この手順の全体的な目的は、その環境捕食者アメーバによって病原性真菌種クリプトコッカスネオフォルマンの貪食を研究するためのツールとして顕微鏡を使用することです。このビデオでは、共焦点レーザー走査顕微鏡と透過電子顕微鏡を用いて研究するクリプトコッカス細胞とアメーバの共培養を準備するためのプロトコルについて詳しく説明します。これらの技術を使用して得られた情報は、感染中に内在化したクリプトコッカス細胞の挙動に関する洞察を流す可能性がある。
YPD寒天プレート上のテスト真菌株を抜き出す。プレートを摂氏30度で48時間インキュベートします。48時間齢のプレートからループ状の細胞を削り取り、4%グルコースを補充した100ミリリットルのYNBスープを含む250ミリリットルの円錐形フラスコに接種します。
回転式シェーカーでフラスコを摂氏30度で24時間インキュベートします。24時間のインキュベーション期間の後、ヘモサイトメーターを使用して真菌細胞を数え、生理学的緩衝液を用いて細胞数を1ミリリットル当たり100万個の細胞に調整する。ペプトン酵母エキスグルコーススープでアメーバ細胞を摂氏30度で1週間培養します。
ヘモサイトメーターを使用してアメーバ細胞を数え、新鮮な無菌ATCC培地712で1ミリリットル当たり1000万個の細胞に細胞数を調整します。これに続いて、トリパンブルーの染色を用いて生存アッセイを行う。少なくとも 80% 生存率を示す細胞を操作することをお勧めします。
標準化されたアメーバ細胞の200マイクロリットルの懸濁液を付着スライドのチャンバーに分配する。セルが30°Cで表面に付着するまで2時間かかります。アメーバ細胞が落ち着いている間、フルオレセインイソチオシアネートで標準化されたクリプトコッカス細胞を染色します。
真菌細胞を室温と暗闇の中で2時間静かに攪拌します。すでにアメーバ細胞を含む適切なチャンバーに洗浄した後、染色されたクリプトコッカス細胞の200マイクロリットルの懸濁液を分配する。さらに2時間の間、摂氏30度で準備した共文化をインキュベートします。
コインキュベーション期間の終わりに、PBSでチャンバーを2回洗浄して、非内在性クリプトコッカル細胞を含む非結合アメーバ細胞を除去します。細胞を固定するために使用したグルタルアルデヒドを吸引し、チャンバーをPBSで2回洗浄した。チャンバースライドを解体します。
共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて共培養細胞を見る。上記アッセイを補完するために、クリプトコッカス細胞をpHrodo色素で染色し、食品液胞内に閉じ込められた細胞の読み取りを選択的に可能にする。これらの染色された細胞を、既に播種されたアメーバ細胞を含む黒い付着マイクロティタープレートのウェルに分配します。
対数信号を相対的な蛍光単位に変換できるマイクロプレートリーダーで蛍光を測定します。標準化されたアメーバ細胞の5ミリリットルを既に含んでいる同じ遠心管に標準化されたクリプトコッカル細胞の5ミリリットルを追加します。チューブを摂氏30度で2時間放置します。
遠心後に上清を吸引する。pH 7で3%グルタルアルデヒドを3%緩衝したリン酸ナトリウムの1モルで共培養細胞を表すペレットを3時間固定する。共培養細胞をリン酸ナトリウムバッファーで一度洗います。
同様に緩衝した1%オスミウム四酸化された後に洗浄を行い、1時間半再び固定します。30%50%70%95%と100%の等級アセトン系列で共培養細胞としても知られているTEM材料を脱水し、それぞれ15分間。ここで、2つの変更で最後の脱水ステップを繰り返す。
正常な一貫性のエポキシを計量してエポキシ樹脂を調製します。エポキシ樹脂に材料を埋め込みます。70°Cで8時間、TEM材料を重合します。
ウルトラトームに取り付けられたガラスナイフで16ナノメートルの切片をカットします。ウラニル酢酸で10分間のセクションを汚し、続いて10分間クエン酸鉛を、暗闇の中で。透過型電子顕微鏡で切片を見る。
例証的な目的のために、ビデオでは、3-ヒドロキシ脂肪酸を産生する2つの分離株と、3-ヒドロキシ脂肪酸を産生しない2つの分離株を調べる。クリプトコッカスとアメーバの間のインタラクティブな瞬間を示すスナップショットを次に示します。
要するに、内在化の前後のクリプトコッカス細胞が観察される。食細胞化を研究する際には、ライブイメージングを利用するのが理想的です。しかし、研究者が食細胞化のプロセスを継続的に進めるために、このような顕微鏡にアクセスできるわけではありません。
この制限を補うための可能な解決策は、相対的な蛍光単位の読み取りを通じて定量的なデータを持つ画像を補い得る。棒グラフは、画像を補完するために使用したデータの例です。重要なのは、画像の形式の定性的データと定量的データの両方が、時間の経過とともに異なる時点で取得できることです。
すべての情報を突き出すことによって、貪食の過程で何が起こるかのより大きなイメージを構築し始めることができます。定量的データから、3-ヒドロキシ脂肪酸を有する細胞は、内在する細胞が少ないため3-ヒドロキシ脂肪酸を産生しない細胞と比較してアメーバ作用の影響を受けにくいことが明らかである。TEMは、高解像度のパワーのために食品の空腔に鳥瞰図を与えることができるので、特に強力なツールであり、これはライブイメージングだけでなく、静止画を調べるときにしばしば見逃される詳細の一種です。
この特定のTEM顕微鏡写真では、クリプトコッカル細胞の表面上の突起がはっきりと見える。これまで、これらの細胞表面構造は、3−ヒドロキシ脂肪酸が周囲の環境に放出されるチャネルであると理論化した。要するに、これらのチャネルは、アメーバの食品液胞内に3−ヒドロキシ脂肪酸を送達して内部条件を変化させるのに役立ち、したがって細胞生存の促進をもたらす。
pHrodoまたはFITCのようなは、食品の液胞内のように、低pHでのみ蛍光を発するので、はるかに良い染色かもしれません。具体的には、pHrodoは、研究者が内部化された細胞に関するデータを得ることを可能にするだけです。この末、細胞は染色前にリン酸緩衝液中に懸濁され、アメーバ培地は中性pHである事が重要です。
透過型電子顕微鏡のオペレータは、結果が歪み、電子爆撃によって微量撮影が損傷する可能性が高いため、適切に断面化するように十分な訓練を受ける必要があります。研究者は、提示されたプロトコルから十分な情報を取り出し、独自の研究でそれらを最適化することができると想定されています。さらに、研究者は、標的代謝産物に対する抗体を開発し、TEM検査中の免疫金標識を含む免疫蛍光顕微鏡検査研究中に適用することもできます。
