私たちは、施設やイオンチャネルの研究のための優れた環境をご提供するための生理学と膜生物学、カリフォルニア大学デ​​ービス校の学科に感謝しています。

1。一休みするヒトTリンパ球の調製<ol><li> RosetteSepヒトT細胞の濃縮カクテルとRosetteSep密度培地を用いて、製造元の指示に従って、人間の血液サンプルからT細胞を精製する。結果として得られる細胞集団は95％CD3 +安静時のT細胞が含まれている必要があります。私たちは、カリフォルニア大学デ​​ービス校の内部審査委員会によって承認されたプロトコールに従って健康なボランティアから採取した末梢血サンプルからのヒトTリンパ球を精製する。 </li><li>単離後、10％ウシ胎児血清、2％グルタミン- I、1％RPMI 1640を添加した、グルタミンおよびHEPESを含むRPMI - 1640培地を含む細胞培養培地中で0.5 × 10 6細胞/ mLの密度で休んでT細胞を再懸濁ビタミンソリューション、1％RPMI 1640アミノ酸液、1％ピルビン酸ナトリウム、および0.03％β-メルカプトエタノール。 </li><li>場所細胞の細胞培養フラスコにサスペンション、°加湿インキュベーター中、5％CO 2で、最大24時間の前に実験に、37で維持する。 </li></ol> 2。記録チャンバーの準備<ol><li>以下は、録音室を準備するために必要とされる。）シリコンO -リング、b）のラウンドは、25mmの製造元の指示に従って調製Sylgard184を混ぜ、70％エタノールおよび蒸留H 2 Oで洗浄カバーグラス、C）、、およびd） 2つの60 X 15ミリメートルのペトリ皿。 </li><li>場所〜60x15 mmのシャーレに混合Sylgard184 0.5 mLの。 </li><li> Sylgard184使用して鉗子にO -リングの底部を浸します。 </li><li>このような別のペトリ皿のような清浄表面上にO -リングを配置することにより、O -リングの縁から過剰Sylgard184を削除します。 </li><li>カバースリップの上にリングを置き、それを押してください。 </li><li> 85℃40〜60分間、またはSylgard184まで、Cが重合されている時にチャンバーを加熱することによってSylgard184を治す。 </li><li>無塵容器に録音室に保管してください。 </li></ol> 3。パッチピペットの準備<ol><li>実験日に、ガラスキャピラリーやピペットプラーを使用して〜2μmの先端径でピペットを引き出します。私たちは、フィラメント（：1.5 mmとID：1.10 mm外径）とホウケイ酸塩チューブを使用してください。ほこりのない場所で保管してピペット。 </li><li>標準的な手順9に従ってSylgard184またはHIPEC R6101の半導体保護コーティング、とコートは、ピペットチップ。 </li><li>静かに実験前にピペットを火 - ポーランド語。 </li></ol> 4。パッチクランプのセットアップの準備<ol><li>あなたのパッチクランプアンプを制御するソフトウェアでgigaseal形成のためのマクロを設定し、保存します。我々は、Windows XPやデータ取得用のパルスソフトウェアでサポートされているEPC - 10アンプを使用してください。我々は、EPC - 10マニュアルによると、&quot;オンセル&quot;、および&quot;細胞全体の&quot;マクロ&quot;をセットアップ&quot;を設定し、すべての実験のためにそれらを使用してください。 </li><li>前の実験にお風呂のソリューションと、表1に記載されているピペットのソリューションを用意し、最大1週間は4℃で保管します。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td>化学物質</td><td colspan="3">バスソリューション（MM） </td><td>ピペットソリューションズ（MM） </td></tr><tr><td></td><td>第1位</td><td> ＃2 </td><td>第3位</td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3のNa </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td>のCa（OH）2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2の </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4を </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> CS -spartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> 表1。全細胞CARC現在のレコーディングのためのソリューション。 すべての化学物質はSigma - Aldrich、セントルイス、MOから購入した。 <ol start="3"><li>パッチピペット溶液及び各浴溶液10との間の液体接合のポテンシャル（LJ）を決定します。あなたの集録ソフトウェアを使用して適切な場所にLJの値を保存します。例えば、パルスのプログラムで&quot;アンプ&quot;ウィンドウで&quot;LJ&quot;の制御にLJの値を挿入します。 </li><li>実験前に買収のソフトウェアの適切な場所で、図1に示すように、刺激プロトコルを、構成し、保存します。パルスのプログラムでは、我々は&quot;パルス生成&quot;ウィンドウで、買収のプロトコルを設定します。 <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 2の（5 - - 0.5 Hz）の刺激のプロトコルは、-120から持続時間50ミリ秒の100 mVまでの電圧ランプはすべての0.2に適用されます。ランプの間に保持電位（V H）が 30 mVに保持されます。 </li></ol> 5。顕微鏡ステージ上に取り付けセル<ol><li>細胞を播種前にして〜20分と洗浄H 2 Oとし、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を持つためのポリ- L -リジンでコーティング録音室を。 </li><li> 37℃で20分間チャンバー内でインキュベート中に0.2〜0.5 × 10 6個の細胞を含む細胞懸濁液のプレート500μL℃に</li><li>チャンバーのホルダーに付着した細胞と録音室を確保する。我々は、ベースはカバースリップの上に対して上部軽く押したまま、カバーの底部をサポートするカスタムメイドのチャンバーのホルダーを、使用してください。 </li><li>倒立顕微鏡のステージ上のチャンバホルダーを置きます。 </li><li>透過光で細胞に焦点を当てる。我々は、40X油浸対物レンズを使用。 </li><li>浴中にAg / AgCl参照電極を置きます。 </li><li> multibarrel、重力駆動型の灌流システムを合わせます。流入管の先端が視野にカバースリップの近くに45 °の角度で配置する必要があります。 </li><li>流入管の先端に吸引管の​​反対側に置きます。 </li><li>でチャンバーを灌流リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはHBSSは、細胞培養培地とゆるく付着した細胞を洗い流す。 </li></ol> 6。 CRACチャネル電流の記録<ol><li>しっかりとカバースリップに接続されているセルを見つける。我々は一般的に滑らかな外表面を持つ平均的なサイズの、円形セルを選択します。 </li><li> 3mMのMg 2 +の含有浴溶液SERCAポンプをブロックするために8〜10分間0.5から1μMのタプシガルギンを含む第1位（表1）、+ -遊離Ca 2録音室を灌流。我々は、前のgigaseal形成へのストアを枯渇させるために、この手順を実行します。 </li><li>エッペンドルフmicroloaderとP - 20変位のピペットを使用して、ピペット溶液（表1）でパッチピペットを記入し、アンプのヘッドステージ上にピペットホルダーにパッチピペットを挿入する。 のCa 2 +キレート剤BAPTAは、受動的に店舗を破壊すると+ -依存性のCRACチャネルの不活性化のCa 2を減らすためにピペット溶液に含まれています。 </li><li>パッチピペット内の風呂に入る前に、正圧（H 2 Oの〜3インチ）の少量を適用します。我々は、パッチピペット内部に、正または負圧を作成するための圧縮空気と真空ラインに接続されたカスタムメイドの圧力吸引装置を使用してください。 </li><li>顕微鏡を介して視覚的なコントロール下でバスにパッチピペットを下げます。 &quot;オシロスコープ&quot;ウィンドウでは、ピペットを流れる電流が表示されるはずです。電流振幅のステップ状の変化がプリセットマクロによって適用される小振幅の電圧パルス（試験パルス）によって誘発されるべきである。この時点では、ピペットの抵抗の値を決定することができるはずです。私たちのピペットの抵抗は、通常、MΩ5月6日です。 </li><li>ピペットと参照電極間に生成された&quot;オフセット&quot;の可能性を修正してください。 </li><li>それは細胞膜に触れるまで、顕微鏡を介して視覚的制御の下で、近い細胞にピペットの先端をもたらす。 </li><li>パッチピペット内部の負圧（H 2 Oの20〜40インチ）を適用します。 </li><li> &quot;オシロスコープ&quot;ウィンドウでgigaseal形成を監視します。あなたは、テストパルス、減少し、&gt; 5GΩにピペット抵抗の値が増加することによって誘導される電流の振幅を、表示されます。 FE以内gigasealフォームwの数秒が、それは安定したgigasealを達成するために1〜2分かかる場合があります。 </li><li>ピペット容量（&quot;C -ファースト&quot;）を補償する。 </li><li> 20ccの注射器を使用して追加の負圧を適用してパッチ膜を破る。 </li><li> 30 mVに保持電位を設定します。正の保持電位は、カルシウム依存CRACチャネルの不活性化を防ぐことができます。 </li><li>細胞の膜容量（&quot;C -遅い&quot;）を補償C -遅いの値を保存または記録する。 </li><li>アクセス抵抗&quot;R s&quot;の値を確認してください。我々の実験では、R sは 、通常、MΩ70から20までです。 </li><li>のCa 2 0.5 Hzの周波数（図1）+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1の電圧ランプのシリーズを適用し始める。 Mg 2 +のためのCRACチャネルの低透過性のために&quot;リーク&quot;現在と比較してこのソリューションでは、CRAC電流は無視できるほど小さいです。 &quot;漏れ&quot;電流のように将来の分析で浴溶液​​＃1に記録されている現在のトレースを保存して使用してください。 -100 mVで&quot;リーク&quot;電流の絶対振幅は、以下または5 pAのと同じである必要があります。セルが&quot;漏れ&quot;の場合は、新しいパッチピペットと新しいセルを使用する場合に比べて実験してスタートを停止する。 </li><li> CRACチャネル（I のCa - CRAC）経由でのCa 2 +電流を記録するには、 潅流バルブを切り替えることで20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2（表1）でのCa 2 + -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1を交換してください。これは、Ca 2 +のCRACチャネルを経由してフローすることを可能にし、内向き電流を生成する。 &quot;オシロスコープ&quot;ウィンドウでは、内側に私のCa - CRAC（図2）整流の開発が表示されます。負電圧での電流の振幅は、CRAC電流のCa 2 +依存性増強のために約1分間増加していきます。 </li><li>一過性のNa + CRACチャネルを介して電流を記録するために必要な5 Hzの、の電圧ランプの刺激の頻度を増加させる。 </li><li> Na +の含有二価カチオンを含まない灌流バルブを切り替えることにより、ソリューション＃3（表1）と20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2を交換してください。 &quot;オシロスコープ&quot;ウィンドウでは、内向きのNa + CRACチャネル（;図2 I のNa - CRAC）を介して電流整流大きな振幅の過渡的な開発が表示されます。 </li><li>一つは、現在の&quot;リーク&quot;を記録するために実験の終了時に1から5μMラ3 +を含む20mMのCa 2 +含有浴溶液＃2を適用される場合があります。しかし、我々は時間をかけて&quot;リーク&quot;電流が変化するため、このアプローチが有用見つけることができませんでしたし、それは実験の終了時に大きくまたは小さくなる場合があります。私たちは、&quot;リ ​​ーク&quot;現在として実験の開始時に現在のCa 2で記録した+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1を取ることを好む。 </li><li>さらに分析するために記録された現在のトレースを保存します。 </li></ol> 7。データ解析<ol><li>解析ソフトウェアに保存されている現在のレコードを取得。我々は分析のためにパルスプログラムを使用してください。 </li><li>初めに、電圧ランプの終わりに現在の振幅を測定します。我々は、通常、-100 mVで、パルスプログラムの&quot;オシロスコープ&quot;ウィンドウ内のカーソルのペアを使用して100 mVでの電流振幅を測定する。 </li><li>さらに分析およびグラフィカルなプレゼンテーションのためのグラフィックプログラムに現在の振幅の値をエクスポートします。我々は、Origin科学グラフと解析ソフトウェア、バージョン7を使用してください。 </li></ol> 8。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。安静時のヒトT細胞におけるCRAC電流。（）、-100 mVの（黒丸）と+100 mVの（白丸）でのホールセル電圧クランプ構成で記録されたCRAC電流の時間経過。 gigaseal形成に先立って、細胞を、Ca 2年〜10分間プレインキュベーションした+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液、0.5μMのタプシガルギンを含む第1位。ブレークイン後、お風呂のソリューションは、順番に次のように適用されました：のCa 2 + -フリー3mMののMg 2のCa 2 +含有浴溶液＃2 20 mMのそれに続く+含有浴溶液＃1（0のCa + 3mg）を、 （20 Ca）の、浴溶液＃2（20 Ca）のに続いて二価カチオンを含まない浴溶液＃3（DVF）、続いて。セルは、図1に示すように電圧ランプのシリーズで刺激した。ランプの周波数は、浴溶液＃3（DVF）とすべての他のソリューションでは0.5 Hzで5Hzのだ。 20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2とDVFの浴溶液＃3の私のNa - CRACの高速過渡開発のアプリケーションの後に私のCa - CRACの遅い開発に注意してください。 （B）、代表、現在のトレースは、+ -フリー3mMのMg 2 +を含有浴溶液＃1（のCa 2に電圧ランプの間に記録さ&quot;リーク&quot;）、20mMのCa 2 +の含有浴溶液＃2（20 Ca）の、そして浴溶液＃3（DVF）。 （C、D）、私のCa - CRAC（C）と私のNa - CRAC（D）の電流-電圧の関係は、20mMの電圧ランプ中のCa 2 +含有お風呂に記録された電流から&quot;リーク&quot;電流を差し引いたパネル（B）に示すように解第2位（20 Ca）の、そして浴溶液＃3（DVF）。

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	<li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+CRAC+channels:+function+in+health+and+disease.">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRAC+channelopathies.">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li><li>Lewis, R. S., Cahalan, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2++and+transmembrane+Ca2++current+in+human+leukemic+T+cells.">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li><li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+(ICRAC)+due+to+local+calcium+feedback.">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li><li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms.">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li><li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes.">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li><li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2+-inhibited+cation+(MIC)+channels.">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li><li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca(2+)+release-activated+Ca(2+)+(CRAC)+channels+in+human+T+cells.">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments.">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

これらの細胞中の内因性CRAC電流振幅が小さいセルサイズ（安静時のヒトT細胞の直径は5〜8μmの範囲にある）のために小さいため、ヒトT細胞の休止のCRAC電流の電気生理学的研究は困難な作業です。ここで、我々は確実に末梢血単核細胞から単離されたヒトTリンパ球を休んでCRAC電流を記録するためにステップバイステップの手順を示します。この技術は、私たちはより良い正常および病的な?...

<table><tbody><tr><td>RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Density Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100X solution)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 vitamin solution (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>1640 amino acids solution (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Inositol trisphosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Lanthanum Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>EPC 10 patch clamp amplifier with headstage</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator </td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Windows Computer</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulse software</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin Scientific Graphing and Analysis Software</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch pipette puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Narashige&amp;rsquo;s Microforge</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Silicon O-rings </td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 25 mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell recording of calcium release-activated calcium (crac) currents in human t lymphocytes

Tリンパ球で、細胞内Ca 2 +ストアからのCa 2 +枯渇は、カルシウムのリリース-活性化カルシウム（CRAC）チャネルと呼ばれる細胞膜のCa 2 +チャネルの活性化につながる。 CRACチャネルは、T細胞の増殖と遺伝子発現の調節において重要な役割を果たしている。 T細胞の異常なCRACチャネル機能は、重症複合免疫不全や自己免疫疾患1、2にリンクされています。ヒトT細胞のCRACチャネルの機能を研究することは正常な免疫反応を調節する新たな分子メカニズムを明らかにし、関連するヒト疾患の原因を解明することができる。膜電流の電気生理学的記録は、機能的なチャネルのプロパティとその規制の最も正確な評価を行うこと。 Jurkat T細胞、ヒト白血病T細胞株、のCRACチャネル電流の電気生理学的評価が最初に20年以上前に3を実行された、しかし、正常なヒトT細胞におけるCRAC電流測定は困難な課題である。正常T細胞でCRACチャネル電流を記録するの難しさは、血液由来のTリンパ球は、Jurkat T細胞よりもはるかに小さいサイズと、従って、内因性の細胞全体のCRAC電流は振幅が非常に低いものであるという事実によって悪化されています。ここで、我々は日常的に健康なボランティアの末梢血から単離されたヒトT細胞の休止のCRACチャネル経由でのCa 2 +又はNa +電流を記録するために使用するステップバイステップの手順を与える。ここで説明する方法は、Jurkat T細胞および活性化ヒトT細胞4-8にCRAC電流を記録するために使用される手続きから導入されました。

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Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

我々は、末梢血単核細胞由来のヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流の全細胞パッチクランプ記録のためのステップバイステップのプロトコルを提供しています。

ヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流のホールセル記録

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

whole-cell-recording-calcium-release-activated-calcium-crac-currents

Research

JoVE Journal

Biology

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

16.0K ビュー.  University of California, Davis. 我々は、末梢血単核細胞由来のヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流の全細胞パッチクランプ記録のためのステップバイステップのプロトコルを提供しています。

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Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

神経科学

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

生物学

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to assess calcium signaling by band-pass flow cytometry. This protocol is designed to measure calcium responses in primary murine T-cells using full spectrum flow cytometry. Total splenocytes are labeled with the ratiometric calcium indicator dye Indo-1, along with a panel of fluorochrome-conjugated antibodies to cell surface molecules. Leveraging the capabilities of full spectrum flow cytometry provides a platform for utilizing a wide array of cell surface stains in combination with Indo-1. Cells are then analyzed in real-time at 37 &#176;C before and after the addition of an anti-CD3 antibody to stimulate the T-cell receptor. After unmixing the spectral signals, the ratio of calcium-bound to calcium-free Indo-1 is calculated and can be visualized over time for each gated population of splenocytes. This technique can allow for the simultaneous analysis of calcium responses in multiple cell populations.

Calcium influx, a measure of T-cell signaling, is an effective way to analyze responses to T-cell receptor stimulation. This protocol for multiplexing Indo-1 with panels of antibodies directed at cell surface molecules takes advantage of the highly flexible capabilities of full spectrum flow cytometry.

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

免疫・感染学

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

<meta charset="utf8"></head><body>T細胞中のCa2+ マイクロドメインを検出するための高分解能イメージング技術

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:治療介入のための適応免疫応答の初期活性化の解明

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

初代T細胞における初期Ca2+ マイクロドメインのイメージング

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

医学

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety assessment models is a critical step during drug development. Currently, cardiac safety assessment is still highly dependent on animal studies. However, animal models are plagued by poor translational specificity to humans due to species-specific differences, particularly in terms of cardiac electrophysiological characteristics. Thus, there is an urgent need to develop a reliable, efficient, and human-based model for preclinical cardiac safety assessment. Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as an invaluable in vitro model for drug-induced cardiotoxicity screening and disease modeling. hiPSC-CMs can be obtained from individuals with diverse genetic backgrounds and various diseased conditions, making them an ideal surrogate to assess drug-induced cardiotoxicity individually. Therefore, methodologies to comprehensively investigate the functional characteristics of hiPSC-CMs need to be established. In this protocol, we detail various functional assays that can be assessed on hiPSC-CMs, including the measurement of contractility, field potential, action potential, and calcium handling. Overall, the incorporation of hiPSC-CMs into preclinical cardiac safety assessment has the potential to revolutionize drug development.

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as a promising in vitro model for drug-induced cardiotoxicity screening and disease modeling. Here, we detail a protocol for measuring the contractility and electrophysiology of hiPSC-CMs.

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

<meta charset="utf8"></head><body>チャネル活性化研究のためのシングルセルカルシウムイメージング

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and chemicals et al. It primarily relies on microscopy imaging technology and the related Ca2+ indicator Fura-2/AM (AM is the abbreviation for Acetoxymethyl ester). Inside the cells, Fura-2/AM is hydrolyzed by esterases into Fura-2, which can reversibly bind with free cytoplasmic Ca2+. The maximum excitation wavelength shifts from 380nm to 340nm (when saturated with Ca2+) upon binding. The emitted fluorescence intensity is quantitatively related to the concentration of bound Ca2+. By measuring the 340/380 ratio, the Ca2+ concentration in the cytoplasm can be determined, eliminating errors caused by variations in the loading efficiency of the fluorescent probe among different samples. This technology allows for real-time, quantitative, and simultaneous monitoring of Ca2+ changes in multiple cells. The results are stored in &#8220;.XLSX&#8221; format for subsequent analysis, which is fast and generates intuitive change curves, greatly improving the detection efficiency. From different experimental perspectives, this article lists the use of this technology to detect Ca2+ signals in cells with endogenous or overexpressed channel proteins. Meantime, different methods for activating cells were also showed and compared. The aim is to provide readers with a clearer understanding of the usage and applications of single cell Ca2+ imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

This article presents a method for real-time, quantitative monitoring of calcium ion (Ca2+) concentrations in cells using single-cell Ca2+ imaging with the Fura-2/AM dye. This technique enables efficient dye loading and accurate calculation of Ca2+ levels through fluorescence intensity ratios, making it a simple and rapid approach for research applications.

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

ヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流のホールセル記録

要約

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同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

イメージングローカルCA

初代T細胞における初期Ca²⁺ マイクロドメインのイメージング

初代T細胞における初期Ca²⁺ マイクロドメインのイメージング

初代T細胞における初期Ca²⁺ マイクロドメインのイメージング

内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング