitro細胞培養2-5、6を切除して生きている動物組織2,5において、 および in vivo 2,7 のヒト組織での高解像度microendoscope（HRME）の使用を検討されている。ユーザーは、プロフラビン2-4、ベンゾポルフィリン誘導体一酸リング（BPD - MA）5、およびFDAから完全な、または治験承認を受けたすべてがフルオレセイン6,7、を含むいくつかの異なる蛍光造影剤の使用を、報告しているヒト被験者での使用のため。高解像度microendoscopyは、ここで説明する形で、基礎および臨床科学で働く研究者の広い範囲に上訴することがあります。テクニックは、ユーザがその場で高解像度、縦方向のイメージングを実行できるようにすることで、従来のベンチトップ型顕微鏡を補完する効果的かつ経済的なアプローチを提供しています。

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging at JoVE.com

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

彼らはネイティブの微小環境での進化として、多くの生物学的および臨床的状況では、細胞プロセスを研究するのが有利である。ここでは、細胞培養、動物実験、および患者の臨床試験ではリアルタイムイメージングを提供できる低コストの光ファイバ顕微鏡の組み立てと使用方法を説明します。

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

high-resolution-fiber-optic-microendoscopy-for-situ-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

34.4K ビュー.  Rice University. 彼らはネイティブの微小環境での進化として、多くの生物学的および臨床的状況では、細胞プロセスを研究するのが有利である。ここでは、細胞培養、動物実験、および患者の臨床試験ではリアルタイムイメージングを提供できる低コストの光ファイバ顕微鏡の組み立てと使用方法を説明します。

ビデオ: High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

生物工学

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The microfluidic chip exploits the size difference between mother and daughter cells using an array of micropads. Upon loading, cells are trapped underneath these micropads, because the distance between the micropad and cover glass is similar to the diameter of a yeast cell (3-4 &mu;m). After the loading procedure, culture medium is continuously flushed through the chip, which not only creates a constant and defined environment throughout the entire experiment, but also flushes out the emerging daughter cells, which are not retained underneath the pads due to their smaller size. The setup retains mother cells so efficiently that in a single experiment up to 50 individual cells can be monitored in a fully automated manner for 5 days or, if necessary, longer. In addition, the excellent optical properties of the chip allow high-resolution imaging of cells during the entire aging process.

We describe here the operation of a microfluidic device that allows continuous and high-resolution microscopic imaging of single budding yeast cells during their complete replicative and/or chronological lifespan.

出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

マルチモーダルイメージングおよび非侵襲のための分光繊維束Microendoscopyプラットフォーム、<em&gt;インビボ</em&gt;組織分析

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

適切なポジショニングと骨のマイクロ アーキテクチャを使用して体内のマイクロ-コンピューター断層撮影の焦点の高分解能イメージングのためのラットの後肢の拘束

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

最適化されたセットアップおよびヒステリシス測定場の磁区イメージングのためのプロトコル

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

要約

さらに動画を探す

この動画の章

の高分解能3次元イメージング生体外生物試料

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

マルチモーダルイメージングおよび非侵襲のための分光繊維束Microendoscopyプラットフォーム、

適切なポジショニングと骨のマイクロアーキテクチャを使用して体内のマイクロ-コンピューター断層撮影の焦点の高分解能イメージングのためのラットの後肢の拘束

最適化されたセットアップおよびヒステリシス測定場の磁区イメージングのためのプロトコル

ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 D イメージング

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

要約

さらに動画を探す

この動画の章

の高分解能3次元イメージング生体外生物試料

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

マルチモーダルイメージングおよび非侵襲のための分光繊維束Microendoscopyプラットフォーム、

適切なポジショニングと骨のマイクロ アーキテクチャを使用して体内のマイクロ-コンピューター断層撮影の焦点の高分解能イメージングのためのラットの後肢の拘束

最適化されたセットアップおよびヒステリシス測定場の磁区イメージングのためのプロトコル

ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 D イメージング

適切なポジショニングと骨のマイクロアーキテクチャを使用して体内のマイクロ-コンピューター断層撮影の焦点の高分解能イメージングのためのラットの後肢の拘束