この作品は、米国海軍研究所のコアファンドを経由して米海軍研究局によってサポートされていました。

1。 LNAプローブと実験計画<ol><li>あなたの転写sRNA / mRNAの逆補数であるか、またはそれらにカスタムデザインをお持ちの設計LNAプローブ<a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> 。カスタム設計のオプションを使用している場合は、シーケンスを知っている、ではなく、LNAスパイクパターンになります。の間のT mの増加にDNAまたはRNAオリゴヌクレオチド結果に各LNA残基のほか2〜10 ° C LNA - RNAハイブリダイゼーションの二重14。理想的には、設計したLNAプローブは、長さ20〜25ヌクレオチド（長いプローブを合成するより困難である）の間であると85から90の間のT m℃のRNAのハイブリダイゼーションが必要です。 </li><li>シーケンスを設計した後、BLASTの使用<a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiを</a>プローブにのみ興味のあるsRNA / mRNAに特異的であることを確認したり、ローカルデータベースへのプローブ配列を比較する。 </li><li>LNAプローブをご注文の際は、LNAオリゴヌクレオチドの5&#39;末端にビオチン- TEGの変更を追加。ビオチンは、ストレプトアビジン - 色素複合体とポストハイブリダイゼーション染色のために必要です。それは3にこの変更を追加することが可能である&quot;必要があれば終わりが、5に加えて&#39;末端には、安価で高収率になるはずです。 </li><li>三ネガティブコントロール方法に含まれるべきである：（i）のLNAプローブはハイブリダイゼーション工程中に追加されていない&#39;NO LNA&quot;制御、LNAプローブはにハイブリダイズされている（II）&quot;無色素&quot;制御ターゲットsRNAがハイブリダイゼーションのイベントは順番に、存在しないまたは非発現sRNAをターゲットとLNAプローブを利用した制御を蛍光染色の欠如に起因する検出、および（iii）&quot;非発現sRNA /発現&quot;されていません非特異的ハイブリダイゼーションをモニターする。 </li><li>ここに特定のLNAプローブはsRNA CsrBを補完するものであり、配列5&#39; -ビオチン- TEG - gTccAttTccCgtCctTagCagC - 3&#39;（LNAのモノマーでいます）の文字を大文字。 </li><li> -20℃で10〜20μLのアリコートで50μg/ mLとし、店舗にヌクレアーゼフリー水で再懸濁し凍結乾燥LNAの受領、次の</li></ol>ソリューション<ul><li> 8パーセントparaformaldehye（PFA）、PBS中10％酢酸：ミックス1 mLの32パーセントPFA、400μLの酢酸、400μL10 × PBS、pHは= 7.4、および2.2 mLのヌクレアーゼフリー水。冷凍アリコートの場合は、酢酸なし-20 ° Cで単回使用のアリコートに凍結する。 </li><li> 60パーセントデキストラン硫酸溶液：50mLのコニカルチューブに6.0グラムデキストラン硫酸を加え、10 mlの最終体積に水を加える。デキストラン硫酸（1-2時間を取ることができる）に溶解するまで℃の水浴中で65にこの混合物を加熱する。追加の水を10 mLのボリュームを維持するために可溶化プロセス全体を追加する必要があります。使用するまで-20℃でアリコート60パーセントデキストラン硫酸溶液および店。 </li></ul> 2。固定<ol><li>生物発光の収穫1 × 10 8細胞<em&gt;ビブリオcampbelliiたり、細菌関心のと1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移す。細胞のこの量は、4つのフロー- FISHのサンプル（特定のLNAプローブのサンプル三ネガティブコントロール）のための十分な出発原料を提供します。他のsRNA / mRNAが種をテストする必要がある場合はさらに1.5 mlのマイクロ遠心チューブのアリコートを収集する必要があります。 </li><li>ペレットを5分間2300 × gで遠心分離によって細菌細胞。ピペッティングにより上清を捨て、1 × PBS 400μLで細胞を再懸濁します。 </li><li>この混合物に、、（1X PBS）溶液を緩衝生理食塩水うまくミックス1Xリン酸8％paraformaldehye（PFA）及び10％酢酸の400μLを追加し、25℃で10分間インキュベート℃、5分後に一度混合。すべてのインキュベーションは、特に断りのない限り、加熱管のホルダーで実行されます。 PFAのソリューションは、新しく調製し又は酢酸の添加後、凍結アリコートから使用する必要があります。パラホルムアルデヒドはhその架橋固定液です。elps細胞の形態を維持し、細胞内のRNAを保持する。 </li><li>ペレットは、2分間に4500 × gで遠心分離によりこの混合物から細胞をピペッティングにより上清を取り除く。遠心分離を必要とする将来のすべての手順は同じ設定を（7K、2分）使用する必要があります。以下の遠心分離は、上清をピペッティングし、デカンテーションではないが除去されるべきであることに注意することは重要です。 </li><li> 400μL1X PBSで2回細胞を洗浄し、400μlの1X PBSで最終的に細胞ペレットを再懸濁します。細胞は修正され、4℃で保存できます400μlの1X PBSでCは、最大7日間。 </li></ol> 3。ジエチルピロカーボネート処理<ol><li> 1X PBSでジエチルピロカーボネート（DEPC）（この溶液400μLをそれに応じてその規模テストされるすべてのサンプルのために必要とされる）の0.1％溶液400μLを準備します。 DEPC溶液はDEPCストックから、新鮮な準備する必要があります。 DEPC処理はcarbethoxylationでRNaseを不活性化し、減少バックグラウンド信号。 </li><li>各固定細菌の細胞サンプル0.1％DEPC溶液400μLを追加し、ピペッティングによりよく混和する。 12分間2​​5℃でこの混合物をインキュベートする。 400μLの1 × PBS、細胞をペレット化（7K、2分）で細胞を2回洗浄し、上清を取り除く。 </li></ol> 4。透過化<ol><li>は1.0 mg / mL溶液を1 mLのトリス- EDTA緩衝液（10mM Tris、1mMのEDTA、pH8.0）中にリゾチームの1.0ミリグラムを追加。このソリューションは、新鮮な準備する必要があります。 25℃で800セルに1 mg / mLのリゾチーム溶液のμL、ピペッティングでよく混合し、インキュベートを追加°時々混ぜながら30分間。ペレット細胞（7K、2分間）し、上清を取り除く。リゾチームは、細菌の細胞壁のペプチドグリカンに存在する加水分解することにより透過化の試薬として機能します。 </li><li> TE緩衝液中のプロテイナーゼK 3.0μg/ mLの溶液を調製します。この溶液を-20℃で保存されている20 mg / mlのプロテ​​イナーゼKの在庫からの新鮮な準備する必要がありますプロテイナーゼKは、様々なタンパク質を消化し、RNAのプローブと試薬のアクセシビリティを支援するセリンプロテアーゼである。 </li><li>細胞ペレットを〜3.0μg/ mLのプロテイナーゼK溶液800μLを追加し、ピペッティングでよく混ぜる。インキュベーションの途中にボルテックスしながら15分間25℃でインキュベートする。 </li><li>ペレット細胞（7K、2分間）、上清を除去し、400μlの1X PBSで細胞を1回洗浄する。洗浄上清を除去した後、400μlの1 × PBSで細胞を再懸濁し、つの新しい1.5 mlのマイクロチューブに再懸濁液100μLを加える。ペレット細胞（7K、2分間）し、上清を取り除く。 </li></ol> 5。交配<ol><li>各サンプルのハイブリダイゼーションバッファー（HB）100μLを準備します。 HBは、体積、質量10％デキストラン硫酸（100μL、60％デキストラン硫酸溶液の16.7μLを加える）、1Xデンハルト溶液、50mMリン酸ナトリウムpH7.0の50％ホルムアミドで構成されています2Xクエン酸ナトリウム（SSC）、剪断サケ精子DNA（SSSD）と20μgの酵母tRNAの20μgの。 </li><li> HBの各コンポーネントは、異なる目的を持っています。ホルムアミドは、それによってRNAの変性と細胞の損傷を最小限に抑えることを手伝って核酸二重鎖の融解温度を下げる。デキストラン硫酸は、ポリマーは、プローブを集中し、ハイブリダイゼーションの速度を高めるために - を除くボリュームとして使用されます。 Denhardtsソリューションは、酵母tRNAとSSSDは、非特異的結合を減らすためにブロッキング剤として機能する。 </li><li>セルの各々の再懸濁を含む1.5 mlのマイクロチューブを、95μLHBとsRNA /の5.0μL追加mRNAを特異的LNAまたは水（LNAネガティブコントロールがないため）[特定のLNAの最終濃度を20 pmolの]。次に例を示します。 <ol class="lalpha"><li>チューブ1から95μLHB + 5.0μLsRNA / mRNAの特異的プローブ</li><li>チューブ2から95μLHB + 5.0μLsRNA / mRNAの特異的プローブ（&quot;無色素&quot;ネガティブコントロール） </li><li>チューブ3から95μLHB + 5.0μLsRNA/ mRNAのプローブ（&quot;非発現sRNA / mRNAは&quot;ネガティブコントロール） </li><li>管4から95μLHB + 5.0μL水（&#39;NO LNA&quot;ネガティブコントロール） </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> 60分間60℃ですべての4つのサンプルをインキュベートする。ハイブリダイゼーション温度は、LNAプローブ（S）T mに依存し、約30に設定する必要があります℃のアニーリングRNAのT mを予測以下。 HBの上昇、ハイブリダイゼーション温度とホルムアミドの両方がsRNAまたは関心のmRNAの二次構造の変性を保証します。 </li></ol> 6。ポストハイブリダイゼーションの洗浄<ol><li>ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション混合物に0.1％Tween - 20を1.0 mLの0.1 × SSC（SSCT）を追加します。これは、細胞が粘性のハイブリダイゼーション溶液から除去できるようにする必要があります。ペレット細胞（7K、2分間）し、上清を取り除く。 </li><li>徹底的にとincub混ぜ、細胞のペレットに50％ホルムアミド200μLの、2X SSC、0.1％Tween - 20を追加65℃の加熱ブロックに30分間食べた。 </li><li>混合、ペレット細胞（7K、2分）に1 mLの0.1 × SSCTを追加し、上清を取り除く。 </li><li>細胞を再懸濁し、ヒートブロックで65℃40分℃でインキュベートする500μL0.1X SSCTを追加。ペレット細胞（7K、2分間）し、上清を取り除く。 </li></ol> 7。ブロッキングと染色<ol><li>ブロッキングバッファー（BB）とストレプトアビジン - 色素染色液を準備する。 5X在庫から1X BBの溶液を調製します（市販の、試薬を参照）。 4本のチューブのすべてのセットの場合は、1.2 mLの1X BBを準備。 </li><li> 、細胞のペレットを200μL1X BBを追加し再懸濁し、25℃で30分間インキュベート℃、 </li><li>ストレプトアビジンコンジュゲート色素、ビオチン化LNAプローブを検出するために使用されます。ブロックしながら、2μg/ mLのDyLight 488ストレプトアビジンまたは30分（三つの試料のために、300μLを加える）のための1X BBでご希望の色素-ストレプトアビジン複合体の溶液を調製。 </li><li> incub後1X BB、細胞をペレット化（7K、2分間）、上清を除去するとation。 、細胞ペレットにストレプトアビジン - 色素溶液50μLを加えて完全に混合し、25℃で12分間インキュベート° C渦上またはサーモミキサーで一定のミキシングと。 &quot;無色素&quot;制御のために、わずか50μL1Xブロッキング緩衝液を加える。プロトコルの残りの部分では、アルミ箔を使用して、光からチューブを保護します。 </li><li> 500μL0.1X SSCTのバッファを持つと一度0.1％のTween - 20（PBST）400μL1 × PBSで細胞を1回洗浄する。ペレット細胞（7K、2分間）し、上清を取り除く。 </li><li>最初のストレプトアビジンコンジュゲート染色後、信号はストレプトアビジン-色素複合体にビオチン化抗ストレプトアビジン抗体を導入してから（ 図2）ハイブリダイズしたLNAプローブあたりの信号の出力を増加させるため、ストレプトアビジン-色素で2回目を染色することによって増幅され。 </li><li> 1X PBS、resuspenで1μg/ mlのビオチン化抗ストレプトアビジン抗体を100μLを追加D細胞、および25℃でインキュベート時々混ぜながら30分間を。ペレット細胞（7K、2分間）、上清を除去し、400μlの1X PBSTで2回洗浄。 </li><li> 、細胞を2μg/ mLのストレプトアビジン - 色素溶液50μLを追加徹底的に混合し、25℃で12分間インキュベートします渦上またはサーモミキサーで混合定数Cを。 &quot;無色素&quot;制御のために、わずか50μL1Xブロッキング緩衝液を加える。 </li><li> 500μL0.1X SSCTのバッファーで1回細胞を洗浄し、一度400μL1X PBST。 </li><li> 4で200μL1X PBSTと店舗で細胞を再懸° C、フローサイトメトリー解析のための準備ができるまで。小さな細菌細胞のコアサイズを小さくするために減速する流量を設定します。さらに、前方散乱のしきい値のカットオフを持つフローサイトメーター用に、カットオフは小さな細菌細胞が検出されるように、可能な限り低く設定する必要があります。 </li><li> DyLight 488検出のために、フローサイトメーターは、488 nmのレーザーと基準排出ガスに装備する必要がありますFITC用のフィルター。少なくとも2 × 10 4つのイベントを収集する必要があります。別のレーザーを搭載したフローサイトメーターとの互換性のために、他のストレプトアビジン結合蛍光色素は、このプロトコルのために使用することができます。 </li></ol> 8。代表的な結果固定し、効果的に浸透化されたセルの例を図3aにフローサイトメトリードットプロットで示されています。透過化のために、上記の条件を使用する場合は、細胞集団は小さく、均一なことを示すいくつかの細胞集合体です。リゾチームの高い（5 mg / mLの）濃度が使用されている場合、細胞が凝集する可能性が高いとより大きな粒子（ 図3B）を示す前方に増加散布値を、示す。成功したLNAフロー- FISHの実験から、フローサイトメトリーデータの例を図4に示されています。ヒストグラムは、次の3つのネガティブコントロールと共にターゲットsRNAの特異的検出を示しています。&quot;無色素&quot;ネガティブコントロールは、&quot;いいえLNA&#39;と&#39;非発現sRNA&quot;ネガティブコントロールに続いて、少なくとも蛍光を生成します。最後に、sRNA固有のLNAプローブを用いたサンプルは、最大の蛍光を生成します。方法とLNAプローブはこの方法で検証されると、追加の実験が変異または様々な培養条件、等に反応して、時間をかけてsRNA信号の変化を監視するように設計することができます<img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> 図1。細菌sRNAの検出のためのLNAフロー- FISHの実験の全体的なスキームの描写。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> 図2。LNAフロー- FISH信号の染色と増幅。ビオチン化LNAプローブのa）ハイブリダイゼーション。蛍光DyLight 488ストレプトアビジンコンジュゲートとB）染色。ビオチン化抗- sのc）の結合DyLight 488ストレプトアビジンへtreptavidinの抗体。抗体はその抗原結合部位を介してストレプトアビジンを結合することができるか、そのビオチン残基を介してストレプトアビジンが結合することができる。蛍光DyLight 488ストレプトアビジンコンジュゲートとのさらなる染色による信号のd）の増幅。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> 図3。）1 mg / mLのリゾチーム、3μg/ mLのプロテイナーゼK透過およびb）5 mg / mLのリゾチーム、3μg/ mlのプロテイナーゼKの透過処理のための側方散乱の結果対前方に示すフローサイトメトリードットプロット。 <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> 図4。LNAフロー- FISHの結果のヒストグラム解析。各試料から発生する蛍光信号は、4つのトレースで示されています：ブラック - sRNA固有のLNAプローブ、赤 - &quot;非発現sRNA&quot;陰性コントロール;青 - &#39;NO LNA&quot;ネガティブコントロール;紫 -&quot;無色素&quot;ネガティブコントロール。

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著者らは、開示することは何もない。

ここに示すLNAフロー- FISH法は、式の前にマイクロアレイベースの発現プロファイリングと逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法16を介して確認されているグラム陰性海洋細菌ビブリオcampbelliiからsRNAの発現を検出した。これまでに、我々は分子RNA（タンパク質活性、リボスイッチ、およびmRNAを調節するなどのトランスエンコードされたsRNA、sRNA）の様々な表現を監視するために、このメソッドを使用している。このように、我々は方法が適応であり、任意のsRNAまたはmRNAターゲットを検出するために使用することができ、あらゆる細菌種や細胞タイプで使用するために変更できると確信しています。このプロトコルの変更が他の細胞型のための必要な場合は、操作に考慮すべき最も重要な変数は、透過性のステップです。例えば、ここで説明する透過処理の条件を変更するときに、リゾチームおよびプロテイナーゼKの濃度の変化をテストする必要があります。我々はその倍を見つけたりリゾチームおよびプロテイナーゼKの量を三倍にするとLNAフロー- FISHの結果に大きな変化をもたらした。さらに、追加の透過化の条件をテストするとき、細胞が凝集、細胞の損失、およびバックグラウンド蛍光比に得られるべき最高のシグナルを分析する必要があります。セルクランピングの程度は、顕微鏡および/またはフローサイトメトリーによって試験することができる。前方対側方散乱ドットプロットと正しい透過法で尾がこのテーリングの影響を最小限にするようにフローサイトメトリーにより、細胞塊が存在しています。このメソッドは、ハイブリダイゼーションステップの間に追加した後、抗ジゴキシゲニン抗体と二次抗体-フルオロフォアのコンジュゲートで検出できるようなジゴキシゲニンなどの他のハプテンで標識された追加のLNAプローブは前述のようにプロトコルに大きな変更を加えることなくまた多重sRNAの検出に適している。現在、我々はこの方法で発生していることを唯一の制限は弱く元から十分な信号を生成することができない点です。押さsRNA種と努力は（セル当たりの絶対コピ​​ー数で）検出のしきい値を決定するために進行中です。 全体的に、LNAフロー- FISH法では、プレゼンスとsRNAの種の相対量とその発現が変化する度合いについての洞察を提供するために、ハイスループットの方法で、単一細胞レベルでの細菌sRNAまたはmRNAの発現を測定する機会を提供します。人口インチ

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 10Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4の緩衝化</td><td>アプライドバイオシステムズ/アンビオン</td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>アプライドバイオシステムズ/アンビオン</td><td> AM9932 </td><td> （DEPCは扱われません） </td></tr><tr><td> 32％パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡学</td><td> RT 15714 </td><td>エタノールフリー</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート（DEPC） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D5758 </td><tD&gt;キープ乾燥した</td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK（20 mg / mLの） </td><td>アプライドバイオシステムズ/アンビオン</td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>アプライドバイオシステムズ/アンビオン</td><td> AM9342 </td><td>イオンは、分注して凍結</td></tr><tr><td>デキストラン硫酸MW&gt; 500,000 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D8906 </td><td>一定分量の60％溶液及び凍結</td></tr><tr><td>デンハルト溶液の50X濃縮物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D2532 </td><td>分注して凍結</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム緩衝液20倍</td><td>アプライドバイオシステムズ/アンビオン</td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;TD&gt;サケ精子DNA（せん断）に10 mg / mLの</td><td>アプライドバイオシステムズ/アンビオン</td><td> AM9680 </td><td>分注して凍結</td></tr><tr><td>酵母tRNA（10 mg / mLの） </td><td>ライフテクノロジーズ/インビトロジェン</td><td> 15401-011 </td><td>分注して凍結</td></tr><tr><td> Tween - 20を</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> in situハイブリダイゼーションブロッキング溶液で 5倍</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> MB - 1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488ストレプトアビジン</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> SA - 5488から1 </td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗ストレプトアビジン</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> BA - 0500 </td><td>分注して凍結</td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

蛍光 in situハイブリダイゼーション （FISH）が検出し、細胞環境内の特定の核酸配列をローカライズするために使用される強力な手法です。スループットを向上させるために、FISHは、個々の細胞の数千の標的核酸配列の検出を可能にするためにフローサイトメトリー（フロー- FISH）と組み合わせることができます。各セルは、それによってより強力な統計と分散分析を可能にする、独立した観察として扱われるため、結果として、フロー- FISHは、ライセート/アンサンブルベースの​​核酸の検出方法に比べて明確な利点を提供しています。これらの属性は、異なるアプリケーションの数のFISH、フロー- FISH法の使用を促していると、これらのメソッドのユーティリティが正常にウイルス増殖を監視し、テロメアの長さの決定1,2、細胞の同定と遺伝子発現3,4に示されている感染細胞5、および細菌群集の解析と列挙6。 伝統的に、FISH、フロー- FISH法の特異性はDNAのオリゴヌクレオチドプローブにより付与されています。しかし、最近、FISH、フロー- FISHプローブとしての核酸アナログによるDNAオリゴヌクレオチドプローブの交換が原因で、天然核酸7,8のためのこれらのアナログのより高い融解温度（T m）に各手法の感度と特異度の両方を増加している。ロックされた核酸（LNA）プローブは、DNAまたはRNA配列9,10を通してスパイクLNAヌクレオチドを含む核酸アナログの一種です。フロー- FISHと組み合わせることで、LNAプローブは以前に、従来のDNAプローブ7,11を上回ることが示されていると、正常5哺乳動物細胞内で真核生物のmRNAは12とウイルスRNAを検出するために使用されている。 ここでは、この機能を展開し、細菌の細胞内でRNAの特異的検出を可能にLNAフロー- FISH法を説明します。の（ 図1）。具体的には、小さな非コード彼らは多くの重要な細胞プロセス13の主要な調節要素として機能するように発見されているとして、過去数年間でかなりの関心を集めている規制のRNA（sRNAを）の検出に興味を持っています。しかし、sRNAsと細菌細胞のsRNAを検出する課題を研究するために、限られたツールでは、一部の比較的小さなサイズ（通常は長さが50から300ヌクレオチド）とsRNA分子の低濃度だけでなく、作業の一般的な難しさに起因するあります細胞膜を変化させると小さな生物細胞と。この方法では、我々は細菌細胞の構造を維持し、LNAプローブの浸透だけでなく、低濃度sRNA（ 図2）の特異的検出を可能にする信号増幅のステップを可能に固定し、permeabilzation条件について説明します。

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

小説ハイスループット法は、ロックされた核酸プローブとフローサイトメトリー、蛍光を用いて、単一の細菌細胞からの検出と小さなRNAとmRNA発現の相対定量を可能にすることが記載されている<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション。

ロックされた核酸のフローサイトメトリー、蛍光その場でハイブリダイゼーション（LNAフロー- FISH）：細菌のsmall RNAの検出のための方法

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

locked-nucleic-acid-flow-cytometry-fluorescence-situ-hybridization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

25.2K ビュー.  Naval Research Laboratory. 小説ハイスループット法は、ロックされた核酸プローブとフローサイトメトリー、蛍光を用いて、単一の細菌細胞からの検出と小さなRNAとmRNA発現の相対定量を可能にすることが記載されているその場でハイブリダイゼーション。

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

免疫・感染学

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new infections each year. Despite decades of research, there is still no vaccine against malaria, highlighting the need for novel control strategies. One innovative approach is the use of genetically modified mosquitoes to effectively control malaria parasite transmission. Deliberate alterations of cell signaling pathways in the mosquito, via targeted mutagenesis, have been found to regulate parasite development 1. From these studies, we can begin to identify potential gene targets for transformation. Targeted mutagenesis has traditionally relied upon the homologous recombination between a target gene and a large DNA molecule. However, the construction and use of such complex DNA molecules for generation of stably transformed cell lines is costly, time consuming and often inefficient. Therefore, a strategy using locked nucleic acid-modified oligonucleotides (LNA-ONs) provides a useful alternative for introducing artificial single nucleotide substitutions into episomal and chromosomal DNA gene targets (reviewed in 2). LNA-ON-mediated targeted mutagenesis has been used to introduce point mutations into genes of interest in cultured cells of both yeast and mice 3,4. We show here that LNA-ONs can be used to introduce a single nucleotide change in a transfected episomal target that results in a switch from blue fluorescent protein (BFP) expression to green fluorescent protein (GFP) expression in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells. This conversion demonstrates for the first time that effective mutagenesis of target genes in mosquito cells can be mediated by LNA-ONs and suggests that this technique may be applicable to mutagenesis of chromosomal targets in vitro and in vivo.

Oligonucleotides can be used to site specifically substitute a single nucleotide of transfected target genes in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells.

ロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションおよび蚊細胞における標的遺伝子の変異

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

カテゴリの検出細菌性病原体のための&quot;生物発光&quot;レポーターファージ

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

ハイブリダイゼーション<em&gt;その場で</em&gt;唾液腺、卵巣、および媒介蚊の胚の

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

蛍光灯<em&gt;その場で</em蚊の分裂期染色体上&gt;ハイブリダイゼーション

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

細菌人工染色体：プラス鎖RNAウイルスの研究のための機能ゲノミクスツール

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV models are limited to hepatoma cell lines (such as HepG2 and Huh7) overexpressing a functional HBV receptor, sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP). Here, we used 293T-NE-3NRs (293T&#160;overexpressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) as model cell lines.&#160;HBV infection in these cell lines was performed either by using concentrated HBV virus particles from HepG2.2.15 or co-culturing HepG2.2.15 with the target cell lines. HBcAg immunofluorescence for HBcAg was performed to confirm HBV infection. The two methods presented here will help us study HBV infection in non-hepatic cell lines.&#160;&#160;

This manuscript describes a detailed protocol for Hepatitis B virus (HBV) infection in novel engineered 293T cells (293T-NE-3NRs, expressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and traditional hepatic cells (HepG2-NE, expressing human NTCP).

非肝細胞293T-NE-3NRs細胞におけるB型肝炎ウイルス感染のモデル化

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, could repress the expression of outer membrane proteins. To further investigate the regulation function of micC in Salmonella Enteritidis, we cloned the micC gene in the Salmonella Enteritidis strain 50336, and then constructed the mutant 50336&#916;micC by the &#955; Red-based recombination system and the complemented mutant 50336&#916;micC/pmicC carrying recombinant plasmid pBR322 expressing micC. qRT-PCR results demonstrated that transcription of ompD in 50336&#916;micC was 1.3-fold higher than that in the wild type strain, while the transcription of ompA and ompC in 50336&#916;micC were 2.2-fold and 3-fold higher than those in the wild type strain. These indicated that micC represses the expression of ompA and ompC. In the following study, the pathogenicity of 50336&#916;micC was detected by both infecting 6-week-old Balb/c mice and 1-day-old chickens. The result showed that the LD50 of the wild type strain 50336, the mutants 50336&#916;micC and 50336&#916;micC/pmicC for 6-week-old Balb/c mice were 12.59 CFU, 5.01 CFU, and 19.95 CFU, respectively. The LD50 of the strains for 1-day-old chickens were 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, and 2.54 x 108 CFU, respectively. It indicated that deletion of micC enhanced virulence of S. Enteritidis in mice and chickens by regulating expression of outer membrane proteins.

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An &#955;-Red-mediated recombination system was used to create a deletion mutant of a small non-coding RNA micC.

ノンコード低分子RNA MicCは、 サルモネラ ・エンテリティディスの外膜タンパク質の病原性に寄与します

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...