This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

私たちは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞におけるローカルのCa 2+イベントを画像化するための詳細な手順を提示する。これらの手順は、多くの細胞型8-10画像内Ca 2+シグナルに適合させることができる。 細胞の調製<ol><li>培養細胞は、その供給者のウェブサイトに掲載されている指示に従って撮像される。 </li><li>画像化の前の数日間は、収穫細胞を1mlの0.25％トリプシン/ EDTA（2-3分）を用いて組織培養フラスコ中で増殖させた。剥離後、トリプシンを不活性化するために培養培地の等量を加える。 </li><li>皿あたり3-7×10 4細胞の密度でガラスボトムイメージング皿に血球計および種子細胞を用いて細胞カウントを行う。彼らは60％コンフルエンス（2-3日）に達するときイメージング実験のためのセルを選択します。 </li></ol>ソリューションおよび試薬の調製<ol><li>バッファリングされたCa 2+含有HEPESを準備（ミリモル）からなる塩溶液（Ca 2+の-HBSS）：135のNaCl、5.4のKCl、2のCaCl 2、1のMgCl 2、10 HEPES、および10グルコース。でpH = 7.4 NaOHで室温（RT）にて。 4℃でのグルコースや店舗の添加なしのCa 2+ -HBSSを準備します。使用直前に液にグルコースを追加します。 </li><li>蛍光のCa 2+指示薬カル-520（1 mm）で膜透過性のフォームを可溶化、CI-IP 3（200μM）、およびEGTA 20％のプルロニックF-127を含むジメチルスルホキシド（100 mM）を（DMSO）。 -20℃で、湿気や遮光エッペンドルフチュー​​ブとストアにこれらの試薬を分注し。 </li></ol> 3.読み込んで細胞膜透過性、カル- 520 CI-IP 3およびEGTA <ol><li>のCa 2+ -HBSSに、それぞれ、5および1μMの最終濃度になるように膜透過性カル-520及びCI-IP 3のストック溶液を希釈することにより、「ローディングバッファー」を準備します。 </li><li>吸引したCultureメディアとは、Ca 2+ -HBSS 3回メディアを交換することによって、細胞をリンス。 </li><li>のCa 2+ -HBSSを取り外して、暗闇の中で、室温で60分間ローディングバッファーで細胞を培養する。 </li><li>ローディングバッファーを除去し、Ca 2+の-HBSS 3回メディアを交換することによって、細胞をリンス。 <ol><li>必要であれば、この段階で、その後負荷のCa 2+ -HBSSで5μMの最終濃度に原液を希釈することによってEGTA / AMを持つ細胞とは、暗闇の中で、室温で30〜60分間細胞をインキュベート。このインキュベーションの後、3.5のステップに進む前に、Ca 2+の-HBSSで細胞を3回すすいでください。 </li></ol></li><li>ロードされた試薬の脱エステル化を可能にするために30分間のCa 2+ -HBSSで細胞を培養する。 </li><li>イメージングの直前に、最終インキュベーション中に風呂に漏れた可能性のある染料を除去するために、「新鮮な」のCa 2+ -HBSSでのCa 2+ -HBSSを交換してください。 </li></ol> 4.のCa 2+ </sup&gt;画像取得<ol><li> 100X APO TIRF目標（NA 1.49）上に浸漬油の小滴を置きます。 </li><li>倒立顕微鏡のステージ上での結像の皿をマウントし、透過光を用いて、焦点に細胞をもたらす。なお、記録時の移動を防止するために、撮像皿を確保することが重要である。 </li><li>高速EMCCDカメラを使用して発せられる蛍光（λ&gt; 510 nm）をカル-520を励起し、収集するために、488nmレーザーで細胞を照らす。 注：顕微鏡を操作するソフトウェアパッケージは、ユーザが、レーザビームのいずれか（「WF」励起用）より中央または（TIRF励起用）は、対物背面開口部の極端なエッジで導入されることを可能にする集束レンズを翻訳することができる。 </li><li> EMCCDソフトウェアを使用して、ローカルのCa 2+のイベントをキャプチャするために必要な時間分解能でデータを収集するために、完全な512×512画素からの撮像視野を減らす。 注：たとえば、中央クワッド256×256ピクセルの買収は、66 fpsに取得率を高速化します。さらに、単離されたクロップ·モード機能を使用して500 fpsにEMCCDカメラのフレームレートを増加させることも可能である。 </li><li>自動的に、ベースラインアクティビティの数秒を記録し、細胞に紫外線フラッシュを提供し、別の10〜30秒の記録を継続してソフトウェアを設定します。 NOTE：UVフラッシュ、顕微鏡の背面ポートにおける反射ダイクロイックミラーUVを通して導入キセノンアーク光源を用いて送達される。 UVフラッシュの持続時間と強度は、地元のCa 2+イベントの所望の周波数を呼び起こすために経験的に調整されている。 </li><li>オフライン分析のための画像スタックなどのファイルに保存する。 </li></ol> 5.自動化のCa 2+画像解析注：これは、表示プロセスと多くの商用ソフトウェアパッケージを使用して、キャプチャしたデータを分析することが可能である。しかし、我々は急速に識別ANを自動化するためのアルゴリズムを開発した地元のCa 2+シグナルのd分析。このアルゴリズムで使用される空間的および時間的フィルタの詳細な説明は、ΔF/ F 0と識別/分析ルーチンの発生が11に見出すことができる。このアルゴリズムは、オープンソースソフトウェアプラットフォームのPythonで実行するために開発された、対応する著者（ismith@uci.edu）を電子メールで送信することにより、一緒にサンプル実験データと詳細な取扱説明書を得ることができる。 <ol><li>マルチプレーン.TIFFファイル形式にカスタム書かれたアルゴリズムにインポートするファイルを変換します。 </li><li>解析アルゴリズムを含むフォルダを見つけてダブルRUN.EXEをクリックします。 </li><li>分析されるべき.TIFFファイルを選択します。 </li><li> [開く]ダイアログボックスの[解析パラメータを選択してください。サンプルデータのデフォルトのパラメータについて、図2Aを参照のこと。 </li><li> nとし、視野の部分にカーソルを移動させるのいずれかによって画像スタックからオフセットされる黒レベルを決定する細胞が含まれている（ 図2Bを参照）、または手動で「セットブラックレベル」プロンプトを使用して黒レベルを入力することにより、OT。 </li><li>ソフトウェアによる分析（ 図2C-F）以下の画面上に4つのウィンドウを観察します。 Cは、分析された細胞からの蛍光を安静時のモノクロ画像である。この画像に重畳白い四角はイベントに備えた2次元ガウス関数の重心位置として決定し、イベントの場所である。 </li><li>各イベントの場所をクリックするか、イベント間のサイクルにカーソルキーを押してください。そのようにこれらの各サイトでのバックグラウンドを差し引い、ガウシアン平滑化蛍光比の変化（ΔF/ F 0）を実行するとウィンドウDに更新する メモ：Redイベントが隣接する部位に局在活動から「ブリードスルー」からその特定のサイトから発信していないと判断された強調した。選択された部位での蛍光シグナルの検出を超えた場合に低い青のトレースを示ししきい値は、黒い線のに対し、（イベントを強調し赤に相当する）、その特定のサイトから発信するイベントを識別します。 </li><li>赤をクリックしてイベントの時間発展を表示するウィンドウのE、およびイベントの空間プロファイルが一緒にフィットガウス関数の空間プロファイルで、その時間経過にわたって平均化され表示されたウィンドウFを更新するためにイベントを強調した。 </li><li>手動での成果物は、分析から除外することができるように特定されたイベントを確認します。右の赤いをクリックして、このようなイベントを削除するには、イベントを強調した。 注：我々の手では、単一のIP 3 Rチャネルを通じたCa 2+フラックスは約0.11ΔF/ F 0で信号を連想させるので、これは偽陽性である可能性が高いよりも、任意の検出された「イベント」かなり小さい。 </li><li>目的の細胞の周りに描画し、「保存CellRを選択することで、セルごとに、またはエクスポートデータ」をExcelに保存」を選択してデータをエクスポート17 ;. 注：データは元の画像スタックと同じフォルダに保存されます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. 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S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

私たちはここに記述し、蛍光Ca 2+の指標を用いて培養された哺乳動物細胞中で地元のCa 2+イベントを画像化するためのプロトコル。さらに、我々は、取得したデータの識別および分析を自動化する直感的なユーザーインターフェースでアルゴリズムを記述する。ここで説明する手順は、蛍光Ca 2+のインジケーターカル-520が、例えば、Fluo-3、Fluo-4のような他の多くのCa <su...

カルシウムイオン（Ca 2+が ）普遍的に遺伝子発現、分泌およびシナプス可塑性1における長期的な変化を含む、生物学的プロセスの多様な範囲を調節。 Ca 2+のような多様な方法で行動できるような一つの方法は、Ca 2+の異なる空間的·時間的パターンを介して行われ、細胞が生成することができます通知します。細胞質ゾルの例グローバル標高平滑筋組織2のに対し、小さい内の[Ca 2+]トリガー収縮、ローカライズされた一過性の上昇（ローカルのCa 2+のミクロドメイン）の場合は学習と記憶3に不可欠な遺伝子発現を刺激する。 無料のサイトゾルは、の[Ca 2+]静止時〜100 nmで維持されるが、急速に細胞膜内とすることにより位置のCa 2+透過性イオンチャネルを通じて細胞質ゾルへのCa 2+の流入、以下のいくつかのマイクロモル濃度に上昇することができます細胞内sからのCa 2+の遊離tores。私たちの研究室では、小胞体（ER）膜に存在するのCa 2+放出チャネルを形成する、イノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP 3 R）に焦点を当てています。受容体のサイトを活性化、細胞質ゾルに両方のIP 3およびCa 2+が結合すると、IP 3 Rチャンネルは、Ca 2+が ER内腔内に隔離遊離するために開きます。 Ca 2+の放出が空間的に（Ca 2+のパフ4）のCa 2+のローカルサイトゾルのミクロドメインを生成するために、IP 3 Rの小さなクラスタに制限されたままであってもよいか、IP 3 Rの隣のクラスタの近接度に応じて、かもしれないのCa 2+誘導性のCa 2+ -放出（CICR）5,6のプロセスを介して複数のパフサイトを補充することによって、細胞全体に伝播。 高度な顕微鏡imagiと相まってツィン7ロジャーによって開発された蛍光小分子のCa 2+指示色素の導入、技術ngを、大幅のCa 2+シグナル伝達の我々の理解を促進してきた。顕微鏡検査のために使用されるカメラの最近の進歩は今そのような前例のない空間および時間分解能でパフなどの一時ローカルのCa 2+イベントを撮像することができます。現在利用可能なEMCCDカメラは、&gt; 500フレーム秒-1数（fps）と相補型金属酸化物半導体の新世代で128×128画素の画像化を可能にする（CMOS）カメラは、わずかに高い犠牲にしてより高い画素解像度、さらに速い速度を提供ノイズレベル。全反射（TIRF）顕微鏡法と併せて、画像を参照する単一のCa 2+チャネルイベント8,9可能である。実行不可能な手動処理、視覚的識別および分析をレンダリングし、自動化されたアルゴリズムの開発に責任を置く大規模なデータセット（毎分約 1Gビット）を発生しながら、このアプローチは、同時にチャネル/イベント数百の画像化を可能にする。 2+指標を用いて、無傷の哺乳動物細胞でのローカルのCa 2+シグナルを画像化するための手順およびプロトコルを提示する。今後は、TIRF、従来の広視野落射蛍光（WF）顕微鏡の両方によって画像化ローカルのCa 2+イベントの識別と分析を自動化し、オープンソース環境Pythonで開発したアルゴリズムを実証する。我々はIPのCa 2+シグナルをと生成さ3のコンテキストでこれらのアプローチを説明したが、彼 ​​らはの[Ca 2+]のCa様々ないずれかの表面に位置2+透過性イオンチャネルを発散する細胞質ゾルの局所的な変化を研究するために容易に適している膜または細胞内小器官8-10。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1055">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:813px;">Name</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue No.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2266</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cal-520/AM</td>
			<td>AAT Bioquest Inc.</td>
			<td>21130</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)</td>
			<td>SiChem</td>
			<td>cag-iso-2-145-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO/20% pluronic F127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-3000MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA/AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E-1219</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm glass-bottom imaging dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35-1.5-14-C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

細胞質ゾルのCa 2+イオンは、広範囲の遺伝子転写、電気的興奮性細胞増殖のようなプロセスを制御する、ほ ​​ぼすべての細胞型における細胞活性の多くの側面を調節する。のCa 2+シグナル伝達の多様性と特異性は、地元の過渡のCa 2+マイクロドメイン分の期間にわたって発生する細胞全体の振動と波に至るまでのCa 2+シグナルは、異なる時間と空間スケールの上に行動するために生成されるメカニズムから派生（Ca 2+のパフ）持続的なミリ秒。電子の最近の進歩は、CCD（EMCCD）カメラは今&gt; 500フレーム秒-1（FPS）のレートで128×128ピクセル空間分解能で地元のCa 2+シグナルの画像化を可能に掛けた。このアプローチは、高度に並列であり、単一の実験でチャンネルやパフサイトの何百もの同時モニタリングを可能にします。しかし、膨大な量のデータが生成された（ 約 ​​1 GBのPER分）実行不可能なローカルのCa 2+のイベントの視覚的な識別と分析をレンダリングします。ここでは説明し、取得、検出のための方法が示され、かつ広視野落射蛍光（WF）と全反射の両方を使用したCa 2+指標を搭載し、無傷の哺乳動物細胞内でのCa 2+シグナルを媒介3ローカルIPの分析蛍光（TIRF）顕微鏡。さらに、我々は、これらのローカルのCa 2+シグナルの同定および分析を自動化するオープンソースのソフトウェア環境のPythonの中で開発したアルゴリズムを記述します。アルゴリズムは、サブピクセル解像度でのCa 2+放出の部位を局在化する。データのユーザーレビューを可能にする。エクセル互換テーブルの振幅および動力学的データと共に蛍光比信号の時間系列を出力する。

図1Aはまた、ciは、IP 3を装填したヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞におけるカル-520蛍光休止のWF画像を示す。フォト·リリースに100ミリ秒のUVフラッシュへのこれらの細胞の曝露は、I-IP 3は、（ 図1Aに白丸で示される）別個の部位での一過性のCa 2+パフを誘発した。これらの部 ​​位で測定された蛍光トレースはゆっくりとリリースサ?...

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Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

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Research

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Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K ビュー.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.