NIH K08 EB003996

1。ソリューションをスピニングポリ- L -乳酸（PLLA） <ol><li>弱火で攪拌することにより9mLをクロロホルムで0.4グラムPLLAを溶かす。 </li><li> DMF 9:1（v / v）の：クロロホルム、4％PLLA（w / v）の溶液の最終濃度をもたらす、ソリューションに1 mLのジメチルホルムアミドを追加。 </li><li>鈍23ga先端に金属の付いたポリプロピレンまたはガラス製注射器内の溶液を置きます。 </li></ol> 2。基板の準備1スピニング <ol><li>弱火で撹拌することにより、クロロホルムの85:15 PLGA（ポリ乳酸 - コ - グリコール酸）の8％（w / v）溶液を加えます。 </li><li> PLGA溶液をそれぞれカバーガラスの表面を覆うことによりコートPLGAで清浄なガラスのカバースリップを。 PLGAは、薄膜（約30分）に乾燥することができます。 </li></ol> 3。エレクトロスピニング2 <ol><li>導電性カーボンテープでコレクタにPLGAコーティングされたガラスのカバースリップを固定します。整列繊維の場合、コレクタは、モータ駆動輪です。ランダム繊維の場合、コレクタは固定プレートです。 </li><li>コレクターの輪から先端部20 cmのポンプの場所の注射器。約2mL / hrにポンプを設定し、ホイールを使用して、300から400 RPMにモーターを設定した場合。可能であれば、コレクタと金属の先端〜+15 kVのに-2 kVのDCバイアスを印加。バイポーラ電源へのアクセスがない状態で、コレクタを接地してください。 </li><li>繊維は、シリンジの先端からジェット、回転する輪に収集します。繊維の所望の密度が得られるまで回転を続けます。スワイプ先端で目詰まりを防ぐために定期的に非導電性ロッドに固定されたペーパータオルで金属チップ。 </li></ol> 4。 1 Moating <ol><li>以下の紡績、カバースリップの周囲PLGAのラインをピペッティングにより&quot;堀&quot;エレクトロのサンプルを。 PLGAは乾燥することができます。これは、培養中の繊維の配向を維持します。 </li></ol> 5。タンパク質のコーティング<ol><li>エレクトロ繊維とガラスのコントロールは前の細胞培養へのタンパク質でコーティングする必要があります。少なくとも1時間のためのタンパク質溶液に基板をカバーし、過剰の溶液を吸引除去し、基質が乾燥しているまで、吸引続けます。可能なタンパク質溶液は、次のとおりです。PLL（ポリ- L -リジン）（100μg/ mL）を、ラミニン（25μg/ mLの）またはフィブロネクチン（50μg/ mL）を。 PLLが使用されている場合は、基材は滅菌水で洗浄し、初期コーティングに続く二回乾燥させる。 </li></ol> 6。 E15ラット胚3を入手する動物の使用や保管場所についてミシガン委員会の大学で承認されたとして、*全ての実験は、実験動物の管理と利用のためのNIHのガイドに従って行われた。 <ol><li>準備：動物が妊娠しているか確認してください。 3 mLのトリプシン、3 mLのFBSとL15の暖かいボトルを解凍。火災は、パスツールピペットを磨く。 30分間70％エタノールですべての手術器具を消毒する。 </li><li> （ 表1参照）メッキのメディアを準備して温める。 </li><li>安楽死：ケタミン/キシラジンのIP注入を実行します。 10〜15分待ってから、角膜とペダル撤退反射の欠如のために確認してください。反射神経が存在しないと、ペントバルビタール（FatalPlus）のIC注射を行います。 </li><li>テント腹部の皮膚。腹腔を露出する皮膚と筋肉の層を介してカット。子宮の位置を確認し、子宮頸部、卵巣でそれを切り離します。 </li><li>はさみで子宮から胚を取り出し、冷めないようにL15にすぐにそれらを置きます。 （次のすべての手順は、解剖顕微鏡および胚の下に完成されており、解剖コードは常に暖かいL15に浸漬する必要があります。）顎の周りと頭蓋骨の後頭骨下に鉗子を閉じることによって胚を斬る。 </li></ol> 7。解剖3 <ol><li>片側に胚を置きます。手足や腹部の臓器を離れて除去する他のセットを使用しながら鉗子の一組と脊髄を保護する。 </li><li>胚をオンにし、鉗子の一組とそれがそのままじっとしている。首から尾まで胚の長さに沿って切り取り、全体コードが露出するまで。 </li><li>慎重にコードの端をつかみ、削除するためにテールに向かって自分自身の上に引き出します。コー​​ドは、膜と接続された後根神経節（DRG）と無料のプルになります。 </li><li> DRGの外植片または解離性感覚ニューロンの文化が実行されることになっている場合、コードからDRGをチョキチョキと暖かいL15の新鮮な料理にそれらを転送する。 <ol><li>移植片培養をDRGの、25.9に進みます</li><li>解離性感覚ニューロンを培養するためには、手順9に進んでください</li><li>運動ニューロンの培養には、DRGは、ステップ7.5の膜で除去されます。 </li></ol></li><li>中敷の取り外しと同様、コードの先端にそれを把握し、それを剥がすことにより脊髄から膜を取り除く。すべての胚に対してこのステップを繰り返し、その後、小さな（2-3 mm）の部分にコード​​を切る。 </li></ol><pクラス=&quot;jove_title&quot;&gt; 8。運動ニューロン（MN）の処理5,6,7 <ol><li>ペレット片に2〜3分間1000 RPMで円錐とスピンに刻んだコードとL15を注ぐ。 </li><li>上清を捨て、ペレットコードにトリプシン3 mLを加える。 20分間37℃の水浴でインキュベートする。 </li><li>円錐と再ペレットに2〜3分間、1000rpmでスピンを3 mLのFBSを追加。 </li><li>上清と塗りFBSで火ポリッシュパスツールピペットを捨て。 </li><li>円錐形の一つパスツールL15のピペットフルを追加してから、解決策が目に見える塊と均一になるまで静かに砕いて粉末にする。泡を避けてください。 </li><li> L15でOptiprepの9％溶液を調製します。隔年胚（胚の数が奇数の場合は、切り上げ）のためにOptiprep液3mLでつのチューブを準備します。 </li><li>すべてのチューブの間で均等に分割し、Optiprep液に均質化ソリューションをドロップします。 15分間2000 rpmでチューブを回転させる。 </li><li>慎重に50 mLコニカルにおける各チューブとプールからの上位2 mLを収集する。 Optiprepの細胞をリンスして5分間1000rpmでL15とスピンで円錐形を塗りつぶします。 </li><li>上清を捨て、メッキのメディア（250〜500μl）を、少量の細胞を再懸濁します。生きている細胞を同定するためにトリパンブルー排除を用いて細胞を数える。 10.1に進みます</li></ol> 9。感覚ニューロン（SN）処理7 <ol><li>ペレットに2〜3分の作品のために1000 RPMでコニカルチューブに脊髄およびL15から削除DRGとスピンを注ぐ。 </li><li>上清を捨て、ペレットDRGにトリプシン3 mLを加える。 10分間37℃の水浴でインキュベートする。 </li><li>円錐と再ペレットに2〜3分間、1000rpmでスピンを3 mLのFBSを追加。 </li><li>上清と塗りFBSで火ポリッシュパスツールピペットを捨て。 </li><li>円錐形の一つパスツールL15のピペットフルを追加してから、解決策が目に見える塊と均一になるまで静かに砕いて粉末にする。泡を避けてください。 </li><li> 5分間1000rpmでホモジネートを回転させる。上清を捨て、Snめっきの小容量のリムーバブルメディア（250〜500μL）で細胞を懸濁します。生きている細胞を同定するためにトリパンブルー排除を用いて細胞を数える。 10.1に進みます</li></ol> 10。メッキと文化<ol><li>解離SNまたはMN文化のための： <ol><li>メディアの数滴を基板をカバーするとして細胞懸濁液の適切な量を追加します。解離細胞は低密度（25〜50細胞/ mm 2）で播種してください。細胞は培地をウェルの中にフラッディングする前に少なくとも1時間付着することができます。 </li></ol></li><li>移植片培養をDRGの： <ol><li>メディアの数滴を基板をカバーするには、メディアにDRGに追加します。それらが均等に（約4 DRGは、22x22 mmのカバースリップに収まる）基板上に分散されるようにDRGを手配する。 DRGは、メディアで井戸をフラッディングする前に少なくとも4時間のために付着することができます。 </li></ol></li><li>文化は、メディアを変更することなく、4日間まで維持することができます。長い文化のために、半分のメディアの変更は、フィードのメディアで行ってください。フィードメディアは、メッキのメディアマイナスL -グルタミンと同じ組成である。 </li></ol> 11。免疫細胞化学1,5,8 <ol><li>セルを修正する：吸引のメディアは、30分間のウォーム4％PFA（パラホルムアルデヒド）に置き換える。その後3X 5分1 × PBSで洗浄を行います。 </li><li>ブロッキング/透過化：ブロック/パーマ液（1 × PBSでウシ血清アルブミン1.25パーセント、0.05％トリトンX - 100、2.0％正常ヤギ血清）を準備します。吸引PBSと30分間のサンプルをブロック/パーマソリューションを適用する。その後1X 5分1X PBSの洗浄を行います。 </li><li>一次抗体：一次抗体希釈標準溶液調製（10％正常ヤギ血清、1.25％ウシ血清アルブミン、0.1％アジ化ナトリウム、0.05％トリトンX - 100をおよび1x PBSで10mLに）。一次抗体の適切な量を追加する（ 表2参照）。パラフィルムとの線、いくつかの料理。各基板のためパラフィルム上に一次抗体溶液の200μlのビーズを置きます。基板反転、（部屋にエアコンが付けまたは特に乾燥の場合は、水飽和一枚の紙が正常に機能している溶液の蒸発を防ぐために、料理のコーナーに追加できる）一晩一次抗体希釈標準溶液にそれらの細胞の側を下に浮いて。 </li><li>二次抗体：（ワーキング溶液は4℃で保存し、Cを収集して再利用することができます）プライマリから基板を除去し、2X 5分1 × PBSで洗浄を行う。 4時間PBS（また、パラフィルムが並ぶ皿の上に反転）で1:200に希釈した200μlの二次抗体を適用します。 </li><li> 2X 5分1 × PBSで洗浄を行う、セカンダリから削除します。でスライド上にマウント基板には、DAPIまたは別の適切な核のカウンタが含まれているゴールドが染色長くしてください。 </li></ol> 12。代表的な結果： 配向とランダムエルの典型的な形態ectrospun繊維を図1に示されています。我々は通常、このプロトコルで&gt; 90％のニューロンのMNの純度7,8を取得し、我々は、重要な線維芽細胞成長なしに限り一週間などのための文化をDRGの維持している。図2は、文化と免疫染色の24時間後のガラスと繊維の典型的なMNの外観を示しています。ガラスおよび繊維の3つの日間培養した免疫染色DRGを図3に示されている。 <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。ファイバのアライメントは、コレクタの選択によって操作されます。 A.））回転する車輪のコレクタとB.に紡糸繊維を揃えるランダム繊維は、固定プレートのコレクタ上にスピン。スケールバー= 20μmの。 <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。）PLLコーティングされたAの文化の24時間後にTuJ1（緑）およびDAPI（青）のために繊維とBを染色した代表的な運動ニューロン）ガラス。スケールバー= 20μmの。 <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。PLLコーティングされたAの3日間培養した後、ニューロフィラメントのための代表的なDRGのステンドグラス（緑））ガラスとB）繊維。スケールバー= 200μmの。 <table border="1"><tbody><tr><td> ストック溶液： </td><td> MNメディア： </td><td> DRG / SNメディア： </td></tr><tr><td>アルブミン10 mgのmL -1の </td><td> 12.5μL </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 mgのmL -1のアポトランスフェリン</td><td> 50μlの</td><td> 40μlの</td></tr><tr><td> 50μgのmL -1の β-エストラジオール</td><td> 2.7μL </td><td> 2.2μL </td></tr><tr><td>は0.1 mg mL -1のビオチン</td><td> 50μlの</td><td> - </td></tr><tr><td> 16mgのmL -1のカタラーゼ</td><td> μlの8 </td><td> - </td></tr><tr><td>の15 mg mL -1の D -ガラクトース</td><td> 50μlの</td><td> - </td></tr><tr><td> 50μgの溶解-1ヒドロコルチゾン</td><td> 3.7μL </td><td> 2.9μL </td></tr><tr><td> 0.63ミリグラムmL -1のプロゲステロン </td><td> 0.5μL </td><td> - </td></tr><tr><td> 16mgのmL -1のプトレシン</td><td> 50μlの</td><td> - </td></tr><tr><td> 50μgのmL -1のセレン</td><td> 3.4μL </td><td> 4.1μL </td></tr><tr><td> 2.5mgのmL -1のスーパーオキシドジスムターゼ</td><td> 50μlの</td><td> - </td></tr><tr><td> * 500 ngのmL -1の神経成長因子</td><td> - </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> * 100X PSN </td><td> 0.5mLの</td><td> 0.5mLの</td></tr><tr><td> * B27 </td><td> 1 mLの</td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> * 2 mMのL -グルタミン</td><td> 35μlの</td><td> 35μlの</td></tr><tr><td> * Neurobasal </td><td> 50mlまで</td><td> 50mlまで</td></tr></tbody></table> 表1：使用直前にメディアに（*）星を獲得したコンポーネントを追加します。残りのコンポーネントは、原液として調製し、6,7を必要とするまで-20 ° Cに保つことができる。 <table border="1"><tbody><tr><td> 一次（濃度） </td><td> ニューロン： </td><td> グリア： </td><td> 線維芽細胞： </td></tr><tr><td>抗β-チューブリン（TuJ1）（1:1000） </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td>抗ニューロフィラメント（1:1000） </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td>抗S - 100（1:250） </td><td> X </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td></tr><tr><td>抗NGFR P75（1:500） </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td><td> X </td></tr></tbody></table> 表2：一次抗体の選択は、研究者の目標に依存しています。上記は、いくつかの抗体と我々の研究室で成功を収めて使用した濃度です。 S - 100は、シュワン細胞の同定および/または繊維芽細胞を汚染するかどうかを確認、しかしそれはグリア細胞とfibroblasts4を区別するNGFR p75のと組み合わせて使用​​する必要があることに注意することは特に便利です。我々はまた、目標は、個々の神経突起を可視化するかどうニューロフィラメントまたはTuJ1が優れた選択肢である一方NGFR p75の汚れが非常に軽く神経突起ことに気づいた。

<ol>
	<li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons.">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li><li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications.">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Kameda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+glial+progenitor+markers+p75NTR+and+S100+protein+in+the+developing+mouse+parathyroid+gland.">Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland.</a> Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).</li><li>Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+electrospun+nanofibers+specify+the+direction+of+dorsal+root+ganglia+neurite+growth.">Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).</li><li>Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-I+prevents+glutamate-induced+motor+neuron+programmed+cell+death.">IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death.</a> Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).</li><li>Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-I+prevents+apoptosis+in+neurons+after+nerve+growth+factor+withdrawal.">Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal.</a> J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).</li><li>Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+neuritogenesis+and+maturation+of+primary+spinal+motor+neurons+in+response+to+nanofibers.">Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers.</a> Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).</li><li>Tan, S. -. H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process.">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li><li>Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+highly+aligned+electrospun+poly-L-lactic+acid+fibers+for+nerve+regeneration+applications.">Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルは、いくつかの重要なステップがあります。最初はエレクトロ繊維基材の適切な生産を伴います。液体培地では、PLLA繊維、PLGAフィルムおよびPLGAの堀は、単一ユニットとしてガラス製カバースリップから分離されます。 PLGAが省略された場合、PLLA繊維は、平らなシートは残りません - 彼らが使用不能にもつれに丸くなっています。従って、PLGA膜は培養中に光ファイバのアライメントを維持するために適切な基質として含まれています。堀は、繊維がしっかりとPLGA膜に固定されており、フィルムに構造的な剛性を追加することを保証するために両方のスピンの後に追加されます。基板は、固定染色し、実装時に操作される際に堀にも便利なハンドルとして機能します。粉砕は2番目に重要なステップです。あらゆる努力が泡の形成を回避するためになされるべきである。さらに、我々は、ファイアーポリッシュピペットはこのステップに使用される非常に高い利回りを得ている。研磨発生させるには、ブンゼンバーナーを点灯し、ピペットに電球を取り付けます。継続的に絞ると電球を放出しながら炎を迅速に2-3回をピペットの先端を渡す - ピペットを通る空気の流れが完全に閉じてから先端を防ぐことができます。穴が開いたままとエッジは使用前に少し丸み表示されるようになるようにピペットの先端を調べます。 エレクトロスピニングは、非常に汎用性の高いプロセスです。エレクトロスピニングのパラメータは、形態の様々な繊維を製造するように変更することができます。タンはら （2005）詳細PLLAエレクトロ繊維の直径に影響を与えるパラメータの体系的研究を。 Wang ら （2009）エレクトロPLLA繊維のアラインメントに影響を与えるパラメータの詳細な調査を提示。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PLLA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boehringer Ingelheim</td>
<td>Resomer L210</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PLGA 85:15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>43471</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>11415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>A2289 
</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Apo-transferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Akron </td>
<td>AK8227</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>AC 23009-0010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Galactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>G0625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7556</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Selenium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>S9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-estradiol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>E 1132 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrocortisone </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>H0396</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>C40 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superoxide dismutase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>S4636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PSN</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>15640 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene </td>
<td>1680149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene </td>
<td>1689149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>26140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optiprep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate </td>
<td>2011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PLL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P4832 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>F 4759 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7906</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-TuJ1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556321</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-neurofilament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>AB1987</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-S100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S2532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-NGFR p75</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N3908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal goat serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G6767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>13073-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Prolong Gold +DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36931</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-l-lactide nanofiber scaffolds

エレクトロスピニングは、ナノスケールの繊維のマイクロに生成するためのテクニックです。繊維は非常に完全にランダムに整列から、アライメントの程度の差でエレクトロスピニングすることができます。さらに、繊維は、ポリ- L -乳酸（PLLA）のような生分解性ポリマーを含む様々な材料、から紡糸することができます。これらの特性は、組織工学における足場の様々なアプリケーションに適したエレクトロスピニングの繊維を作る。我々の焦点は、神経再生のための整列エレクトロ繊維の使用になります。我々は以前にアラインエレクトロPLLA繊維は、in vitroの両方の一次感覚と運動ニューロンの突起伸長を指示することを示している。我々はできるかぎり生体に見られるモデル実際の神経細胞への生体材料を評価する際に、初代培養細胞系の使用が不可欠であることを維持する。ここで、我々は、エレクトロスピニングの足場に、繊維状の足場と文化背根神経節の外植片だけでなく、解離性感覚および運動ニューロンをelectrospinする我々の研究室で使用される技術について説明します。しかし、エレクトロスピニングおよび/または文化ここに示す手法は、容易に他のアプリケーションでの使用に適合している。

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The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

整列エレクトロスピニングの繊維は、in vitroで神経細胞の成長を指示し、神経再生の足場の潜在的なコンポーネントです。我々は、エレクトロスピニングの繊維基材と初代ラットE15感覚（DRG）と運動ニューロンの無血清培養を調製するための手順を説明します。免疫細胞による神経細胞の可視化も含まれています。

一次運動とエレクトロポリ- L -乳酸ナノファイバー足場上で定義されているメディアの感覚ニューロンの文化

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned ...

the-culture-primary-motor-sensory-neurons-defined-media-on

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JoVE Journal

Neuroscience

19.3K ビュー.  University of Michigan. 整列エレクトロスピニングの繊維は、in vitroで神経細胞の成長を指示し、神経再生の足場の潜在的なコンポーネントです。我々は、エレクトロスピニングの繊維基材と初代ラットE15感覚（DRG）と運動ニューロンの無血清培養を調製するための手順を説明します。免疫細胞による神経細胞の可視化も含まれています。

ビデオ: The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...