この作業のための資金はBFBSに成長アイオワ値基金賞によって提供されていました。

1。滅菌粘着テープで表面のサンプリング<ol><li>サンプリングに使用するテープを選択します。市販のカビ - テープまたはCON -タクト - それはサンプリングのテープは、使いやすさのための滅菌と特別にパッケージされている。しかし、我々は、透明（光学的に透明な）一般的なオフィスのテープも使用できることを見出した。 </li><li>粘着テープの10cmの部分（紙のテンプレートを使用することができる）の非粘着面に1cm 2の正方形を描画するための恒久的なマーカーを使用してください。これは、テープの一部が、食品または環境表面をサンプリングするために使用されている注目のための視覚的なガイドとして機能します。 </li><li>サンプリングする面に対向する粘着面とテープの&quot;C&quot;字型のループを形成。これを行うには、テープの背面に描かれた四角（非粘着面）（図1）に対して、親指と中指と位置と粘着末端の人差し指を保持する。 </li><li>サンプリングされる表面にテープを置き、軽く表面に対してマークされた領域を押してください。テープの端を放出することなく、テープの粘着面は気泡を避け、試料表面と完全に接触することを保証するために人差し指を使う。 </li><li>さらにモーションを使用して、徐々に物理的に表面結合微生物を抽出し、離れてサンプルからテープを引き出します。一般的な透過的なオフィスのテープを使用してガラスの顕微鏡スライド上に、セルチャージャーテープ、粘着面を固定します。フラット、非しわになりやすい面が作成されるよう、テープの適切なテンション/ストレッチングを確認してください。これは変形/ハイブリダイゼーションの間その後の加熱中にテープのカールの問題を最小限に抑えることができます。 </li></ol> 2。固相濃縮および液面Miniculture <ol><li>固体相の濃縮は、サンプリングされた細胞を寒天表面に直接接触して配置されるようにキシロース-リジン-タージトール4（XLT - 4）寒天プレート上に直接フェースダウンテープを置くことによって行われます。テープのテンプレート/サンプルの接触部は、寒天の表面とテープの一端が緩く濃縮に続く寒天表面からテープを簡単に除去を容易にするために、ペトリ皿の側壁に付着さと同じ高さに配置されます。 </li><li>プレートを反転（結露を避けるために）と35℃でインキュベートされる- 37℃のサルモネラの十分な成長を可能にする。検出可能なレベルに細胞を豊かにするために必要な潜伏期間の長さは初期のサルモネラ汚染レベルに依存します。我々は8時間の濃縮後に低い初期接種から優れた微小コロニー形成を観察した。 </li><li>希望の濃縮期間の後、寒天プレートを開きます。テープは、インキュベーション中に、その粘着性を保持します。ゆっくりとテープ寒天界面に形成microcoloniesの最大回収を確実にするために人差し指を使って寒天に対してテープを押してください。ペトリ皿の壁に取り付けられた端からテープをつかみ、ゆっくりと、さらに動きでそれを削除してください。上記のセクション1.5で説明したように顕微鏡スライド上に細胞チャージャーテープ、最大粘着面を、マウントします。以下&quot;固定と脱水&quot;の手順に進みます。 </li><li>液面minicultureの場合、上記のセクション1.5で説明したように顕微鏡スライド上にサンプリングに使用されるテープを固定することから始めます。次に、底部上を向いて、細胞に帯電したテープから構成されている密封されたチャンバを形成する非無菌シリコン灌流チャンバー（Coverwell、グレースバイオ研究所、（株））とテープのテンプレート化/サンプルの接触部を、カバーしています。しっかりと、かつ慎重に防水シールを確保するためにチャンバーを押してください。 </li><li>柔軟なゲルローディングピペットチップ、室の小さな入口ポートのいずれかを経由して転送≤500μLトリプチケースソイブロスまたは他の適切な増菌培地を使用する。 35 -37で蒸発し、インキュベートするスライドを防ぐために透明なオフィステープで両方のポートを密封° Cに十分な濃縮のために必要に応じて。すべての操作が良好なサンプリングと処理の慣行にしたがって行われるべきですが、ポートシールテープまたは灌流室の無菌性は、液面のminiculture時に必須ではありません。 FISHとフローサイトメトリーの組み合わせは、 サルモネラ属の明確な差別が可能になります。サンプル自体から来ると予想非標的植物の最大の貢献と、存在する可能性がある非標的細菌から。以下&quot;固定と脱水&quot;の手順に進みます。 </li></ol> 3。固定と脱水<ol><li>直接表面のサンプリング用やサルモネラの固相濃縮のための。 XLT - 4寒天上、25℃で30分間細胞を固定、テープの上で実行〜500μLをサンプルの接触面積をカバーすることによりC 10％中性緩衝化ホルマリン。 </li><li>密閉式容器内に固定液を捨て（化学フードの下毒性/刺激性の蒸気への曝露を最小限にするため）。 </li><li>エタノール系列で脱水し（50％、80％、95％、300μL/ 3分ごとに濃度）。下記の&quot;ハイブリダイゼーション&quot;の手順に進みます。 </li><li> 500μLの液面のminicultureのサンプルの固定用の、潅流チャンバーが開封され、かつ柔軟なゲルローディングピペットチップはenrichateを抽出するために使用されます。上下に迅速なピペッティングが、残りのテープ結合細胞の効果的な除去を保証するために使用されます。 </li><li>次に、全体の500μLminiculture量は微量遠心チューブに移し、2,000 × gで（5分）でスピンダウンしています。上清は廃棄され、ペレットは、10％の等量に再懸濁し、30〜60秒間激しくボルテックスれる中性緩衝ホルマリン。細胞を25℃で30分のために固定されています</li><li>次に、固定液が除去され、サンプルは次のように、細胞の保存バッファーに再懸濁する。 60秒、50％非変性エタノール50％の等量に再懸濁し、リン酸 - サンプルは、2,000 × gで（5分、25℃）上清を捨てている、ペレットを30を激しくボルテックスしている時にスピンダウンしている緩衝生理食塩水。固定された細胞は-20℃で（年間）無期限に保存することができます注意：液体が（例えば、固定液または別のバッファを導入する際に）変更されるたびに、それは（ボルテックスで）完全に再懸濁させることが重要である最小限の部分（〜10から20μL）で細胞ペレット&quot;発信&quot;液体のシステムの。これは、凝集を防止し、個々のセルの偶数濁液が得られることを確認するのに役立ちます。下記の&quot;ハイブリダイゼーション&quot;の手順に進みます。 </li></ol> 4。交配<ol><li>材料表に記載されている商用分子生物学グレードのソリューションを用いてハイブリダイゼーション/洗浄バッファーを準備します。最後のバッファ成分の濃度は、0.7MのNaCl、0.1 Mトリスは[pHを8.0]、10mMのEDTA、0.1％ドデシル硫酸ナトリウムは、分子のグレードの水と最終的な目的のボリュームに構成し、0.22μmのシリンジやカップのフィルターを使用してフィルタリングされます。プローブを添加していない同一のバッファは、（下記参照）、洗浄バッファーとして使用されます。 〜55の予熱ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファー℃の</li><li>蛍光標識追加Sal3（Nordentoft ら、1997;。5&#39; - AAT CAC TTC ACC TAC GTG - 3&#39;）とザルム- 63（クッターら、2006;。5&#39; - TCG ACT GAC TTC AGC TCC - 3&#39;予熱したハイブリダイゼーションバッファーに）オリゴヌクレオチドプローブ（材料表）。 5 ngのμL-1の合計プローブ濃度は、（;碧砂とブレーム-ステッチャー、2009A 2.5 ngのμL-1各プローブなど）が使用されます。 </li><li>直接テープへと固相濃縮サンプルについては、プローブのカクテルを含むハイブリダイゼーション緩衝液300μlでテープのテンプレート化サンプルの接触面積をオーバーレイし、55℃に設定されて湿った、密封されたインキュベーションチャンバーにテープ結合細胞をハイブリダイズスライドモート機器（材料表）などの直接接触インキュベーターが使用されている場合、サンプルは15分間ハイブリダイズされ、&gt; 20枚のスライドを同時に処理することができます。このようなバンビーノ機器（材料表）のような回転式のハイブリダイゼーションオーブンを使用している場合、スライドはハイブリダイゼーション用の50 mLのポリプロピレン遠心チューブ、チューブごとにスライドに配置されます。熱伝達が直接ではないため、これらのサンプルは、より長い期間（最長30分）にハイブリダイズさせる。 </li><li>ハイブリダイゼーション後、スライドが削除され、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーのオーバーレイは破棄されます。スライドは、予熱した洗浄バッファのオーバーレイまたはいずれかとし（最大30分）のどちらか簡潔に、ゆっくりと傾斜スライド（300μL、それぞれの3リンス）を介してバッファの小さなボリュームをピペッティングすることにより予熱洗浄バッファーですすぎ、または正式に洗浄しています予熱した洗浄バッファーを含む50 mLポリプロピレン製遠心チューブに浸漬。我々の経験では、正式な洗浄が改善された結果を（非連結プローブから以下ヘイズ）を提供しますが、簡単なリンスはサルモネラ属の明確な検出に適しています。次に、スライドの下に&quot;検出&quot;のステップに移る前に空気乾燥する。 </li><li>液面のminicultureサンプルのハイブリダイゼーションは、積極的なペレットのボルテックスとを含む100μL予熱したハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁し、続いて2000 × gで5分間（-20℃でたての固定または記憶バッファに保持されている）サンプルをスピンダウンして実行されます。プローブのカクテル。サンプルは55℃でハイブリダイズしている500℃μL予熱した洗浄バッファーを添加し、続いてヒートブロックまたは他の適切なインキュベーションの駅（材料表）、上で30分間。テープバウンドサンプルと同様に、これらのサンプルは、正式に断続的にボルテックスしながら55℃でさらに培養して30 minでこの洗浄バッファーでC、にのためにまで洗浄することができる。また、サンプルは徹底的に分析するための即時の収穫（下）に続いて、500μL予熱した洗浄緩衝液の添加後ボルテックスすることができます。 </li><li> サルモネラ属菌を検出するための準備に。フローサイトメトリーを経由して、液面のminicultureのサンプルは5分2,000 xgでスピンダウンしている、上清を捨て、サンプルは300μL室温に再懸濁している（〜25℃）PBS。サンプルは遠い施設への輸送が必要な場合は遅延がハイブリダイゼーションと解析との間で期待されている場合、または、サンプルは前のANAに冷蔵または氷の上で開催することができる溶解。また、サンプルは、細胞の保存バッファー（PBSと無水エタノールの50:50混合物）に転送し、でかなりの損失のない週までは-20℃で保持することができるプローブ与え蛍光（碧砂とブレーム - ステッチャー、2009B） 。 </li></ol> 5。検出<ol><li> サルモネラ属の上にテープを検出するため。蛍光顕微鏡を介して、テープに直接または固相濃縮サンプルは、核の対比4を含む〜10μLVectashield H - 1200封入剤&#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）、カバースリップをマウントした、と重ねてその後、10分間暗所でインキュベートした。 </li><li>液浸油は、カバースリップ上に配置され、そしてサンプルは、高倍率の油浸対物（63xまたは100倍）を用いて検討されています。 DAPIフィルターが焦点に試料をもたらすために使用されている、顕微鏡は、適切なフィルターに切り替えられます（緑または赤、エンドラベルプローブするために使用される染料に応じて）およびサルモネラの細胞は、それらの蛍光（図にしたがって視覚的に採点されます2と3）。 </li><li>液面のminicultureサンプルのサイトメトリー検出のために、様々な楽器がローカル可用性に応じて、使用することができます。私たちの研究室では、PBSに懸濁した検体を5 mLの丸底サンプリングチューブ（BDファルコン）に移し、647 nmの（材料表）で励起したFACSCantoフローサイトメーターを用いて検討している。合計細菌の高い数字を含む豊かなサンプルについては、&quot;低流量&quot;の設定は（10μL分-1）が使用されますと5,000-50,000イベントが収集されます。データはFlowJoソフトウェア（バージョン8.8.6、ツリースター社、オレゴン州アッシュランド）または他の適切な解析ソフトウェア（図4、パネルAおよびB）を用いて分析されています。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 サルモネラ属菌のサンプリングのために粘着テープを使用してください。人為的に汚染されたトマトの表面から。 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。直接テープへのサンプリングとトマトの表面（100 Xの油浸対物）からネズミチフス菌 ATCC 14028の魚群探知のための典型的な結果。テキサスレッドでラベルされたプローブ（Sal3/Salm-63）の2プローブのカクテルが使用されたこれらの細胞を標識する。 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。キシロースリジンタージトール- 4（XLT - 4）37℃8時間のオンテープ濃縮℃、後の寒天の表面に形成されたネズミチフス菌 ATCC 14028のMicrocoloniesは初期接種は人工的に汚染されたトマトの表面から採取した。固相濃縮、検出のために利用可能な細胞数が増加し、また、細胞rRNAの内容を向上させます。 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 S.のサンプリングのための粘着テープの使用FISHとフローサイトメトリー（パネル）を介して、または500μLのトリプチケースソイブロス（パネルBで満たされた灌流チャンバ内で5時間の非選択的液面minicultureの濃縮後に直接分析に続いて人工的に汚染されたトマトの表面からenterica血清型ネズミチフス菌、 ）。

<ol>
	<li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples.">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li><li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape.">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adhesive-tape-based+sampling+of+tomato+surfaces+combined+with+rapid+fluorescence+in+situ+hybridization+for+Salmonella+detection.">Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 .</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-through+imaging+cytometry+for+characterization+of+Salmonella+subpopulations+in+alfalfa+sprouts,+a+microbiologically+complex+food+system.">Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system.</a> Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).</li><li>Edwards, R. W., Hartman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+collecting+fungus+specimens+from+infected+surfaces.">A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces.</a> Lloydia. 15, 39-39 (1952).</li><li>Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F., Pouch Downes, F., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+monitoring+of+the+food+processing+environment.">Microbiological monitoring of the food processing environment.</a> Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. , (2001).</li><li>Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+tape+method+for+estimating+microbial+load+on+meat+surfaces.">Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces.</a> J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).</li><li>Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+barley+(Hordeum+vulgare)+with+Salmonella+enterica+and+Listeria+spp.">Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).</li><li>La Cono, V., Urz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+applied+on+samples+taken+with+adhesive+tape+strips.">Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).</li><li>Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+controlling+microbiological+contamination+of+beverage+dispensers+in+university+foodservice+operations.">Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations.</a> Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).</li><li>Langvad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+qualitative+and+quantitative+study+of+the+fungal+flora+of+leaves.">A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves.</a> Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).</li><li>Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+fluorescence-labelled+oligonucleotide+probe+targeting+23S+rRNA+for+in+situ+detection+of+Salmonella+serovars+in+paraffin-embedded+tissue+sections+and+their+rapid+identification+in+bacterial+smears.">Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

農産物表面の病原体の検出のための簡単​​かつ迅速な方法は、タイムリーで実用的なデータを提供することにより、食品媒介疾患の軽減に役立つことがあります。粘着テープベースのサンプリング方法は1950年代から、環境への臨床的および食品微生物学で使用され、直接顕微鏡検査またはのための固体培地に付着した微生物の移転に続いて、微生物の除去のために表面に&quot;スコッチ&quot;...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fungi-Tape sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL</td>
<td>745</td>
<td>http://www.scientificdevice.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Con-Tact-It sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Birko Corporation, Denver, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.birkocorp.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear office tape, generic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence</td>
</tr>
<tr>
<td>Food surface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local grocery</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypticase Soy Broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>211768</td>
<td>For non-selective liquid surface miniculture enrichment</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>223420</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>235310</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Formalin solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>HT5011</td>
<td>10% solution, neutral, buffered (cell fixative)</td>
</tr>
<tr>
<td>Absolute ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>E7023</td>
<td>Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RNase- and DNase-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slides and cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>S5150</td>
<td>Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>T9285</td>
<td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>L4522</td>
<td>10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies, Coralville, IA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5&#x2019;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified</td>
</tr>
<tr>
<td>Variable speed microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>CoverWell perfusion chamber </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR</td>
<td>PC1R-2.0</td>
<td>Non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>05-408-151</td>
<td>Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum heat block or precision-controlled heating station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Bambino mini hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 230300</td>
<td>Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide Moat slide hybridizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 240000</td>
<td>Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield H-1200 mounting medium with 4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td>
<td>H-1200</td>
<td>Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leitz Laborlux S used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canon PowerShot A640 camera used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used</td>
</tr>
<tr>
<td>Adobe Photoshop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Adobe Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometry analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combination of adhesive-tape-based sampling and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of salmonella on fresh produce

このプロトコルは、 サルモネラの迅速なカルチャに依存しない検出のためのin situハイブリダイゼーション（FISH） でオンテープ蛍光続いてトマトや他の生鮮食品の表面の粘着テープベースのサンプリングのためのシンプルなアプローチを、説明します。セル充電されたテープは、検出前に固相濃縮のための選択寒天培地に直接フェースダウンに配置することができます。また、少量の液体富化（液面のminiculture）はフローサイトメトリーを経由してFISHと分析に続いて、非選択培養液中のテープの表面に行うことができます。開始するには、無菌の粘着テープが新鮮な農産物と接触させ、物理的にこれらの表面上に存在する微生物を抽出し、穏やかな圧力が適用され、テープが削除されます。テープは、顕微鏡用スライドガラスの上にまで粘着側にマウントされ、サンプリングされた細胞を、10ホルマリン％（30分）と段階的エタノールシリーズを用いて脱水（50、80、および95％、3分ごとの濃度）で固定されています。次に、細胞に帯電したテープは、 サルモネラをターゲットとしたDNAプローブのカクテルを含むバッファーでスポットし、15でハイブリダイズさせる- 55℃で30分間、非結合プローブを除去するための洗浄バッファーでリンス短いが続く。接着、FISH -標識細胞は、蛍光顕微鏡を使用して表示しているDNA色素4&#39;,6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）との結果で対比されています。固相濃縮するために、細胞に帯電したテープは、適当な選択寒天の表面に直接フェースダウン配置され、 サルモネラ microcoloniesのその場成長に許可するようにインキュベートし、上記のようFISHと顕微鏡が続きます。液面minicultureの場合は、セルに帯電したテープは、粘着面を上に配置され、シリコン灌流チャンバーが適用されているので、テープや顕微鏡のスライドの形防水チャンバー内の底部トリプチケースソイの小さい容積（≤500μL）ブロス（TSB）が導入されています。入口ポートは封印されており、チャンバーを35℃でインキュベートされる - 37 ° C、テープ抽出した微生物の増殖ベースの増幅を可能にする。インキュベーション後、入口ポートが開封され、細胞が分離し、混合精力的なバックで前後にピペッティング、遠心分離を介して収穫し、10％で固定されている中性緩衝ホルマリン。最後に、サンプルをハイブリダイズし、 サルモネラ属菌の存在を明らかにするためにフローサイトメトリーを介して検査されます。ここで説明したように、私たちの&quot;テープ- FISH&quot;のアプローチは、シンプルかつ迅速なサンプリングとトマトの表面のサルモネラの検出を提供することができます。我々はまた、ほうれん草とハラペーニョペッパーを含む生鮮食品の他のタイプを、サンプリングするためのこのアプローチを使用している。

Watch this Scientific Journal Video about Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce at JoVE.com

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

このプロトコルは、急速な細胞全体の検出に続いてトマトや他の生鮮食品の表面のサンプリングのための簡単​​な粘着テープベースのアプローチを、説明して<em&gt;サルモネラ</em&gt;蛍光を使用して<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）。

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

12.9K ビュー.  Colorado State University. このプロトコルは、急速な細胞全体の検出に続いてトマトや他の生鮮食品の表面のサンプリングのための簡単​​な粘着テープベースのアプローチを、説明してサルモネラ蛍光を使用してその場でハイブリダイゼーション（FISH）。

ビデオ: Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

ロックされた核酸のフローサイトメトリー、蛍光その場でハイブリダイゼーション（LNAフロー- FISH）：細菌のsmall RNAの検出のための方法

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

免疫・感染学

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

ハイブリダイゼーション<em&gt;その場で</em&gt;唾液腺、卵巣、および媒介蚊の胚の

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

蛍光灯<em&gt;その場で</em蚊の分裂期染色体上&gt;ハイブリダイゼーション

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

蛍光<em&gt;その場での</emウイルスと植物及び昆虫組織における共生細菌の局在化のための&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場でハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について