<p class="jove_content"&gt;私たちは、優れた畜産用Nadeshdaウルフ、ナディーンEschenとスザンヌデロングに感謝します。 CWは、ヘルムホルツのプログラム &quot;から博士号フェローシップによってサポートされていました<em&gt; BioInterfaces</em&gt;国際大学院 &quot;（BIFIGS）。さらにサポートがCGにKIT-RISCの助成金によってと7欧州共同体フレームワークプログラム内のマリー·キュリー国際社会復帰グラント（PIRG07-GA-2010から267552）によって提供されていました。マリーキュリー初期研修ネットワーク（238821） - AHSは（肝臓と膵臓の開発と疾病の生物学）BOLDによってサポートされていました。 ULはDopaminet FP7（第7次フレームワークプログラム）（223744）によってサポートされていました。</p&gt;

1。動物の取り扱いチンアッセイのためにホモ接合性の二重トランスジェニックcldnB間のグループ交配から生じる3 DPFの幼虫を使います:: GFP / lysC :: DsRed2のとAB（野生型）魚を。自然産卵による受精卵を収集し、29で、それらを上げる°ペトリ皿のE3培地中のC（5 mMの塩化ナトリウム、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMのCaCl 2を 、0.33 mMのMgSO 4を 、青の0.1％メチレンブルー液、pH7.0に平衡化した）。これは、プレート当たり50から70を超えない胚の密度を維持するために不可欠である。 2。ソート幼虫蛍光レポーターの発現、自発的な炎症と適切な年齢に関連する開発のための蛍光立体の下にあるすべての幼虫を確認してください。 3。スクリーニング培地の調製（常に新鮮な準備） DMSO（最終1％）、MS222（0.05 g / l）を補充したメチレンブルーせずにE3培地を準備します。 4。硫酸銅準備（常に新鮮な準備） 最初のCuSO 4を量る（M R = 159.6グラム/モル）とのdH 2 Oでの20mMストック溶液を調製120μMのCuSO 4の作業E3/DMSOの溶液（20 mMストック溶液から）（1％）/ MS-222を準備します。光からのCuSO 4ソリューションを保護します。 5。 384ウェルプレートの準備（グライナー384ウェルマイクロプレート） リバースピペッ​​トで各ウェルにE3/DMSO（1％）/ MS-222の20μlを事前に追加します。増加したピペットチップの穴は、任意の負傷を負わせずに慎重に胚を処理するために必要とされる、これは内径2 mmの先端を切断することによって行われます。各ウェル（未処理コントロールの84μl）に培地74μlを単一の幼虫を転送します。必要な場合は、ウェル内の横位置で向きの幼虫は、柔軟なエッペンドルフMicroloaderピペットチップ（; 5242 956.003エッペンドルフ）を使用します。 ロボットの液体で、以下のすべての液体処理の手順を行うすべての幼虫の同時処理を確実にするためにワークステーションを処理します。 6。薬物治療上下にピペッティングして、薬物ストックプレートの化合物を5回混ぜる。各ウェルに7.5Xの薬物ストックプレートの16μlを加え、5回混ぜる。幼虫の損傷を防止し、10μL/ sの速度で培地を分注するためのウェル内の先端の位置を調整します。ウェル内の薬剤の均一な分布を確保するため、ウェル内の培地を4回混ぜる。 7。インキュベーション 29で1時間インキュベートするスクリーニングプレート°C、光から同様のCuSO 4などの化合物を保護するために、アルミ箔で覆われている。 8。化学傷害ネガティブコントロール、ミックスの4倍を除き、各ウェルに120μMのCuSO 4ワーキング溶液10μlを加え、29℃で1時間のために再度インキュベート℃に 9。洗濯私の80μlを削除し、交換<html>化合物及びCuSO 4を削除する各ウェルに二回（20μlのステップ）からdium。 10。画像収集 90分後の初期の銅処理：倒立自動化された顕微鏡（Olympusスキャン^ R IE）で画像取得を開始します。右と左後部側線からneuromastsが表示されるように初期のzレベルを設定します。 4倍対​​物レンズ（NA = 0.13）を使用して、4フォーカルプレーンのチャネル明、Cy3およびGFP（50μmの距離）が毎時各ウェルに一度画像。 画像やデータ処理に関する追加情報のリクエストも承ります。 11。画像処理 1。データのソート RAW画像は、私たちのカスタムLabVIEWソフトウェアのスクリプトで処理されます。画像処理パイプライン内の最初の操作は、チャネル、よく、時間の点情報を用いて顕微鏡に生成されたデータのフォルダからRAW画像の選別されています。 ove_step &quot;&gt; 2。拡張焦点その後、ソフトウェアは、チャネルごとに4フォーカルプレーンから拡張されたフォーカスのイメージを作成します。 3。 RGBオーバーレイ最後のステップでは3つのチャネルから拡張された焦点画像は、最終的なRGB-オーバーレイイメージにつながることがマージされます。 4。自動化された感丘の検出パターン認識ツール（LabViewのラピッドプロトタイピングIAツール）は、RGBオーバーレイ画像内neuromastsを識別し、neuromasts周りに興味のある経験的に定義された領域を作成します。 5。定量化負傷したneuromastsを取り巻く興味のある経験的に定義された領域内に赤色蛍光白血球（赤ピクセルとして反映されています）lの eukocytes（Paol）によってccupied P ercent REA Oの主な読み出し、その結果獲得しています。平均95.27±2.11パーセント（FDA1）および95.12±でウェル（幼虫）の1.56パーセント（FDA2）が正しく検出された、その後、さらにデータ処理が施されています。生データ出力（検出された各感丘のためにPaol）txtファイルに格納され、さらに生データを処理するMATLABスクリプトのデータ入力として機能します。 12。データ処理 1。IMAPS カラーコードの生データの出力Paolのグラフィカルな可視化によって、個々の実験の成功を評価する、いわゆる炎症マップ（IMAPS）（ 図2）を実現することができます。明るい緑色は、高い初期の炎症指数を反映して、黒は炎症がないことを示します。この簡単な概要については、さらにデータ解析から除外することができます失敗した実験の迅速な同定が可能になります。 2。コントロールのアベレージングそれぞれの実験板は、反射320の化合物が含まれています化合物と時間がポイントごとに単一のデータポイントと同様に32ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、それぞれ。 32コントロールが複製の平均と標準偏差が計算されています。コントロール用の2標準偏差内でのみのデータポイントが含まれています。 3。正規化正規化は、スプレッドシートの分析によって行われます。ネガティブコントロールであるDMSOの平均値は、0に設定され、銅の制御のための最高平均Paolは、正と負の制御の間の最大差は1に設定されているので、1に設定されます。各化合物のPaolは、線形補間または実験的なプレート上の各コントロールに外挿されます。 4。最終的な読み出し：炎症性インデックス十分な複製実験（すなわち15）が行われてきた後に、反復実験から正規化された生データを読み出し、最終的な結果として、平均化され - 炎症インデックス。銅コントロールの初期の炎症指数は、時間点ゼロの100％から始まり、画像取得の開始時間（初期の銅処理後90分）に相関しています。 5。単調な指数回帰の当てはめ我々が使用して初期の炎症に向かって単調な指数関数的非線形回帰の当てはめを行う時間の経過とともに炎症の解決のために<img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="式（1）" /> - 0は t = 0で初期応答の尺度である、1時間以上の大きさのスロープに関連しています。 6。 2-D特徴空間プロット（ 図4） 特徴空間を生成するために、非線形回帰が適用され、クラスター分析は、このように異なる免疫調節カテゴリから興味深い候補の自動識別（抗inflammatを可能にする、特徴的な領域に特徴空間を分割するORY、抗解像度、炎症性、プロの解像度）。すべての化合物は、パラメータを0と1に基づいて2次元プロットに表示されます。 13。データの取り扱いと保管ユーザ10によって要求されたときに我々のデータ処理ルーチンは、画像やデータ処理の手順&quot;結果の概要だけでなく、詳細なビューを提供するような薬剤の画面を視覚化し表現するためにWebページを作成します。他の関連異種の生物·化学データベースへのソフトリンクは、比較と新規研究11の貴重なリソースを提供するだけでなく、統合されています。これらのルーチンによって、適切なデータ標準とメタ情報がこのデータの長期保存のために設定されています。 14。代表的な結果パイロットの画面では、640から成るライブラリを分析したFDAはgranulの開始、進行や解像度への影響について知られている生理活性物質を承認ocytic炎症反応。抗炎症薬（1）、抗分解能（2）、（3）炎症誘発性およびプロ解像度（4）：観察された効果に基づいて、我々は、アクションの異なるモードを示すことができる免疫調節表現型の4種類に分類、その単調な非線形回帰フィッティング（E AO + ALX - ）から発生するパラメータの0と1で記述することができます初期の炎症に向かって。 0 1一方、炎症反応の大きさを表す曲線の傾きを特徴づけるため、炎症の解像度を説明しています。 2-D特徴空間プロット（0対1）ですべての化合物を表示すると、別の免疫調節のカテゴリからヒット候補（ 図3）の自動識別が可能になります。 640化合物のうち、45は50％以下に初期の炎症性インデックスを減らすことによって、有意な抗炎症効果を発揮。 THI内でのカテゴリは、我々は、6の化合物は我々のアプローチの妥当性を確認した非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）の薬理学的クラスに属するが見つかりました。しかし、NSAIDは最も強力な抗炎症薬の中ではないランクインしています。別に我々はこのような例では、アンジオテンシン受容体拮抗薬（ARB）、抗生物質とプロトンポンプ阻害剤のようないくつかの追加の薬理学的薬剤クラスを発見した非ステロイド性抗炎症薬から。 7の化合物は潜在的なプロの高解像度薬の経験的に定義されているしきい値基準を満たしていた。 18薬は、陽性対照に比べて負傷したneuromastsに誇張された白血球動員の結果、炎症性効果を発揮する。 唯一の2化合物は、炎症反応のタイムリーな解決を妨げた。 パイロット画面coulからいくつかのヒット候補の抗炎症作用（上記の薬理学的薬剤クラスからの典型的な候補者）dは、後続の二次チンアッセイ（データは示さず）で用量依存的に確認することができます。主画面に加わるように4潜在的なプロ解像度薬の再テストは、アクションの指定されたモードを確認していませんでした。薬の2が高濃度（20μM）で若干の抗炎症の可能性を持っていた。 20μM - 第三薬剤は5に至るまでの薬物濃度限界以外の用量依存性の抗炎症効果を示した。第四の薬剤は、試験した濃度で炎症反応に影響を及ぼさなかった。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> 図1。チンアッセイのワークフロー。個々の化合物トランスジェニックcldnB :: GFP / lysC :: DsRed2の幼虫（3 DPF）は、手動で384ウェルマイクロタイタープレートで配布されています。薬はよくゼファー小型液体ハンドリングワークステーションを使用して、それぞれに同時に追加されます。アッセイプレートを29℃で1時間インキュベート℃でのCuSO 4を用いた治療</sub&gt; - 負傷を与え、1時間溶液（1​​0μM最終濃度）と急性炎症反応を開始します。最後に、銅溶液や薬剤が洗い流され、自動化された画像の取得は（初期の銅処理後90分）に開始されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> 図2。 Raw画像の概要画像図4の焦点面（Z = 0から3）のRAW画像が表示されます。それぞれ、チャネルCy3標識（左）とGFP（右）で50μmの距離であります。矢印は、（Z = 1,2）の例示的なneuromasts、neuromasts周りにクラスタ化された白血球の矢印（Z = 1,2）の点を示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> 図3。炎症マップ（IMAPS）個々の実験の成功はカラーコードで炎症反応（生データ）を反映しIMAPSで評価することができる。明るい緑は高い初期インフレを反映している<html> mmatory応答;。黒はなく、炎症がないことを示しタイムポイント0でIMAPS（左）とタイム·ポイント5（右）がはっきりと実験は、さらにデータ処理に含まれるべきであるかどうかを示します。 DMSO対照ウェル（1行目と12）は暗い緑または黒で表示され、一方銅コントロール（行13および24）は、緑の色合いを変化させるに表示されます。時間点5で、炎症はほとんどが緑色または黒の暗い色合いに示すように、銅コントロールで解決されています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> 図4。 FDAの320化合物の2次元特徴空間のプロットは、ライブラリとそれぞれのコントロールを承認したすべての化合物の井戸が非直線に起因するパラメータは0と1に基づいて2次元特徴空間プロットで表示することができます回帰継手（d/4203/4203eq1.jpgの &quot;alt =&quot;初期の炎症に向かって/式（1） &quot;&gt;）が、この特徴空間のプロットは、薬物を示すことができる次の4つの免疫調節のいずれかのカテゴリに属する​​興味深い候補の自動識別することができますアクションの&quot;モード：抗炎症作用（1）、抗分解能（2）、（3）炎症誘発性およびプロ解像度（4） <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

<ol>
	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

<p class="jove_content"&gt;ここでは、全体の動物のコンテキスト内で免疫調節化合物の同定を可能にする完全に自動化されたハイスループットスクリーニング戦略を提示します。したがって、急性炎症反応のモニタリングを可能にする<emin vivoでの&gt;</em&gt;とリアルタイムインチ</p&gt;<p class="jove_content"&gt;我々は、傷への白血球動員に対する薬物の影響が完全に機能する自然免疫系の文脈で比較的容易に学ぶことができるので、創薬や薬物再利用の取り組みのための貴重なモデル生物としてゼブラフィッシュを適用するプロトコルを提供しています。我々のアプローチのユニークな利点は、化学負傷はこのように高スループット形式で自動化し、スクリーニングを可能にして、廃止されたマニュアル幼虫の操作をレンダリングするという事実である。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;さらに、有害または有毒な薬剤の効果と同様に強力なオフターゲット効果を簡単にセットアップ提案と評価することができる。 FDA承認されたライブラリは、しかし、与えられたスクリーニング濃度での毒性化合物を含んでいませんでした。それにもかかわらず、我々は、テストライブラリの同じ薬理物質のクラスに存在するメンバー間で利用可能なデータ（例えば、免疫調節表現型、薬物濃度）を比較することが明らかに毒性の化合物について提案する。あるが必要な場合は、それ以外の有望な免疫調節表現型を発揮する物質ファミリーの毒性メンバーは、より低い濃度で再テストすることができます。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;私たちは彼らの働く免疫調節効果に応じて自動的に分類する治療薬の可能性を実証した。抗炎症性化合物のカテゴリに属する​​薬剤は、独立した実験では、用量依存的にその効果を発揮する化合物の大部分で検証することができます。潜在的なプロ解像度の薬物として同定され、4つの化合物は、これまでのように確認することができませんでした。それはまた、単に解像度に影響を与えない薬はこれまで文献に記載されていないので、この特定の免疫調節カテゴリは、説明するのは困難であることを示しています。しかし、4再テスト薬の3は、高いモル濃度で抗炎症傾向を示した。経験的に定義したしきい値条件を最適化する偽陽性の数を減らすことに役立つはずです。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;また、紹介したテクニックは、白血球遊走動作に影響を与える遺伝子の突然変異の同定に利用される可能性を提供しています<sup&gt; 8</sup&gt;。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;結び、提案手法では薬剤耐性、毒性、用量ならびに潜在的なオフターゲット効果で容易に入手可能な情報を潜在的な新たなリード構造をもたらす努力を転用、創薬や薬剤を容易にし、加速することができます。したがって、医薬品開発の初期段階で、シンプルでコストと時間を節約する戦略として機能します。</p

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ジメチル·スルホキシド</td><td>カール·ロート社＆株式会社KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td>銅（II）硫酸塩、無水</td><td>カール·ロート社＆株式会社KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDAは薬のライブラリを承認</td><td>エンツォ生命科学</td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384ウェルプレートの非結合、μClear </td><td>グライナー</td><td> 781906 </td><td>黒</td></tr><tr><td>オリンパススキャン^ R </td><td>オリンポス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゼファー小型液体ハンドリングワークステーション</td><td>キャリパー</td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

に投与したときにゼブラフィッシュの幼虫はその小さなサイズと相対的な操作や観察のしやすさだけでなく、化合物は、単に入浴水に添加することができ、容易に吸収されているという事実に起因する1,2 -全動物の小分子の画面に特に適している&lt;1％DMSO溶液。ゼブラフィッシュの幼虫および白血球の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック系統の可用性の光学的透明性のために、ゼブラフィッシュでは、in vivoでの急性炎症反応を監視するためのユニークな利点を提供します。その結果、高スループットの免疫調節化合物の同定を目指して、高含有量の小さな分子の画面のゼブラフィッシュを利用することは、炎症誘導のシナリオは、フィン組織のローカライズされたニックをEGの卵黄の表面に向けレーザー損傷を示唆する、3-6提案されている胚7または尾翼の切断3,5,6。これらのメソッドの主な欠点は、しかし、であったマニュアル幼虫操作の要件は、このようにハイスループットスクリーニングを防ぐために、負傷を誘導する。化学的に誘発される炎症（顎）アッセイ8の導入は、これらの障害を排除した。負傷を負わされているので、化学的に同時に扱うことができる胚の数は事実上無制限です。硫酸銅とゼブラフィッシュの幼虫の一時的な治療を選択側線系と負傷者neuromastsへの迅速な顆粒球動員の結果の有毛細胞に細胞死を誘導する。炎症反応は、化合物トランスジェニックcldnB :: GFP / lysC ::感丘細胞と同様に、赤色蛍光タンパク質標識顆粒球における緑色蛍光タンパク質を発現DsRed2の6,9ゼブラフィッシュの幼虫を使用してリアルタイムに追跡することができる。 両方の高いコンテンツと高スループット分析を可能にするであろうスクリーニング戦略を考案するために、我々は、ロボット液体ハンドリングと組み合わせた自動化されたMICRを導入しましたカスタム開発されたソフトウェアスクリプトを使用してoscopy。このスクリプトでは、負傷した緑色蛍光neuromastsを取り巻く経験的に定義されたエリア内の赤色蛍光白血球によって占め％の領域を獲得して炎症反応の自動定量化を可能にします。さらに、自動データ処理、処理、可視化、ストレージのすべてのカスタム開発され、MATLABやPythonスクリプトに基づいています。 要するに、我々は、顆粒球の炎症反応の開始、進行や解像度への影響について化学化合物のテストを許可する自動化されたHC / HT画面をご紹介します。このプロトコルは、自然免疫応答のオーケストレーションに関与する薬物のメカニズムと経路のより詳細な分析のための良い出発点を提供しています。将来的には、創薬の初期段階では耐えられない毒性やオフターゲット効果を識別する助けとすることにより薬剤開発のための手続きのリスクとコストを減らすことができます。

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Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

ここでは、免疫調節活性物質の同定を目指した新規な高含有化学的に誘発される炎症アッセイを説明します。我々は正常、炎症反応だけでなく、さらに、データ処理、解析、マイニング、およびストレージの自動定量化を可能にするカスタム開発したソフトウェアのスクリプトで自動化された顕微鏡を組み合わせています。

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K ビュー.  Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany. ここでは、免疫調節活性物質の同定を目指した新規な高含有化学的に誘発される炎症アッセイを説明します。我々は正常、炎症反応だけでなく、さらに、データ処理、解析、マイニング、およびストレージの自動定量化を可能にするカスタム開発したソフトウェアのスクリプトで自動化された顕微鏡を組み合わせています。

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Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

から卵を使用して、<em&gt;マンソン住血吸虫</em&gt;として<emインビボ&gt;</em蠕虫によって誘発される肺の炎症の&gt;モデル

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

免疫・感染学

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

タングウイルスに対する新規抗ウイルス剤の同定のためのアッセイ

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;結核病変における薬物侵入を予測するカゼウム結合アッセイ

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Methods Article

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する