Name: ビデオ: Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00
Duration: 14 min 10 s

著者らは、このプロジェクトを支援するためThorLabsに感謝します。 AJNはNSF大学院奨学金の支援を承認することを希望。 この研究の一部はNIHのディレクターの新イノベーター賞プログラムを通じて国立衛生研究所、OD007096 - 01 DP2助成金番号1によって賄われていた。新イノベーター賞プログラムに関する情報がでています<a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> 。著者はハーバードエレクトロニクス研究室の使用のためにトムヘイズに感謝します。

<ol>
	<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 985-985 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li><li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics.">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li><li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging.">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li><li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration.">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li><li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation.">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li><li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+(Cell-viZio)+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation.">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li><li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+confocal+laser+endomicroscopy.">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li><li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+endomicroscopy.">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li><li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles.">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li></ol>

このビデオこのビデオの制作はThorlabs、Inc。によって後援されて

このビデオレートでの撮像システムは、約8 kHzで動作する共振ガルバノミラーを利用しています。フルパワーで実行すると共振ミラーは非常に大きいです、そしてその高いピッチは十分な露光時間で厄介な、あるいは危険なことができます。ここに示されていないが、それが大幅にシステムボリュームおよび/またはそのような耳栓のような適切な聴力保護具を着用することを減らすために透明なケース内の共振ガルバノミラーを保護することをお勧めします。 共振ガルバノミラーは、正弦波パターンでスキャンします。しかし、フレームグラバカードは、両方の水平および垂直方向に完全にリニア掃引速度を仮定して信号を読み込む。正弦波スイープは、スキャンの端で速度が低下するので、画像圧縮アーチファクトは、高速（水平）画像の軸に沿って観察することができます。この問題を最小限にする一つの方法は、意図的に共振ガルバノミラーの走査範囲を駆動するよりもはるかに大きいです。リレーレンズの直径。こうすることで、正弦波走査パターンののみ、ほぼ直線の中央スイープは、画像の歪みを最小限に抑え、サンプルを通過します。もう一つのアプローチは、高速軸を線形化するポストプロセス、収集画像になります。これは、イメージングで公知の蛍光パターンを（gridなど）で実現し、収集した画像をunwarps処理のスクリプトを作成するには、既知のパターンの寸法を使用することができます。 この特定のスキャンシステムは、多くの場合、直立型ビデオレートでの顕微鏡を必要とするin vivoイメージング、 内の目的のために設計されました。細胞イメージング実験のために、倒立顕微鏡は、より一般的に使用されています。ここで紹介する設計は、簡単にそのような倒立顕微鏡を構築するために変更することができます。必要なことは、最後の2&quot;直径のミラーの回転です。代わりに下に走査ビームを指示するために鏡を向けると、ミラーが上にビームを指示することができます。対物レンズの配置トン試料ステージと一緒にミラーから同じ距離には、反転幾何学でのイメージングが可能になります。イメージングシステムはmicroendoscopicイメージングのためだけに構築されている場合は、すべてで垂直に顕微鏡のデザインを&quot;折り&quot;する理由はありません。代わりに、全体のスキャンシステムは、光学テーブルに対物レンズ平行に配向を持つ単一の水平のブレッドボード上に構築することができます。 これはほとんどの市販の共焦点顕微鏡で見ることができるように、より汎用性の高いシステムを希望するユーザーは、変数ピンホールを組み込んだ検討するかもしれない、最大のビルドのシンプルさと位置合わせを容易にするために提供しながら、このビルドの顕微鏡は、固定ピンホールの設定を使用していることに注意してください。ユーザーは、発光強度を変化させるサンプルを補うためにピンホールの大きさを調整できるようにすることで、これは、ユーザーがより良い特定のサンプルのシグナルの強さと解像度の間のトレードオフを最適化することができます。 CH顕微鏡用に選択したイメージファイバのOICEは重要です。我々は彼らの近くにファイバのコアの間隔と低相対自己蛍光に起因する住友のコヒーレント画像の繊維を使用することをお勧めします。フジクラ製の画像繊維は、サンプルからの微弱な蛍光シグナルを圧倒し、microendoscopeの究極の感度を制限することができます自家蛍光10の高い量を、有することが見出された。そのようなこの特定のセットアップで使用される8 - 30Nとして住友製造された繊維は、、彼らのフジクラ同等物よりもはるかに低い自家蛍光レベルがあります。 leeched繊維束がmicroendoscopyにとって魅力的と見なされるかもしれないが、彼らのデザインは、通常、ファイバコアのまばらなサンプルオブジェクトは、潜在的な関心の重要な地域を残していることを意味し、離れすぎて個々のファイバーのコアを配置します。 最後に、それは顕微鏡がここで説明しながら、in vitroおよび in vivoアプリケーションシート内の様々な有用になることに注意してくださいアドオンとは、フル機能の商用システムの数分の一のコストのために作成することができます、それはそのような透過光を検出、表示するための接眼レンズ、または非共焦点広視野落射蛍光用ビームのパスなどの機能を持っていません。それは最初からこれらの機能を持つシステムを構築することは可能ですが、そのようなシステムを希望する読者は彼らのニーズを満たすのではなく、完全に新しいビルドを開始するために、既存の商用システムを変更したいこともあるかもしれません。

<table border="1"><tbody><tr><td> パーツ名 </td><td> メーカー </td><td> アイテム番号 </td><td> 仕様 </td><td> 数量 </td></tr><tr><td> 515 nmのバンドパスフィルタ</td><td>彩度</td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td>色消しレンズ25.4ミリメートル径。 x 50mmのFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT49 - 766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>色消しレンズ25.4ミリメートル径。 X 76.2ミリメートルFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT49 - 768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>色消しレンズ25.4ミリメートル径。 X 88.9ミリメートルFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT49 - 769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td>色消しレンズ50ミリメートル径。 X 300ミリメートルFL、MgF2のコーティング</td><td>エドモンドオプティクス</td><td> NT45 - 179 </tD&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8kHzのR高周波光スキャナ</td><td>電気光学製品株式会社（EOPC） </td><td> SC - 30 </td><td> 8 kHzの</td><td> 1 </td></tr><tr><td> AGCドライバ</td><td>電気光学製品株式会社（EOPC） </td><td> ACG：8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422 - PA光センサモジュール</td><td>浜松市</td><td> H7422 - PA </td><td>現在の推奨制限</td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012の電源</td><td>浜松市</td><td> M9012 </td><td> H7422 - PAを使用するための</td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO CS目的</td><td>ライカ</td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios EA / XA画像取込装置のカード</td><td> Matroxの</td><td> Solios EA / XA </td><td> MILソフトウェアが必要です。OEMは、推奨される相互接続</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 12V電源</td><tD&gt; Meanwell </td><td> LPV - 100から12 </td><td> +12 V、8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5倍の顕微鏡対物レンズ</td><td>ニューポート</td><td> M - 5X </td><td> 0.10 NA、25.4ミリメートル焦点距離</td><td> 1 </td></tr><tr><td>コヒーレントイメージファイバ</td><td>住友</td><td> 8 - 30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4&quot;-20のキャップスクリューとハードウェアキット</td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100μmのピンホールを装着</td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td>空間フィルタを構築するための理想的な</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30mmのケージキューブクランプ</td><td> ThorLabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30mmのケージSystemキューブ、4ウェイ</td><td> ThorLabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nmの、5mWで、Bピンコード、SMファイバピグテールレーザーダイオード、FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> LPS - 406 - FC </td><td>廃止された製品、LP405 - SF10に置き換え</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5分間エポキシ、263 </td><td> ThorLabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6軸キネマティック光学マウント</td><td> ThorLabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8〜32キャップスクリューとハードウェアキット</td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8〜32セットスクリュータイプとハードウェアキット</td><td> ThorLabs </td><td> HW - KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>外部RMSスレッドと内部SM1スレッド付きアダプタ</td><td> ThorLabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> ADJ。 FC / PCとFC / APCコリメータ、F = 2.0 mmのARC：400〜600 nmの</td><td> ThorLabs </td><td> CFC - 2X - </td><td> F = 2.0ミリメートル</td><td> 1 </td></tr><tr><td>調節可能なファイバコリメータアダプタ、ネジ​​切りSM1 </td><td> ThorLabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>アルミブレッドボード、12&quot;× 18&quot;× 1 / 2&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4&quot;-20ネジ</td><td> 2 </td></tr><tr><td>卓上型レーザーダイオード/ TECコントローラ</td><td> ThorLabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425nmのロングパスダイクロイックミラー</td><td> ThorLabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O1&quot;光学のためのキネマティックマウント</td><td> ThorLabs </td><td> KM100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> ThorLabsファイバピグテールレーザーダイオード用のLD / TECマウント</td><td> ThorLabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O18 mmの光学用レンズマウント</td><td> ThorLabs </td><td> LMR18 </td><td>含まれているもの、保持リング</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2&quot;光学用レンズのマウント</td><td> ThorLabs </td><td> LMR2S </td><td>固定リング含まれ、内部および外部のスレッドがで</td><td> 2 </td></tr><tr><td>ミニシリーズケージアセンブリロッド、6&quot;ロング、O4ミリメートル、数量1 </td><td> ThorLabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0&quot;ペデスタルピラーポスト、8から32タップ、1&quot;ロング</td><td> ThorLabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1&quot;ピラーポストエクステンション、長さ= 0.5 </td><td> ThorLabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1&quot;ピラーポストエクステンション、長さ= 0.75&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> O1&quot;保護されたシルバーミラー、厚3.2ミリメートル</td><td> ThorLabs </td><td> ME1 - P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O1&quot;SM1の回転調節可能なフォーカシングエレメント、L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1V10 </tD&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> O2&quot;保護されたシルバーミラー、厚3.2ミリメートル</td><td> ThorLabs </td><td> ME2 - P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - ø100μmのピンホールを装着</td><td> ThorLabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>ポラリス低ドリフトO1&quot;キネマティックミラーマウント</td><td> ThorLabs </td><td> POLARIS - K1 </td><td>低ドリフト</td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1レンズチューブ、L = 1&quot; </td><td> ThorLabs </td><td> SM1L - 10 </td><td>含まれているもの、保持リング</td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1ネジ30mmのケージプレート、0.35&quot;厚</td><td> ThorLabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1のM25光コンポーネントスレッディングアダプター</td><td> ThorLabs </td><td> SM1A24 </td><td>外部SM1スレッドと内部M25.5x0.5スレッド</td><td> 1 </td></tr><tr><td>小さなビーム直径eterガルボシステム</td><td> ThorLabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>小さなクランプフォーク</td><td> ThorLabs </td><td> CF125 </td><td> 1月25日は&quot;スロット、普遍的にザグリ</td><td> 15 </td></tr><tr><td>空間フィルタシステム</td><td> ThorLabs </td><td> KT310 </td><td>ピンホールは別売り</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5.6＆9 mmのレーザー用TE -冷却マウント</td><td> ThorLabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td>ブレッドボード用の垂直ブラケット</td><td> ThorLabs </td><td> VB01 </td><td>各</td><td> 2 </td></tr><tr><td>計画-アポクロマート</td><td>ツァイス</td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-rate scanning confocal microscopy and microendoscopy

共焦点顕微鏡は、迅速、高感度、および複雑なシステムの高解像度の光学セクショニングを可能にする、生物学および生物医学科学の非常に貴重なツールとなっています。共焦点顕微鏡は、日常的に生細胞内2-4を特定の細胞標的1、モニターダイナミクスを研究し、全体の生物5,6の三次元進化を視覚化するために、例えば、使用されています。このような共焦点microendoscopesなどの共焦点イメージングシステムの拡張機能は、 生体内 7 の高分解能イメージングが可能で、現在臨床の設定8,9の疾患のイメージングと診断に適用されている。 共焦点顕微鏡は、単純な幾何光学を使用して、いわゆる&quot;光学セクション&quot;を作成することによって三次元分解能を提供します。標準的な広視野顕微鏡では、試料から発生する蛍光は、対物レンズによって収集され、検出器に直接中継。受け入れる一方、イメージング薄いサンプルのことが、厚い試料は客観的な焦点面の上下に発生する蛍光がぼやける。対照的に、共焦点顕微鏡は、試料の高分解能3次元表現を構築するためにアウトフォーカスの光を拒絶する、サンプルの仮想、光学セクショニングが可能になります。 共焦点顕微鏡は、検出のビーム経路に焦点アパーチャを使用してこの偉業を達成。客観的で、サンプルから収集された蛍光は、スキャニングミラーを介して、プライマリダイクロイックミラー、慎重に長く、ストークスシフト蛍光放出を渡しながら、このようなレーザの励起光として短い波長を反映するように選択したミラーを介して中継される。この長波長の蛍光信号は、対物レンズの焦点面と正確に共役平面に配置されているピンホールの両側にレンズのペアに渡されます。オブジェクトの焦点ボリュームから収集された光子は、コリメートされています対物レンズにより、ピンホールを介して共焦点レンズにより集光されています。焦点面の上または下に生成された蛍光は、したがって、適切にコリメートされず、顕微鏡の焦点からの光だけが見えるような光学部を作成し、共焦点ピンホール1を通過しません。 （ 図1）。したがって、ピンホールが効果的に唯一の限られた空間的な位置に検出された放射を閉じ込め、焦点面内の仮想アパーチャとして機能します。 近代的な商業共焦点顕微鏡では比較的簡単とアクセス可能な以前は複雑な画像処理手順を作成する、ユーザーは完全に自動化された操作を提供します。これらのシステムの柔軟性とパワーにもかかわらず、商業的な共焦点顕微鏡は、このようなin vivoイメージングの用途で多くのようにすべての共焦点イメージングタスクに適していません。彼らのニーズを満たすためにカスタマイズされたイメージングシステムを作成する機能がなければ、重要な実験がリアクタンスから残ることができる多くの科学者へのH。 この記事では、我々は基本的なコンポーネントからカスタム、ビデオレート共焦点イメージングシステムの完全な構築のためのステップバイステップの方法を提供します。正立顕微鏡は、標準速度共振ガルバノミラーは、遅軸をスキャンしながら、高速走査軸を提供するために、共振ガルバノミラーを用いて構築されます。対物レンズのフォーカスの正確なスキャンビームを作成するには、これらのミラーは、4つのリレーレンズを使用して、いわゆるテレセントリック平面に配置されます。共焦点検出は標準的な、既製の光電子増倍管（PMT）を使用して実行され、画像がキャプチャされ、Matroxの画像取込装置のカードと付属のソフトウェアを使用して表示されます。

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

カスタム、リアルタイムの走査型共焦点イメージングシステムの完全な構造が記載されている。容易にビデオレートの顕微鏡とmicroendoscopyに使用することができるこのシステムは、コストのほんの一部で、標準的な商用共焦点システムを使用してアクセスできませんイメージングジオメトリとアプリケーションの配列が可能になります。

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

27.7K ビュー.  Harvard University. カスタム、リアルタイムの走査型共焦点イメージングシステムの完全な構造が記載されている。容易にビデオレートの顕微鏡とmicroendoscopyに使用することができるこのシステムは、コストのほんの一部で、標準的な商用共焦点システムを使用してアクセスできませんイメージングジオメトリとアプリケーションの配列が可能になります。

ビデオ: Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

生物工学

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

ナイフエッジスキャン顕微鏡用試料作製、イメージング、および解析プロトコル

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

マルチモーダルイメージングおよび非侵襲のための分光繊維束Microendoscopyプラットフォーム、<em&gt;インビボ</em&gt;組織分析

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

陰茎骨の解剖、マイクロCTスキャンおよび形態計測分析

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

哺乳類の細胞分裂量的共焦点反射顕微鏡を介して 3 D 行列

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big challenge with the state-of-the-art retinal imaging modalities because they would require z-stacking to compile a volumetric dataset. Newer optical coherence tomography (OCT) and OCT angiography (OCTA) systems overcome these restrictions to provide three-dimensional (3D) anatomical and vascular images, but the dye-free nature of OCT cannot visualize leakage indicative of vascular dysfunction. This protocol describes a novel oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO) technique that provides 3D volumetric fluorescence retinal imaging. The setup of the imaging system generates the oblique scanning by a dove tail slider and aligns the final imaging system at an angle to detect fluorescent cross-sectional images. The system uses the laser scanning method, and therefore, allows an easy incorporation of OCT as a complementary volumetric structural imaging modality. In vivo imaging on rat retina is demonstrated here. Fluorescein solution is intravenously injected to produce volumetric fluorescein angiography (vFA).

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Here, we present a protocol to get a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence and OCT retinal image by using a novel imaging multimodal platform. We will introduce the system setup, the method of alignment, and the operational protocols. In vivo imaging will be demonstrated, and representative results will be provided.

斜め走査レーザー眼底 (オスロ) と光干渉断層計 (OCT) によるマルチモーダルインタ体積網膜イメージング

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

ライブセル上の近くの同時レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡(コンポカル)

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...