この方法は、サルモネラ菌およびシゲラのスクリーニングのためのハイスループットプラットフォームを提供する。この手法の主な利点は、繰り返し、特定、感度、および高スループットです。この技術は、リアルタイムPCRスクリーニングが最初に適用されたNAAT高速法と培養を組み合わせ、次いで細菌培養および同定のために陽性のものを送った。
この方法はサルモネラ菌とシゲラスクリーニングに焦点を当てていますが、ビブリオ、ブドウ球菌、大腸菌、エトセトラなどの他の病原体にも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、サンプル中の背景の植物相のために正しいコロニーの選択が困難であるため、重要である。まず、各サンプルに3ミリリットルの栄養スープを加えます。
その後、サンプルを摂氏36度で6時間インキュベートします。この後、800gsで2分間前濃縮培養を遠心分離する。その後、上清を新しいチューブに移し、12,000gsで5分間再び遠心分離します。
上清を捨て、100マイクロリットルのDNA抽出液をペレットに加えます。その後、チューブを1分間渦を出します。次に、乾燥浴で1,000°Cでサンプルを加熱します。
遠心分離を繰り返した後、上清を新しいチューブに集めます。まず、反応混合物を作成し、テキストプロトコルに従ってサイクリングプログラムを設定します。次に、蛍光リアルタイムPCR機でリアルタイムPCRを実行します。
まず、プレエンリッチメント培養液の100マイクロリットルを5ミリリットルのセレン化結晶培地に添加する。その後、18〜24時間摂氏36度で培養します。次に、培養物のループを1つ集めて、皿に広げます。
その後、18〜24時間摂氏36度でプレートをインキュベートします。インキュベーション後、疑わしいコロニーを選択し、プレートに移します。18~24時間、36°Cでプレートをインキュベートします。
次に、自動化された微生物識別システムを使用して不審なコロニーを識別する。O抗原の特徴付けを開始するには、O抗原多価セラの1滴をきれいなスライドに加えます。コロニーの1つのループをスライドに移し、セラで粉砕します。
細菌が流れる砂のように見える場合は、抗原が特徴になるまでO-抗原一価セラで前処理を繰り返します。H抗原の特徴付けを開始するには、クリーンスライドにH抗原多価セラを1滴加えます。その後、コロニーの1ループを収集し、セラでそれをグリッドします。
特定のH-抗原が特徴になるまで処理を繰り返すためにH-抗原一価セラを使用します。培養を分離するには、濃縮前培養のループを1つ集めてプレートに広げる。その後、18〜24時間摂氏36度で場所をインキュベートします。
インキュベーション後、不審なコロニーをプレートに集めます。17〜24時間摂氏36度でプレートをインキュベートします。次いで、コロニーを、自動化された微生物識別システムを用いて生化学的同定を行う。
次に、シゲラ種の多価セラを一滴ずつきれいなスライドに塗布します。その後、マイクロループを使用して細菌の一部を収集し、セラに粉砕します。最後に、セラが流れる砂に似ている場合は、シゲラ種の一価セラを使用して細菌をさらに特徴付けます。
このプロトコルを用いて、サルモネラ属およびシゲラ種について患者からの便サンプルをスクリーニングした。リアルタイムPCRを用いて、HEXチャネルで増幅が成功し、サンプルがサルモネラ菌種に陽性であることを示した。さらにリアルタイムPCRは、サンプル2がサルモネラ菌に陽性であり、導かれたサルモネラ種培養に選ばれたことを示した。
サルモネラ属の誘導培養では、ピンクと紫のコロニーを別々にめっきし、生化学的同定を行った。結果は、サンプル2からのコロニーがサルモネラパラチファイB.を用いてリアルタイムPCRを用いて、FAMチャネルで増幅に成功したことを示し、試料がシゲラ種に陽性であることを示した。さらにリアルタイムPCRは、サンプル10がシゲラに陽性であり、誘導培養のために選ばれたことを示した。
シゲラ種の誘導培養では、ピンクレッドと無色のコロニーを別々にめっきし、生化学的同定を行った。結果は、サンプル10にシゲラ・ソネイ第II相細菌が含まれていることを示した。この手順を試みる際には、シーケンスのバリエーションによるメソッドの制限を覚えておくことが重要です。
この手順に従うと、直接培養などの他の方法を実行して、偽陰性のリアルタイム PCR 結果を回避できます。この技術は、新しいプロトコルが正の速度を2倍に増加させ、作業負荷とTATを大幅に減少させる可能性があるため、サルモネラおよびシゲラ検出の分野の研究者に道を開きます。サルモネラ菌とシゲラでの作業は非常に危険であり、個人的な保護具PPEは、この手順を実行しながら常に取られるべきであることを忘れないでください。
