すべての手順は、アニマルケアのウィスコンシン委員会の大学によって承認され、NIHのガイドラインに従ってであった。私たちは、彼女のNucleofector装置の寛大な使用のために博士はキャサリンカリルに感謝。我々は、プロトコル上のコメントのデントラボのメンバーにも感謝。この作品は、EWDへの助成金NIH R01 - NS064014、ダナ財団とホワイトホール財団によってサポートされていましたクリストファーViesselmann、ジェイソンBallwegとデレクLumbardはこの論文にも同様に貢献した。

1。カバーグラスとチェンバースの準備<ol><li>きれいなカバースリップとチャンバーの準備は健全な文化のために不可欠です。ショートカットは、これらの手順のいずれかで取られるべきでない。 </li><li>専用のガラスの瓶やビーカーに濃硝酸で一晩（HNO3） - カバースリップ（キャロライナアシスタントブランド12ミリメートルまたは22ミリメートルラウンド、ドイツのガラスを）洗う。 </li><li>硝酸からカバースリップを削除し、脱イオン水で（5 - 7X）広範囲に洗浄。 </li><li>層流フードまたは生物学的安全キャビネットのカバースリップと乾燥を区切ります。乾燥時、30分間UV光でそれらを滅菌する。ストレージのための滅菌ペトリ皿に滅菌カバーグラスを置きます。 12ミリメートルカバースリップ上にめっきニューロンは直接滅菌35mmディッシュにカバースリップを配置し、セクション2に進んでいる場合。 </li><li>イメージングチャンバーは35mmペトリ皿の底に15ミリメートルの穴をあける（すべてのバリを除去）し、パラフィンやワセリンの3:1混合物で洗浄カバーグラスを取り付けることによって構成されている。 </li><li>沸騰水浴内のコニカルチューブにパラフィン/石油ゼリーの混合物を溶かす。小さいペイントブラシとコート15ミリメートル穴の周り皿の下側を使用してください。それが分離されるようにパラフィン/石油ゼリーの混合物を攪拌しながら維持することを確認してください。料理をインキュベーター内に配置されているときにカバーの剥離、その結果、粘性となる石油ゼリーの濃度が高い、と一緒に接着されたチャンバ内のこれは通常、結果。残りのパラフィン/石油ゼリーは室温で保存することができます。 </li><li>平らなトレイ上に逆さまに皿を置き、穴にカバースリップを配置。 80内の熱° Cオーブンパラフィンの混合物が溶融するまで（〜10分）。平らな面に皿を取り外し、パラフィンの混合物のセットをしましょう​​。 </li><li>皿を裏返しして紫外光でカバーし、チャンバーの底の内側の両方を滅菌する。 </li><li> 1時間コートのカバースリップまたはホウ酸緩衝液（0.1Mホウ酸ナトリウム、pH8.5）に1.0mg/mLポリ- D -リジン（30kDa）とチャンバーのガラス領域。組織培養グレード脱イオン多量の水で3-5回すすいでください。ホウ酸緩衝液の痕跡をすべて削除してください。乾燥させて、後で使用するために直ちにまたは店舗室/カバースリップを使用します。我々は通常、準備の一ヶ月以内にきれいにカバースリップを使用してください。 </li></ol> 2。神経解剖と培養液の調製<ol><li>組織培養グレードの水に10倍HBSSと100X HEPESの適切な量を追加することで解剖の培地（DM）を準備する。 4℃で保存します。解剖時には氷上に置きます。 </li><li>解剖前日には、メッキの培地（PM）および無血清培地（SFM）を準備する。 PMはNeurobasalミディアム、B27サプリメント、2mMグルタミン、0.3％グルコース、37.5 mM NaClおよび5％ウシ胎児血清（FBS）で構成されています。 SFMはNeurobasalミディアム、B27サプリメント、2mMグルタミン、0.3％グルコース、37.5 mM NaClで構成されています。 </li><li>培地の平衡化の温度とCO 2含有よう少し半開きにキャップで一晩組織培養インキュベーターで解剖し、店舗のためにのみ十分な確認。我々は、余分なブドウ糖を追加し、NaClで約310mOsmに浸透圧を増加させる。我々は、文化はより生理的浸透圧（Neurobasal浸透圧は、一般的に205 - 245mOsmである）でもっと良いもの見つける。 </li></ol> 3。長期培養のための皮質グリアフィーダーレイヤーの準備<ol><li>長期培養を準備する必要のある場合は、2〜3週間皮質または海馬の解剖を続ける前に、プロトコルのこの部分を実行します。 </li><li> MEMとグリア培地（GM）、0.3％グルコース、ペニシリン/ストレプトマイシン、10％ウマ血清を準備します。 </li><li>氷上で5分間冷却することにより、P1 - P3仔マウスを安楽死させる。 70％エタノールと氷とスプレーから各子犬を削除します。すぐにはさみで首を切る。コー​​ルドDMを（ステップ2.1）を含む皿に脳全体を削除します。 </li><li> two大脳半球および髄膜を取り外します。新皮質税とは、メディアを含まない新しい皿に移す。合計4脳から皮質を準備します。 </li><li>できるだけ細かいようにきれいに、滅菌カミソリの刃で皮質を飾らないと冷たいDMの12 mLを含む50mLのコニカルチューブにプラスチック製のピペットを刻んだ組織を取り除く。それぞれ0.25％（1.5mL）を、0.1％（1.5 mL）を、最終濃度にトリプシンとDNaseを追加。断続的な渦巻くと10分間37℃の水浴でインキュベートする。 </li><li>皮質組織を含むチューブを外し、組織培養フードに持ち込む前に70％エタノールで十分に洗浄。 10 mLのピペットとピペット皮質組織の上下は約10〜15倍、またはまで、ほとんどのチャンクが消えます。 </li><li> ° C断続的な旋回を持つ別の10分間水浴中で37にチューブを返します。 </li><li>徹底的に70％エタノールでチューブをきれいにし、組織培養フードに戻す。 5メートルで、上下のピペット皮質組織をLピペット約10〜15倍、またはチャンクがなくなるまで。 </li><li>暖かいGM 15mLを加え、10分間200xg（1000rpm）で遠心。 </li><li>上清を破棄し、新鮮なGMの20mLにペレット化した細胞を再懸濁し、血球計数器でカウント。 75センチメートル2フラスコあたりのGMの15 mLの内板5 - 7.5x10 6個の細胞。 </li><li>ある日、文化の各2月3日その後の日後、あなたの手に対してフラスコをノックでバラセルを押しのける。どんな外れた細胞と共に培養液を除去し、新鮮なGMの15 mLで置き換えます。 </li><li>彼らは70〜100％程度コンフルエントのときにグリア細胞が、フラスコの成長の1〜2週間後に収穫することができます。グリア細胞で被覆された個々のカバーグラスを準備するには、場所6硝酸は、小さな絵筆と三角パターンで各カバースリップの上にパラフィン/石油ゼリーの3:1混合物の3つの点をきれいにして10cmの皿に25ミリメートルラウンドカバーグラスを滅菌し、場所。 30分間紫外線を開いて料理を扱います。コー​​ト1時間ホウ酸緩衝液では0.1 mg / mLのポリ- D -リジン（30kDa）とカバーガラスは、その後無菌組織培養グレード、脱イオン水で（3〜5倍）広範囲に洗浄し、乾燥させる。 </li><li>インキュベーターからグリア含有フラスコを削除、培地を廃棄し、予め温めておいたトリプシン/ EDTA溶液5 mLですすいでください。フラスコからトリプシン/ EDTA溶液を除去し、フラスコに新鮮予め温めておいたトリプシン/ EDTA 3 mLをピペット。 ° C、トリプシン処理を停止するには、GMの5 mLを追加する前に、37℃で1分間フラスコをインキュベートする。 </li><li> 10月15日回ピペッティングを繰り返すことによりフラスコからグリアを削除してから、15 mLコニカルチューブにメディアを転送する。 8分間200xg（1000rpm）で遠心。上清を除去し、カバースリップを含む10 cmディッシュあたりのGMの12.5 mLの10 GM mLの、カウント細胞、およびプレート5 × 10 5細胞を加える。 </li><li>新鮮予め温めておいたGMごとに2〜3日で培地を交換する。ニューロンの解剖前日には、GMを削除し、SFM（セクション2.2）と交換してください。皮質または海馬培養をフラッディングするときにステップ4.12でこのグリアエアコンSFMを使用してください。 </li></ol> 4。皮質および/または海馬解剖とエレクトロ<ol><li> nucleofectionソリューション（ロンザ）の適切な量を削除、解剖を開始する前に結合し、室温に暖かい。組み合わせるとNucleofectionのソリューションは、限られた寿命を持っているので、我々はそれぞれの準備（トランスフェクションあたり100μL）に必要な量を組み合わせる。 </li><li> CO 2（プラグの日はE0.5です）とE15.5で妊娠したマウスを安楽死させると10cmのペトリ皿に子宮を削除します。コー​​ルドDM（セクション2.1）に胎児と首を切るを削除します。 </li><li>冷たいDMの別々の皿に脳全体を取りはずして、曲がったタングステン針で、両方neocortexの複数形を削除する。冷たいDMの新しい料理にmicroforcepsと場所の皮質と髄膜を取り外します。小さな虹彩またはヴェッカーハサミで、冷たいDM 1.0mLのでいっぱいの1.5 mLエッペンドルフチュー​​ブに皮質または海馬と場所を削除します。氷の上にこのチューブを保管してください。 </li><li>すべての皮質または海馬を解剖した後、20分間37℃のインキュベーターで組織し、場所チューブを含むエッペンドルフチュー​​ブに2.5％トリプシン110μLを加える。 </li><li>静かに転倒エッペンドルフチュー​​ブで1.0mLのPM（セクション2.2）で上清と洗浄皮質または海馬を削除します。チューブでPMを1 mLを残して、二回洗浄を繰り返します。 </li><li> P1000ピペットで塊を15回ひいて粉にする、とPMの4 mLを含む新しい15 mLコニカルチューブに上清/セルを削除し、エッペンドルフチュー​​ブに残っているチャンクを残す。 </li><li>ブレーキオフで7分間20xg（350rpm）で15 mLのチューブを回転させる。上清を捨て、各トランスフェクションのための予混合、室温のnucleofectionソリューション（ロンザ）100μLを加える。 P1000ピペットの緩やかな上下の動きで5回ひいて粉にする。 </li><li>それぞれの新しいエッペンドルフチュー​​ブにnucleofectionソリューション/細胞混合液を100μLを削除し、DNAの適切な量を追加します。長期的な文化のために我々は一般的にトランスフェクションあたりのDNAの1 -2μgを使用してください。しかし、このラベルだけの文化で神経細胞の小&lt;10％の割合。短期培養のためにより高いトランスフェクション効率が必要な場合我々は一般的にトランスフェクションあたりのDNAの5 -10μgのを使用してください。 2種類の異なったプラスミドでトランスフェクション時に我々はDNAの40μgの総まで使用している。プラスミドはμL/1μgのでTEバッファーに格納されています。 </li><li>キュベット（ロンザ）に細胞懸濁液/ DNAを追加し、プログラムO - 005（マウス中枢神経系ニューロン）を使用して、Nucleofector（ロンザ）で細胞をエレクトロポ。 </li><li>素早く作業を、キュベットに予め温めておいたと平衡PMの500μLを追加し、新しい1.5 mLのエッペンドルフチュー​​ブにソリューション/セルを削除します。を1.0 mLにそれぞれトランスフェクションのボリュームをもたらすのに十分なPMを追加。長期培養のための若者文化、または5 - 10x10の3個 / cm 2と 3 - 5 × 10 3細胞/ cm 2で血球計算板とプレートで細胞を数える。&lt;は/ LI&gt; <li>短期的な文化のため、洪水温めたの2.0 mLを、メッキの1時間後にCO 2平衡SFMを搭載した35 mm培養皿。カバースリップを使用している場合、我々は、PMの半分を削除し、さらに2回繰り返して、SFMと交換してください。どちらイメージングチャンバーを洪水や非常に低い血清含有量（&lt;0.5％）でカバースリップの結果を洗う。短期的な文化は、グリアフィーダー層で培養する必要がないと再供給する必要はありません。 </li><li>長期培養では、パラフィン/石油ゼリーの3つのドットが含まれているグリアカバーカバーを取り外し、35mmディッシュに15ミリメートル穴、初期めっき後、1時間かけてそれを反転させる。グリア皿からエアコンSFMの二ミリリットルその後イメージングチャンバーに追加されます。長期培養を養うために、我々は、SFMごとに2〜3日の3分の1を削除して、新鮮、予め温めておいたとCO 2平衡SFMと交換してください。 </li></ol> 5。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。海馬ニューロンを生きた代表の発達の連続した段階で海馬の神経細胞を生きた。ペア画像は微分干渉コントラスト画像と対応する蛍光顕微鏡写真の両方として表示されます。これらの各セルは、pCAXベクトルにおけるEGFP -チューブリンとDsRed2のをトランスフェクトされています。ステージ1（1DIV）、ステージ2（1DIV）、ステージ3（2DIV）、ステージ4（11DIV）とステージ5（32DIV）：神経細胞は、in vitroで 、次の日（DIV）で撮像した。スケールバーは20μmのです。

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利害の衝突は宣言されません。

培養胚の海馬と皮質のマウスニューロンのためのこのプロトコルは、ラットの神経細胞の1,2を使用してバンカーのプロトコル、の修正として開発されました。我々はよく3,4,5,6,7として培養マウスとハムスターのニューロンのためにこのプロトコルを使用している。このプロトコルは、海馬と新皮質の両方に神経細胞にも同様に機能し、Mebergとミラー8によって発行されたプロトコルに似ています。彼らはよく特徴付けと、より確立されたモデル系されているため、一般的に、我々は、長期培養のために海馬ニューロンを使用してください。さらに、彼らは新皮質よりもニューロンのより均質な集団を含む可能性があります。しかし、このプロトコルを使用して培養大脳皮質ニューロンも生き残ると（未発表データ）も同様に区別する。我々は日常的に短期の文化のために海馬と新皮質の神経細胞を使用してください。新皮質の解剖はまた、西洋例えば、ブロッティングのための材料のよりよい選択肢と海馬解離（海馬のペアごとに2.5x10 5ニューロン）、より実質的により多くのニューロン（皮質のペアごとに1.5 × 10 6ニューロン）をもたらす。 任意の初代培養と同様に、それが動物の死から細胞をプレーティングするのにかかる時間を最小限に抑えることが不可欠です。それは一般的に解剖し、メッキで一貫して高速になるために10月20日解剖がかかります。それらはnucleofectionバッファに残っている場合、ニューロンの生存率が急激に減少するとしても、ロンザNucleofectorで作業する場合、それは、エレクトロポレーションの手順の間に素早く作業することが重要です。 私たちの撮影の多くは、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）で行われている。顕微鏡のこのタイプは、カバースリップを超えたイメージング数百ナノメートルのみが可能です。したがって、我々は頻繁に画像そのニューロンの領域は、軸索成長円錐と樹状突起棘は、カバースリップに直接付着する必要があります。従って、我々は、長期培養のためにグリア栄養を必要とする低密度培養を使用してください。我々は、長期培養のために、グリアフィーダー層なしで、高密度培養（&gt; 2 × 10 4細胞/ cm 2）を使用し、それらが少し餌と非常によく生き残ることを発見した。それらは容易に広視野顕微鏡または共焦点顕微鏡で検出することができるが、しかし、これらのニューロンの樹状突起は、しばしば、あまりにも遠く離れて基板からTIRFMの画像になります。 我々の研究のほとんどでは、メッキの前に神経細胞をトランスフェクトし、文化の3ヶ月までのための蛍光標識タンパク質を画像化している。蛍光標識タンパク質のこの長期的な発現は、DNA（1 -2μg）の低濃度を使用することによって我々は神経細胞で過剰発現のアーティファクトを生成していないことを私たちに自信を与えます。しかし、この手順は、DNAの大量（10 -20μg）を使用する場合、タンパク質の過剰発現を研究するために使用することができます。我々はまた、単独でDsRed2のまたはEGFPを持つ神経細胞質にラベルを付けるものの、我々は通常、神経細胞をトランスフェクトするために使用するプラスミドは、EGFPまたはmCherry融合タンパク質が含まれています。このエレクトロポレーション法は、ベクトルの数とうまく動作します。我々は、CMVエンハンサーとβ-グロビンポリ- expressionの比較的高いレベルのために尾（pCAGGsまたはpCAXプラスミド）9、、と彼らはよく神経細胞によって許容されるという事実とβ-アクチンプロモーターを含むプラスミドを好む短期と長期培養の両方インチ一般に、タンパク質はメッキの約4時間以内に発現し、10 24 10内イメージングのための十分なレベルに到達し始める。私たちは正常に短期培養におけるCMV -プロモーター駆動型プラスミドを用いているが、彼らは長期培養で神経細胞を殺すことに過剰発現の高いレベルを引き起こすことを見出した。それにもかかわらず、我々は、低密度培養のグリアコンディショニングがより高い密度（非グリアFED）の文化と比較して、CMV -プロモーター駆動プラスミドをトランスフェクトした神経細胞の生存に役立つことを発見した。

我々は-80保存することを*ほとんどの試薬は° Cも同様に-20℃で保存することができます。 -80それらを格納° Cは、その貯蔵寿命とわずかに一貫性のある文化では結果が長くなります。

nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons

海馬と皮質ニューロンは、中枢神経系（CNS）神経偏光、軸索/樹状突起伸長、およびシナプス形成と機能を研究するために広く使用されている。培養の利点は、これらのニューロンは非常に低密度で二次元の基板上に、独特の軸索と樹状突起を形成し、それらが容易に分極することです。このプロパティは、神経発達の多くの側面を決定するため、それらは非常に便利なてきた。さらに、これらのニューロンのためのグリアコンディショニングを提供することによって、彼らは機能的なシナプス結合を形成し、文化の中で数ヶ月間生存し、発展していきます。このプロトコルでは、文化とトランスフェマウス胎児海馬と皮質の神経細胞を分析する手法の概要を示します。トランスフェクションは、nucleofectionを経由してめっきする前に、神経細胞にDNAをelectroporatingことによって達成される。このプロトコルは、偏光、軸索伸長と分岐の間に蛋白質のダイナミクスと機能を研究するために開発（〜4 8時間メッキ後）の初期の蛍光タグ融合タンパク質を発現できるという利点があります。我々はまた、メッキの前に、この単一のトランスフェクションは、ニューロン（文化の中で&gt; 2ヶ月）の生涯を通してイメージングのための適切なレベルで蛍光タグ融合タンパク質の発現を維持することを発見した。したがって、この方法論は、神経機能のほとんど、またはまったく中断して中枢神経系の開発を通して蛋白質の局在と機能を研究するために有用です。

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

このプロトコルは、エレクトロポレーションと文化のマウス海馬および皮質のニューロンを経由してトランスフェクション、解剖するために必要な手順を説明します。長期培養がシナプスと樹状突起棘の解析の研究に使用することができますが、短期的な文化は、軸索伸長やガイダンスの研究に使用されることがあります。

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.3K ビュー.  University of Wisconsin-Madison. このプロトコルは、エレクトロポレーションと文化のマウス海馬および皮質のニューロンを経由してトランスフェクション、解剖するために必要な手順を説明します。長期培養がシナプスと樹状突起棘の解析の研究に使用することができますが、短期的な文化は、軸索伸長やガイダンスの研究に使用されることがあります。

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

マウス胚の運動ニューロンのレクチンに基づく分離と文化

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

マウス大脳皮質アストロサイトの単離および培養

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

初代海馬ニューロンのリン酸カルシウムトランスフェクション

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

マウスドーパミン作動性ニューロンの初代培養

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

低密度初代海馬ニューロンの文化

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...