このプロトコルにより、研究者は初代T細胞のカルシウム応答を同時に測定し、それらのサブセットと表面表現型を評価することができます。この技術の主な利点は、カルシウム応答を調べる前に細胞の特定のサブセットを単離する必要がないことです。はじめに、50マイクログラムのインド1 AMを含むバイアルに50マイクロリットルのDMSOを加えることにより、インド-1 AMの1マイクロリットルあたり1マイクログラムのストック溶液を調製します。ストック溶液を適切な量のcRPMIとミリリットルあたり6マイクログラムの濃度に希釈します。
培地を摂氏37度の水浴に入れる。次に、この培地を使用して、事前に調製した細胞懸濁液を1対1の比率で希釈し、1ミリリットルあたり5〜600万個の細胞を取得します。次に、12穴組織培養プレートに、実験条件ごとに1ウェルあたり1ミリリットルの細胞懸濁液を添加する。
Indo-1色素を負荷した細胞にEGTAを添加することにより、カルシウムフリーのIndo-1の単一染色対照サンプルを調製します。蛍光色素やIndo-1色素を含まない生物学的陰性対照用のウェルを準備します。フローサイトメーターで色素を装填した細胞懸濁液に50マイクロモルの濃度でイオノマイシンを添加することにより、Indo-1ポジティブコントロールを調製します。
また、抗体結合蛍光色素を使用して、追加の細胞集団のための単一染色コントロール用のウェルを調製します。次に、100万細胞あたり2マイクログラムのFC受容体遮断抗体を追加し、15分ごとにタップしてプレートを45分間インキュベートし、細胞を再懸濁します。インキュベーション後、プレートから全容量の細胞を混合して取り出し、それを1.7ミリリットルの微量遠心チューブに加える。
遠心分離機で上清をデカントする。細胞を1ミリリットルの予め温めたcRPMIで洗浄したら、再度ペレット化し、上清をデカントする。細胞を1ミリリットルのcRPMIに再懸濁し、各チューブをインキュベートし、チューブの上部をガス交換のためにわずかに開いたままにして、細胞内AMエステルの完全な脱エステル化を可能にします。
次に、すべてのユーザー定義蛍光色素結合抗体のマスターミックスを調製し、それを1ミリリットルの細胞容量の休止細胞に加えます。安静後、細胞をペレット化し、摂氏4度に冷却した1ミリリットルのcRPMIに再懸濁してペレットを洗浄する。この手順を繰り返し、チューブを氷の上に置きます。
キャップ付きの5ミリリットルのポリスチレンフローチューブを使用して、個々のサンプルを500マイクロリットルのフェノールレッドフリーcRPMIに再懸濁します。カルシウムフラックス分析を使用して温度を維持するには、小さな水浴にバスビーズを加えてビーズバスを準備し、摂氏37度まで温めます。50ミリリットルのクロニクルチューブを慎重に半分に切り、チューブの上部を廃棄します。
残りのチューブの4分の3をバスビーズで満たし、ビーズバスで摂氏37度に達するようにします。ビーズバスをフローサイトメーターの近くに置き、発泡スチロールラックと一緒にチューブを配置します。フローサイトメーターで分析する前に、チューブを個別に摂氏37度に7分間温めます。
フローサイトメーターソフトウェアにログインし、「ライブラリ」タブをクリックします。次に、蛍光タグを選択して、カルシウム結合型Indo-1とカルシウムフリーIndo-1を追加します。次に、蛍光タググループでUVレーザーを選択し、[追加]をクリックして蛍光タグ名を追加します。
レーザー励起波長と発光波長を選択し、[保存]をクリックします。実験的なセットアップに進みます。[取得]タブをクリックし、新しい実験を開く/作成して、目的の蛍光タグを実験に追加します。
実験の参照グループと新しいサンプル グループを作成し、両方のグループにラベルを付けます。[取得] タブで、記録するイベントを最大 1,000 万に設定し、容量を最大容量 3000 マイクロリットルに、停止時間を最大 36, 000 秒に設定します。マルチカラーパネルに含まれるユーザー定義の標識抗体およびIndo-1機能性色素の単一染色コントロールを取得します。
カルシウム結合したIndo-1ポジティブコントロールとボルテックスに50マイクロモルのイオノマイシンを追加します。フローチューブをサンプル注入ボードに追加し、[記録]をクリックします。次に、カルシウムフリーのIndo-1ネガティブコントロールをフローサイトメーターに追加し、[記録]をクリックします。
汚れた単一のコントロールをミックス解除するには、[Unmix]ボタンをクリックします。混合解除が完了したら、サンプルから破片を除去するためのSSC-A対FSC-A、ダブレットを除去するためのSSC-A対SSC-Hなどの非混合ワークシートを使用してシーケンシャルプロットを作成します。次に、プロットをクリックしてゲートを作成します。
ワークシートにプロットを追加し、ゲート内をダブルクリックして、下流のゲート母集団を作成します。関心のあるすべての母集団が考慮されるまで続けます。次に、事前に調製した単一染色コントロールサンプルを摂氏37度に温めて逐次分析します。
フローサイトメトリーソフトウェアをセットアップし、氷水中でDIを2〜3分間実行して、フローサイトメーターの流動性を確保します。混合されていないワークシートにシーケンシャルプロットを設定するには、ポリゴンの長方形または楕円ゲートボタンを使用してゲートを作成し、対象の母集団を含めます。ゲートの内側をダブルクリックし、y 軸と x 軸のパラメータを SSC-A 対 SSC-H に変更します。
軸を左クリックして、軸パラメータの定義を完了します。SSC-A対生存率色素シグナルのプロットを作成します。アミン色素染色が陰性の生細胞をゲートします。
生死染色陰性の生細胞は、y軸とx軸の両方のゼロマークにクラスター化します。内側のプロットをダブルクリックして、単一細胞の生リンパ球のみを含む新しいプロットを作成します。カルシウム流入を視覚化するために、X 軸の Y 軸を Indo-1 対時間に変更します。
次に、温めた生物学的サンプルを機械のSITに入れます。中程度の流速で毎秒2, 500〜3000イベントでサンプルを実行し、限られた数の細胞集団におけるカルシウム流入を視覚化します。次のチューブを取得制御のビーズバスに追加します。
記録を押して初期データを30秒間記録し、サンプル中のカルシウムシグナル伝達の基礎レベルを取得します。次に、[停止]をクリックして、サンプル注入ポートからチューブを取り外します。30マイクログラムの非抱合型抗CD3をサンプルチューブに直接追加して、カルシウム流入を開始します。
チューブをサンプル注入ポートにすばやく戻し、ソフトウェアの[記録]を押します。ソフトウェアのアクイジションコントロールで経過時間を監視しながら、7分間データを記録します。次に、ソフトウェアで[停止]を押します。
イオノマイシン1ミリリットルあたり1マイクログラムを追加し、30秒間記録して、目的の細胞で最大のカルシウムシグナルを取得します。次のサンプルに進み、すべてのサンプルが収集されるまでワークフローを繰り返します。実験を保存し、エクスポート zip ファイルをクリックします。
混合されていないファイルは、外部のフローサイトメトリー分析ソフトウェアにアップロードされます。時間対側方散乱のプロットにおける安定した一貫した信号は、流体安定性を示した。リンパ球集団をゲーティングした後、側方散乱高さ対面積のプロット上で一重項を識別した。
一重項は生存率について評価した。次に、CD19陰性集団のゲーティングを適用しました。これらのT細胞サブセットは、カルシウム結合インド-1蛍光対時間比を視覚化することにより、CD4およびCD8に対する抗体を使用して評価されました。
個々の細胞集団において、カルシウム結合型Indo-1の時間に対するプロットは、刺激前のベースラインを示した。細胞内カルシウムレベルが低下するにつれてピーク応答し、カルシウム応答はイオノマイシンを添加することによって誘発されました。抗CD3抗体添加前に、弱いカルシウム結合Indo-1シグナルが検出された。
ピーク応答の間、細胞は強いカルシウム結合Indo-1シグナルを示し、カルシウムフリーIndo-1を減少させた。ピーク後5分で、Indo-1蛍光はほぼベースラインに戻った。イオノマイシン添加後、カルシウム結合Indo-1の堅牢なシグナルが可視化され、細胞の適切な色素負荷が示されました。
希少集団の分析は、関心のある各集団をゲーティングした後、カルシウム結合型Indo-1とカルシウムを含まないIndo-1をプロットすることによって実行されました。各サブセットについて全経時変化にわたるカルシウム応答を解析した。フルスペクトルプロファイリングを用いたカルシウムフラックスは、さまざまな免疫サブセットにおける高パラメータフローサイトメトリー分析につながる可能性があります。
T細胞サブセットの偏りのないクラスタリングのための高次元解析は、高度な解析のためにハイパラメータフローサイトメトリーと組み合わせて使用することができます。この技術は、バルクサンプル中の複数の免疫サブセットを互いに組み合わせて分析するために開発されました。
