この方法は、生物学的に関連する亜集団の表現型を理解するなど、生物医学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、プログラミング経験のない個人が最新の高次元技術でサイトメトリーデータを分析できることです。分析パイプラインを開始するには、まずサイトメトリーのタイプと、ファイルからサンプリングするイベントの数を選択します。
次に、[ゲートの母集団] をクリックし、対象のセルの母集団を選択して、ダウンストリーム分析のイベントの割合を入力します。次に、解析に使用するチャネル数をリスト ボックスで選択します。T 分散ストチャスティック隣接埋め込みまたは t-SNE 解析の場合は、[t-SNE] をクリックして、次元の削減データセットの計算を開始します。
セットが計算されたら、[TSNE イメージの保存] をクリックし、[マーカー固有の t-SNE] ポップアップメニューで、対象の特定のマーカーを選択します。図は、図の生成のために保存できる t-SNE プロットのヒート マップ表現を示す表示されます。クラスタリング分析を開始するには、[クラスタリング方法] ボックスの一覧でオプションを選択し、[クラスター] をクリックします。
目的のマーカーでクラスターを並べ替えるには、[並べ替え] ポップアップメニューから適切な対応するオプションを選択し、[昇順]、[降順] をクリックして、[クラスター] リスト ボックスのクラスターの一覧を更新します。特定のチャネルの特定のクラスターに最小しきい値を設定するには、「しきい値」ポップアップメニューからオプションを選択し、適切なしきい値を設定します。しきい値を設定したら、[しきい値の上に追加] または [しきい値以下に追加] をクリックしてしきい値の方向を指定し、[クラスター フィルター] パネルの [クラスター周波数しきい値] ボックスに数値のカットオフを入力して、クラスターの頻度に最小しきい値を設定します。
さらに個別に分析するクラスターを選択するには、[クラスター] リスト ボックスで対象のクラスターを選択します。また、[選択] ボタンを使用して、オプションを [クラスター分析] リスト ボックスに移動します。クラスターのヒート マップを作成するには、[クラスター分析] リスト ボックスで対象のクラスターを選択し、[クラスターのヒートマップ] ボタンをクリックします。
高次元の箱ひげ図または高次元フロープロットを作成するには、[クラスタ解析]リストボックスで対象のクラスタを選択し、[高次元ボックスプロット]または[高次元フロープロット]をクリックして、すべての次元にわたるさまざまなクラスタの特定のチャネルの分布を視覚的に評価します。従来の 2D フロー プロットでクラスタを表示するには、[従来のフロー プロット]パネルで適切な変換とチャネルを選択し、[従来のフロー プロット]をクリックします。ここでは、骨髄系パネル解析パイプライン内の各種マーカーのヒートマップの代表的なt-SNE分析を示す。
ExCYT 内の高速貪欲な実装を使用して、最も近い隣接する 100,000 個のデータをクラスター化すると、19 個のセルのサブ集団が明らかになった。元のヒートマップをExCYTによって作成されたクラスターと比較することで、2つのデータグループ間で骨髄細胞の同様のクラスターを同定することができました。より従来の高速な階層クラスタリングアプローチを用いたリンパパネルの分析は、t-SNEヒートマップを介して同様のマーカー分布を生み出した。
また、階層クラスタリングを介したデータのクラスタリングは、リンパ球細胞の類似したクラスターを示した。特に、独自の制御性T細胞集団も高次元フロープロットを介して同定された。マーカー間の連想を迅速かつ定量的に評価するために、まずハードK平均クラスタリングアルゴリズムを使用して、2次元t-SNEデータに5000クラスタを配置しました。
その後、すべてのクラスターからすべてのマーカーの中央値の式を使用して、これらのクラスターからヒートマップを作成し、Tim-3、PD-1、CD38、4-1BBの共連性などの関連付けを容易に識別できるようにしました。この手順を試みる際は、学習しているデータを完全に調べるには、さまざまなクラスタリング方法など、さまざまなパラメータを確認する必要があります。
