我々はプロジェクトのためのコメントやアドバイスを提供するためのビジュアル分析（VIVA）のバンクーバー研究所のメンバーに感謝したいと思います。特に、我々はジョンディル、ブライアンフィッシャー、デビッドダービルに感謝します。我々はまた彼らのサポートと有用な議論をKollmann研究室のメンバーに感謝したいと思います。アレルゲンNCE助成金07 - A1Aと07 - B2Bを;この作品は、アレルギーと国立感染症研究所、健康グラントN01 AI50023の国立研究所によって部分的にサポートされていましたし、健康研究のためのマイケルスミス財団。 TRKは病気 - キッズ基金、子ども家庭総合研究所と共同でカナダの母子保健臨床医科学プログラムにおける保健研究訓練助成金のためのカナダの協会によってバローズウェルカムファンドの広告から生物医学科学のキャリア賞、（によって部分的にサポートされていますブリティッシュコロンビア州）、女性と子どもの健康研究所（アルバータ州）、及び母子保健のマニトバ大学。

1。タブローで探査ベースの分析<ol><li>あなたは、データセットを持っていて、データ内の列の間に様々な関係を探求したい。 <ol><li> （図1）&quot;は、データへの接続&quot;をクリックして、データセットをインポートします。データソースの種類を選択して、データセットをインポートする手順に従ってください。 </li><li> （図1）対策の棚は、データセットから数値列が含まれている間寸法の棚は、カテゴリ列が含まれていることを確認してください。それがnumeratedされている場合、時々そのようなサブジェクト識別子と、ディメンション列は尺度として表示されることがあります。それを右クリックして、寸法に変更し、&quot;ディメンションへの変換&quot;を選択します。図1では、このような刺激の濃度レベルと対象の識別子などのデータセットからカテゴリの列が正しく寸法の棚に配置され、サイトカインの観察された濃度は、正しく対策の棚に配置されます。 </li><li> （図2）分析プロセス中に、計算フィールドが必要な場合は、単に右のディメンションまたはメジャーシェルフのいずれかでクリックし、&quot;計算フィールドを作成&quot;を選択します。関数や数学的演算子と組み合わせてフィールドを持つ式ボックスに演算入力。図2は、PFD2、PFD3、およびPFD4値を集約することで&gt; 2をPFDはという新しいフィールドを作成する方法を示します。 </li><li> （図3）次元と関心の測定で一般的には、場札の2次元プロットを生成します。インターフェイスはシンプルなドラッグ＆ドロップ操作を提供するので、ディメンションとメジャーの選択は容易に変更することができます。寸法は通常、行の棚の列の棚、と対策に配置されます。図3では、寸法の棚は、刺激の濃度レベルが含まれており、対策の棚には、サイトカインの観測濃度のレベルが含まれています。 </li><li> （図3）は、次元の性質に応じて、テキスト、色や大きさの棚で、特定のディメンション、場所、そのディメンションのラベルによって視覚化を区別する。テキストの棚には、選択された次元で提供されるテキスト情報でそれらを標識することにより可視化でデータを区別しようとします。カラーとサイズの棚が自動的に各棚の下部にあるスクロールバーで調整できるカラーとサイズ別にデータを、区別されます。図3では、色の棚に置く遺伝子型は異なる色で3つの遺伝子型の分離につながる。 </li><li> （図3）他のディメンション内の特定の列の変数で可視化するフィルタ。これは、フィルタの棚にそのディメンションのラベルをドラッグすることによって行うことができます。ウィンドウから選択する値のリストが表示されます。選択された値は、可視化に残っている唯一の値になります。 </li><li> （図4）は視覚化の行列を生成するために他のディメンションまたはメジャーで可視化を組み合わせることができます。これは、行の棚の列の棚で、複数の次元、及び複数のメジャーをドロップすることによって行うことができます。図4は、列の棚に二つの異なる寸法を配置することにより、二列の可視化行列の例が含まれています。 </li><li>同様の可視化を生成するには、右の左下に現在のシート上で右クリックし、&quot;重複したシート&quot;を選択。 </li><li>あなたがデータに関する新たな仮説の生成を助けることができる興味深い傾向や異常値を識別するために、分析の手順を繰り返す。 </li></ol></li><li>あなたは、同じソースから生成された複数のデータセットを持っており、これらのデータセット間で可能な接続を探求したい。 <ol><li>場札は同じ接続を介してこれらのデータセットに接続できるように、同じブックに同じソース、すなわち場所、2つのスプレッドシートで複数のデータセットを置きます。 </li><li> （図5）複数のデータセットに対して同じである、ディメンションが選択されていることを確認して、キー値の論理的な結合を介してデータセットを接続します。セルのタイプ、刺激の濃度レベル、ステージまたはグループ、刺激、およびサブジェクト識別子：図5で​​は、参加するための5つのキー値があります。 </li><li> 1.1節と同様の分析を実行します。 </li></ol></li></ol> 2。プレゼンテーションベースのニーズ<ol><li>あなたはデータ間の関係​​を知っているが、すぐにプレゼンテーションで使用するための視覚化のリストを生成できるようにしたい。 <ol><li> 1.1節で概説プロトコルに従って、それに応じて視覚に注釈を付ける。 </li><li>視覚の画像を生成するためにタブローのエクスポート機能を使用してください。 </li></ol></li><li>あなたは、タブロー、ブック内の強力な視覚化のセットを生成し、そのブックを共有したいとしている。 <ol><li>タブローのパッケージのブックとしてブックを保存し、このファイルを共有します。 </li><li>タブローのデスクトップのない同僚は、パッケージ化されたブックを開こうとするタブローReaderをダウンロードすることができます。タブローのリーダーは、同僚があなたが作成されていることを視覚化と対話することができます。 </li></ol></li></ol> 3。駐在結果<img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。スクリーンショットタブローのExcelファイルのdemo.xlsからNFKBIAという名前のスプレッドシートをインポートした後。ディメンションおよびメジャーの棚は適切にそれぞれ、と量的データが入力されました。 <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig2.jpg" alt="図2" /> 図2計算されるフィールドのウィンドウは、場札に使用する特殊な計算フィールドを作成するために呼び出されます。左下ボックスのリストには、識別可能なフィールドを支援し、右側のリストには、式で使用できる関数の省略形が含まれています。この例では、我々はPFDとして参照することが最終的な値を得るためにPFD4、PFD3とPFD2のために&gt; 2を値を追加したい<img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。刺激の濃度レベル対観察されたサイトカイン濃度の可視化。可視化は、サイトカインTNF -αの観測濃度に対する刺激3M - 002の異なる濃度レベルのプロットを示しています。線の色は私たちの自然免疫の研究では、個人のNFKBIA遺伝子における一塩基多型のための異なる遺伝子型を参照してください。 <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig4.jpg" alt="図4" /> 図4二列の可視化行列のスクリーンショット。我々は2つ​​の刺激、3M - 003およびLPSに対する応答のside - by - sideの比較を容易にするために2列の行列を生成する。 x軸は、2つの刺激の異なる濃度レベル、およびy軸のプロット計算フィールドの値が、PFD&gt; 2です。 <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。これらのタブローの対話ウィンドウが別のスプレッドシートに記録されたデータを接続する方法を示しています。別のスプレッドシートからの接続データは、キー値の論理的な結合句を使用してこれらを組み合わせることによって達成することができます。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="10">可視化と解析ツール</td></tr><tr><td>機能</td><td>絵画</td><td> VIS -スタンプ</td><td> xmdvtool </td><td>その他のggobi </td><td>星の光</td><td>によって実現さ</td><td> Visulab </td><td> InfoVisツールキット</td><td> Geotime </td><td>呼び起こす</td></tr><tr><td>パラレルプロットを調整する</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td></tr><tr><td>散布図マトリックス</td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td></tr><tr><td>次元の削減</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td></tr><tr><td>時間的次元</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td></tr><tr><td>地理空間の寸法</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td><td>なし</td></tr><tr><td>テキストマイニング</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td></tr><tr><td>データの直接操作</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>なし</td></tr><tr><td>フィルタリング</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td></tr><tr><td>他のプラットフォームへの拡張（例えば、R） </td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td></tr><tr><td> CSVテーブルフォーマット</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td></tr><tr><td> XMLデータフォーマット</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>なし</td></tr><tr><td> 1で対処できます。0000 +の行</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td></tr><tr><td>ドキュメント</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td><td>はい</td></tr><tr><td>商用製品</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>はい</td><td>はい</td></tr></tbody></table>視覚的な分析ツールとその機能のいくつかの表1。一覧。

<ol>
	<li>Thomas, J., Cook, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Path:+The+Research+and+Development+Agenda+for+Visual+Analytics.">Illuminating the Path: The Research and Development Agenda for Visual Analytics.</a> , (2005).</li><li>Steed, C., Swan, J., Jankun-Kelly, T., Fitzpatrick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+Analysis+of+Hurricane+Trends+Using+Statistical+Processes+Integrated+with+Interactive+Parallel+Coordinates.">Guided Analysis of Hurricane Trends Using Statistical Processes Integrated with Interactive Parallel Coordinates.</a> IEEE Symposium on Visual Analytics Science and Technology. , 19-26 (2009).</li><li>Saraiya, P., North, C., Lam, V., Duca, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Insight-Based+Longitudinal+Study+of+Visual+Analytics.">An Insight-Based Longitudinal Study of Visual Analytics.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 12, 1511-1522 (2006).</li><li>Kollmann, T. R., Crabtree, J., Rein-Weston, A., Blimkie, D., Thommai, F., Wang, X. Y., Lavoie, P. M., Furlong, J., Fortuno, E. S., Hajjar, A. M., Hawkins, N. R., Self, S. G., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+innate+TLR-mediated+responses+are+distinct+from+those+of+adults.">Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults.</a> J. Immunol. 183, 7150-7160 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

現代の生物医学研究におけるハイスループット技術の出現は、分析のより効率的な方法を必要とする研究データの爆発につながった。視覚的な分析（VA）は、インタラクティブな視覚インタフェース（1）により促進分析推論の科学である。 VAのアプローチは、コンピュータによってパターンを検出する従来のアプローチとは逆に人間のアナリストの手で分析能力を、復元します。視覚的な分?...

facilitating the analysis of immunological data with visual analytic techniques

視覚的な分析（VA）は、インタラクティブな視覚的なディスプレイを介して大規模なデータセットを分析する新しい方法として浮上している。我々は、ユーティリティと生物学的データセットの分析のVAアプローチの柔軟性を示した。免疫学におけるこれらのデータセットの例としては、フローサイトメトリー、ルミネックスのデータ、およびジェノタイピング（例えば、一塩基多型）のデータが含まれています。伝統的な情報の可視化のアプローチとは対照的に、VAは、アナリストは、リアルタイムのデータの探査のプロセスに関与できるようにすることで、アナリストの手で分析力を復元。我々は、いくつかのVAツールを評価した後、タブローというVAソフトウェアを選択する。解析作業データセット内との間で分析の2つのタイプは、アプローチペア解析と呼ばれるを使用してビデオのプレゼンテーションで示された。 VAで定義されているようなペアの分析には、、VAツールの専門家が分析中に、ドメイン専門家とのサイドバイサイドの動作する​​分析手法です。ドメインの専門家は、データの重要性を理解し、収集したデータは対応するかもしれないという疑問を求める人です。ツールの専門家は、これらの質問に答える可能性のあるデータのパターンを見つけることができるようにビジュアライゼーションを作成します。仮説生成とデータの迅速な視覚的な表示との間の短い遅れ時間は、VA方式の主な利点です。

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Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

視覚的な分析（VA）は、対話的にデータを分析の新しいアプローチです。このビデオでは、我々はハイスループット生物学的実験によってもたらされるデータの過負荷の問題を議論し、そのような問題に対する解決策として、VA提案する。ビデオでは、内と場札と呼ばれるVAツールを使用して免疫学的データセット間の分析を示しています。

ビジュアル分析手法と免疫学的データの解析を容易に

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K ビュー.  University of British Columbia. 視覚的な分析（VA）は、対話的にデータを分析の新しいアプローチです。このビデオでは、我々はハイスループット生物学的実験によってもたらされるデータの過負荷の問題を議論し、そのような問題に対する解決策として、VA提案する。ビデオでは、内と場札と呼ばれるVAツールを使用して免疫学的データセット間の分析を示しています。

ビデオ: Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

免疫・感染学

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

デュアルカラータイム·ゲーティッド誘導放出枯渇（STED）ナノスによる免疫シナプスの可視化

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically explore characteristics of their cellular samples. However, these technological advancements yield high-dimensional data sets that have become increasingly difficult to analyze objectively within traditional manual-based gating programs. In order to better analyze and present data, scientists partner with bioinformaticians with expertise in analyzing high-dimensional data to parse their flow cytometry data. While these methods have been shown to be highly valuable in studying flow cytometry, they have yet to be incorporated in a straightforward and easy-to-use package for scientists who lack computational or programming expertise. To address this need, we have developed ExCYT, a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that streamlines the analysis of high-dimensional flow cytometry data by implementing commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction by t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots. Additionally, ExCYT provides traditional gating options of select populations of interest for further t-SNE and clustering analysis as well as the ability to apply gates directly on t-SNE plots. The software provides the additional advantage of working with either compensated or uncompensated FCS files. In the event that post-acquisition compensation is required, the user can choose to provide the program a directory of single stains and an unstained sample. The program detects positive events in all channels and uses this select data to more objectively calculate the compensation matrix. In summary, ExCYT provides a comprehensive analysis pipeline to take flow cytometry data in the form of FCS files and allow any individual, regardless of computational training, to use the latest algorithmic approaches in understanding their data.

ExCYT is a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that allows users to analyze their flow cytometry data via commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction via t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots.

ExCYT: 高次元フローサイトメトリー データの分析を合理化するためのグラフィカル ユーザー インターフェイス

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

クリプトコッカスの研究における顕微鏡技術と蛍光読解の補完的利用-アメーバ相互作用

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

マウス子牛に対する一貫したマッサージ様摂動の適用と、結果として生じる筋肉内圧変化のモニタリング

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...