Name: ビデオ: Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00
Duration: 14 min 10 s

著者らは、このプロジェクトを支援するためThorLabsに感謝します。 AJNはNSF大学院奨学金の支援を承認することを希望。 この研究の一部はNIHのディレクターの新イノベーター賞プログラムを通じて国立衛生研究所、OD007096 - 01 DP2助成金番号1によって賄われていた。新イノベーター賞プログラムに関する情報がでています<a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> 。著者はハーバードエレクトロニクス研究室の使用のためにトムヘイズに感謝します。

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	<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 985-985 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li><li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics.">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li><li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging.">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li><li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration.">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li><li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation.">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li><li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+(Cell-viZio)+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation.">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li><li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+confocal+laser+endomicroscopy.">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li><li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy.">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li><li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li></ol>

このビデオこのビデオの制作はThorlabs、Inc。によって後援されて

このビデオレートでの撮像システムは、約8 kHzで動作する共振ガルバノミラーを利用しています。フルパワーで実行すると共振ミラーは非常に大きいです、そしてその高いピッチは十分な露光時間で厄介な、あるいは危険なことができます。ここに示されていないが、それが大幅にシステムボリュームおよび/またはそのような耳栓のような適切な聴力保護具を着用することを減らすために透明なケース内の共振ガルバノミラーを保護することをお勧めします。 共振ガルバノミラーは、正弦波パターンでスキャンします。しかし、フレームグラバカードは、両方の水平および垂直方向に完全にリニア掃引速度を仮定して信号を読み込む。正弦波スイープは、スキャンの端で速度が低下するので、画像圧縮アーチファクトは、高速（水平）画像の軸に沿って観察することができます。この問題を最小限にする一つの方法は、意図的に共振ガルバノミラーの走査範囲を駆動するよりもはるかに大きいです。リレーレンズの直径。こうすることで、正弦波走査パターンののみ、ほぼ直線の中央スイープは、画像の歪みを最小限に抑え、サンプルを通過します。もう一つのアプローチは、高速軸を線形化するポストプロセス、収集画像になります。これは、イメージングで公知の蛍光パターンを（gridなど）で実現し、収集した画像をunwarps処理のスクリプトを作成するには、既知のパターンの寸法を使用することができます。 この特定のスキャンシステムは、多くの場合、直立型ビデオレートでの顕微鏡を必要とするin vivoイメージング、 内の目的のために設計されました。細胞イメージング実験のために、倒立顕微鏡は、より一般的に使用されています。ここで紹介する設計は、簡単にそのような倒立顕微鏡を構築するために変更することができます。必要なことは、最後の2&quot;直径のミラーの回転です。代わりに下に走査ビームを指示するために鏡を向けると、ミラーが上にビームを指示することができます。対物レンズの配置トン試料ステージと一緒にミラーから同じ距離には、反転幾何学でのイメージングが可能になります。イメージングシステムはmicroendoscopicイメージングのためだけに構築されている場合は、すべてで垂直に顕微鏡のデザインを&quot;折り&quot;する理由はありません。代わりに、全体のスキャンシステムは、光学テーブルに対物レンズ平行に配向を持つ単一の水平のブレッドボード上に構築することができます。 これはほとんどの市販の共焦点顕微鏡で見ることができるように、より汎用性の高いシステムを希望するユーザーは、変数ピンホールを組み込んだ検討するかもしれない、最大のビルドのシンプルさと位置合わせを容易にするために提供しながら、このビルドの顕微鏡は、固定ピンホールの設定を使用していることに注意してください。ユーザーは、発光強度を変化させるサンプルを補うためにピンホールの大きさを調整できるようにすることで、これは、ユーザーがより良い特定のサンプルのシグナルの強さと解像度の間のトレードオフを最適化することができます。 CH顕微鏡用に選択したイメージファイバのOICEは重要です。我々は彼らの近くにファイバのコアの間隔と低相対自己蛍光に起因する住友のコヒーレント画像の繊維を使用することをお勧めします。フジクラ製の画像繊維は、サンプルからの微弱な蛍光シグナルを圧倒し、microendoscopeの究極の感度を制限することができます自家蛍光10の高い量を、有することが見出された。そのようなこの特定のセットアップで使用される8 - 30Nとして住友製造された繊維は、、彼らのフジクラ同等物よりもはるかに低い自家蛍光レベルがあります。 leeched繊維束がmicroendoscopyにとって魅力的と見なされるかもしれないが、彼らのデザインは、通常、ファイバコアのまばらなサンプルオブジェクトは、潜在的な関心の重要な地域を残していることを意味し、離れすぎて個々のファイバーのコアを配置します。 最後に、それは顕微鏡がここで説明しながら、in vitroおよび in vivoアプリケーションシート内の様々な有用になることに注意してくださいアドオンとは、フル機能の商用システムの数分の一のコストのために作成することができます、それはそのような透過光を検出、表示するための接眼レンズ、または非共焦点広視野落射蛍光用ビームのパスなどの機能を持っていません。それは最初からこれらの機能を持つシステムを構築することは可能ですが、そのようなシステムを希望する読者は彼らのニーズを満たすのではなく、完全に新しいビルドを開始するために、既存の商用システムを変更したいこともあるかもしれません。

<table border="1"><tbody><tr><td> パーツ名 </td><td> メーカー </td><td> アイテム番号 </td><td> 仕様 </td><td> 数量 </td></tr><tr><td> 515 nmのバンドパスフィルタ</td><td>彩度</td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td>色消しレンズ25.4ミリメートル径。 x 50mmのFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT49 - 766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>色消しレンズ25.4ミリメートル径。 X 76.2ミリメートルFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT49 - 768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>色消しレンズ25.4ミリメートル径。 X 88.9ミリメートルFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT49 - 769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td>色消しレンズ50ミリメートル径。 X 300ミリメートルFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT45 - 179 </tD&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8kHzのR高周波光スキャナ</td><td>電気光学製品株式会社（EOPC） </td><td> SC - 30 </td><td> 8 kHzの</td><td> 1 </td></tr><tr><td> AGCドライバ</td><td>電気光学製品株式会社（EOPC） </td><td> ACG：8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422 - PA光センサモジュール</td><td>浜松市</td><td> H7422 - PA </td><td>現在の推奨制限</td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012の電源</td><td>浜松市</td><td> M9012 </td><td> H7422 - PAを使用するための</td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS目的</td><td>ライカ</td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios EA / XA画像取込装置のカード</td><td> Matroxの</td><td> Solios EA / XA </td><td> MILソフトウェアが必要です。OEMは、推奨される相互接続</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 12V電源</td><tD&gt; Meanwell </td><td> LPV - 100から12 </td><td> +12 V、8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5倍の顕微鏡対物レンズ</td><td>ニューポート</td><td> M - 5X </td><td> 0.10 NA、25.4ミリメートル焦点距離</td><td> 1 </td></tr><tr><td>コヒーレントイメージファイバ</td><td>住友</td><td> 8 - 30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4&quot;-20のキャップスクリューとハードウェアキット</td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100μmのピンホールを装着</td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td>空間フィルタを構築するための理想的な</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30mmのケージキューブクランプ</td><td> ThorLabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30mmのケージSystemキューブ、4ウェイ</td><td> ThorLabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nmの、5mWで、Bピンコード、SMファイバピグテールレーザーダイオード、FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> LPS - 406 - FC </td><td>廃止された製品、LP405 - SF10に置き換え</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5分間エポキシ、263 </td><td> ThorLabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6軸キネマティック光学マウント</td><td> ThorLabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8〜32キャップスクリューとハードウェアキット</td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8〜32セットスクリュータイプとハードウェアキット</td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>外部RMSスレッドと内部SM1スレッド付きアダプタ</td><td> ThorLabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> ADJ。 FC / PCとFC / APCコリメータ、F = 2.0 mmのARC：400〜600 nmの</td><td> ThorLabs </td><td> CFC - 2X - </td><td> F = 2.0ミリメートル</td><td> 1 </td></tr><tr><td>調節可能なファイバコリメータアダプタ、ネジ​​切りSM1 </td><td> ThorLabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>アルミブレッドボード、12&quot;× 18&quot;× 1 / 2&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4&quot;-20ネジ</td><td> 2 </td></tr><tr><td>卓上型レーザーダイオード/ TECコントローラ</td><td> ThorLabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425nmのロングパスダイクロイックミラー</td><td> ThorLabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O1&quot;光学のためのキネマティックマウント</td><td> ThorLabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> ThorLabsファイバピグテールレーザーダイオード用のLD / TECマウント</td><td> ThorLabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O18 mmの光学用レンズマウント</td><td> ThorLabs </td><td> LMR18 </td><td>含まれているもの、保持リング</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2&quot;光学用レンズのマウント</td><td> ThorLabs </td><td> LMR2S </td><td>固定リング含まれ、内部および外部のスレッドがで</td><td> 2 </td></tr><tr><td>ミニシリーズケージアセンブリロッド、6&quot;ロング、O4ミリメートル、数量1 </td><td> ThorLabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0&quot;ペデスタルピラーポスト、8から32タップ、1&quot;ロング</td><td> ThorLabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1&quot;ピラーポストエクステンション、長さ= 0.5 </td><td> ThorLabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1&quot;ピラーポストエクステンション、長さ= 0.75&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1&quot;保護されたシルバーミラー、厚3.2ミリメートル</td><td> ThorLabs </td><td> ME1 - P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O1&quot;SM1の回転調節可能なフォーカシングエレメント、L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1V10 </tD&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O2&quot;保護されたシルバーミラー、厚3.2ミリメートル</td><td> ThorLabs </td><td> ME2 - P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - ø100μmのピンホールを装着</td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>ポラリス低ドリフトO1&quot;キネマティックミラーマウント</td><td> ThorLabs </td><td> POLARIS - K1 </td><td>低ドリフト</td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1レンズチューブ、L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1L - 10 </td><td>含まれているもの、保持リング</td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1ネジ30mmのケージプレート、0.35&quot;厚</td><td> ThorLabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1のM25光コンポーネントスレッディングアダプター</td><td> ThorLabs </td><td> SM1A24 </td><td>外部SM1スレッドと内部M25.5x0.5スレッド</td><td> 1 </td></tr><tr><td>小さなビーム直径eterガルボシステム</td><td> ThorLabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>小さなクランプフォーク</td><td> ThorLabs </td><td> CF125 </td><td> 1月25日は&quot;スロット、普遍的にザグリ</td><td> 15 </td></tr><tr><td>空間フィルタシステム</td><td> ThorLabs </td><td> KT310 </td><td>ピンホールは別売り</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5.6＆9 mmのレーザー用TE -冷却マウント</td><td> ThorLabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>ブレッドボード用の垂直ブラケット</td><td> ThorLabs </td><td> VB01 </td><td>各</td><td> 2 </td></tr><tr><td>計画-アポクロマート</td><td>ツァイス</td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy

共焦点顕微鏡は、迅速、高感度、および複雑なシステムの高解像度の光学セクショニングを可能にする、生物学および生物医学科学の非常に貴重なツールとなっています。共焦点顕微鏡は、日常的に生細胞内2-4を特定の細胞標的1、モニターダイナミクスを研究し、全体の生物5,6の三次元進化を視覚化するために、例えば、使用されています。このような共焦点microendoscopesなどの共焦点イメージングシステムの拡張機能は、 生体内 7 の高分解能イメージングが可能で、現在臨床の設定8,9の疾患のイメージングと診断に適用されている。 共焦点顕微鏡は、単純な幾何光学を使用して、いわゆる&quot;光学セクション&quot;を作成することによって三次元分解能を提供します。標準的な広視野顕微鏡では、試料から発生する蛍光は、対物レンズによって収集され、検出器に直接中継。受け入れる一方、イメージング薄いサンプルのことが、厚い試料は客観的な焦点面の上下に発生する蛍光がぼやける。対照的に、共焦点顕微鏡は、試料の高分解能3次元表現を構築するためにアウトフォーカスの光を拒絶する、サンプルの仮想、光学セクショニングが可能になります。 共焦点顕微鏡は、検出のビーム経路に焦点アパーチャを使用してこの偉業を達成。客観的で、サンプルから収集された蛍光は、スキャニングミラーを介して、プライマリダイクロイックミラー、慎重に長く、ストークスシフト蛍光放出を渡しながら、このようなレーザの励起光として短い波長を反映するように選択したミラーを介して中継される。この長波長の蛍光信号は、対物レンズの焦点面と正確に共役平面に配置されているピンホールの両側にレンズのペアに渡されます。オブジェクトの焦点ボリュームから収集された光子は、コリメートされています対物レンズにより、ピンホールを介して共焦点レンズにより集光されています。焦点面の上または下に生成された蛍光は、したがって、適切にコリメートされず、顕微鏡の焦点からの光だけが見えるような光学部を作成し、共焦点ピンホール1を通過しません。 （ 図1）。したがって、ピンホールが効果的に唯一の限られた空間的な位置に検出された放射を閉じ込め、焦点面内の仮想アパーチャとして機能します。 近代的な商業共焦点顕微鏡では比較的簡単とアクセス可能な以前は複雑な画像処理手順を作成する、ユーザーは完全に自動化された操作を提供します。これらのシステムの柔軟性とパワーにもかかわらず、商業的な共焦点顕微鏡は、このようなin vivoイメージングの用途で多くのようにすべての共焦点イメージングタスクに適していません。彼らのニーズを満たすためにカスタマイズされたイメージングシステムを作成する機能がなければ、重要な実験がリアクタンスから残ることができる多くの科学者へのH。 この記事では、我々は基本的なコンポーネントからカスタム、ビデオレート共焦点イメージングシステムの完全な構築のためのステップバイステップの方法を提供します。正立顕微鏡は、標準速度共振ガルバノミラーは、遅軸をスキャンしながら、高速走査軸を提供するために、共振ガルバノミラーを用いて構築されます。対物レンズのフォーカスの正確なスキャンビームを作成するには、これらのミラーは、4つのリレーレンズを使用して、いわゆるテレセントリック平面に配置されます。共焦点検出は標準的な、既製の光電子増倍管（PMT）を使用して実行され、画像がキャプチャされ、Matroxの画像取込装置のカードと付属のソフトウェアを使用して表示されます。

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

カスタム、リアルタイムの走査型共焦点イメージングシステムの完全な構造が記載されている。容易にビデオレートの顕微鏡とmicroendoscopyに使用することができるこのシステムは、コストのほんの一部で、標準的な商用共焦点システムを使用してアクセスできませんイメージングジオメトリとアプリケーションの配列が可能になります。

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

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27.6K ビュー.  Harvard University. カスタム、リアルタイムの走査型共焦点イメージングシステムの完全な構造が記載されている。容易にビデオレートの顕微鏡とmicroendoscopyに使用することができるこのシステムは、コストのほんの一部で、標準的な商用共焦点システムを使用してアクセスできませんイメージングジオメトリとアプリケーションの配列が可能になります。