著者は、最初のK562 aAPCとmIL21融合ベクターの作成に彼らの仕事のためにローレンスクーパー、Harjeetシン、とLenka Hurtonに感謝します。 この仕事のための資金は、UT MDアンダーソンの医師科学者のプログラム、聖剣帯の財団、およびフレンズの伝説によって提供されていました。

1。バフィーコートから末梢血単核細胞の単離末梢血単核細胞（PBMC）は、白血球除去輸血により誘導された健康なドナーバフィーコートサンプルからをFicoll - Paqueで浮遊密度​​遠心法によって得られる。 <ol><li>をFicoll - Paque遠心分離は、若干変更してあたりの製造者のプロトコルとして行われます。 </li><li> 140mlの最終容積に正常なドナーから血液銀行バフィーコート（典型的なバフィーコートの量が40〜70 mLの場合）にPBSを追加。 </li><li>層をFicoll - Paque（4管）15mLの上にバフィーコートサンプルの35 mLの。 </li><li>ブレーキなしで20分間400グラム間遠心する。 </li><li>をFicoll - PaqueからPBMCを回復する：プラズマのインタフェースを、をFicoll - Paqueの下部にある赤血球を廃棄しないでください。 </li><li> 10分間400グラムで、毎回遠心分離し、PBSでPBMCを三回洗浄する。 </li><li> PBMCを（セクション4）RosetteSepにより単離することができるこの段階では、NK細胞の増殖やNK細胞に直接使用できます</li><li>残りのPBMCを液体窒素で10％のDMSOを含むFBS中で凍結することができます。 </li><li>フィコールを吸引し、2つの50 mLの遠心分離管に手順5から赤血球を集め、PBS（50mLのマークに追加）で3回洗浄、それぞれの時間は、赤血球層の上部は、顆粒球を除去する上清スキミングを吸引除去する。 </li><li>赤血球がNK細胞のRosetteSep精製（ セクション4を参照）のために直ちに使用または4でAlseverのソリューションを等量に格納できる℃で後で使用するために（赤血球は4週間を限度として格納することができます）。 </li></ol> 2。 NK細胞増殖 NK細胞の増殖は、末梢血を使用するか、NK細胞を精製開始することができます。拡大のために使用される末梢血単核球の量が3週間の拡張の終了時に希望するNK細胞の量に基づいて変化させることができる、詳細については、代表的な結果のセクションを参照してください。 （注1を参照） 刺激1 0日目<ol><li>展開される各5 × 10 6 PBMCsをするため、カウント、100 Gyのでガンマ照射器を用いて10 × 10 6 K562 CL9 mIL21を照射します。 </li><li>照射後、NK細胞の膨張媒体（NKEM）のPBSに懸濁するで細胞を洗浄。 </li><li> T75フラスコでNKEM 40ml中の種子10 × 10 6照射K562 CL9 mIL21と5 × 10 6末梢血単核球（1:2比）と37℃のインキュベーター内で直立℃、5％のCO 2を入れてください。 </li></ol> 3日目と5 <ol start="4"><li> 5分間400グラムで、遠心分離により細胞を回収し、新鮮なNKEM（メディア全体のボリュームの新鮮なIL2を加える）とメディアの半分を交換し、培養する。 </li></ol>刺激2 日7 <ol><li>一週間の終わりに培養中の細胞の数を数えます。 </li><li>フローサイトメトリーによる表現型解析のために5 × 10 5細胞を脇に置きます（注2を参照） </li><li>再刺激するそれぞれ5 × 10 6個の細胞の場合は、カウント、100 Gyのでガンマ照射器を用いて5 × 10 6 K562 CL9 mIL21を照射します。 </li><li> （注3を参照）2.5x10合計5個/ mLにNKEMで照射K562 CL9 mIL21（1:1比）を再懸濁しますの等しい数を追加。 </li><li> T75フラスコ中の種子の細胞（フラスコあたり最大50 mL）で。 </li></ol> 10と12日間<ol start="6"><li>セルの数を数える。 </li><li> （注3を参照）、細胞数に基づいて、新鮮なNKEMを使ってメディア全体を変更します。 </li></ol> 14日目<ol start="8"><li>拡張の二週間の終わりに培養中の細胞の数を数える。 </li><li>フローサイトメトリーによる表現型解析のために5 × 10 5細胞を脇に置きます（注2を参照） </li><li>拡張がPBMCから開始された場合はNK細胞はRosetteSep精製プロトコルを使用して展開のこの段階（セクションIVを参照）で精製することができる。拡張は刺激3に進んでNK細胞を精製から開始された場合。 </li><li>精製後にNK細胞（手順8のように）の純度を確認するためにフローサイトメトリーによる表現型解析のために5 × 10 5細胞を脇に置きます。 </li><li>精製されたNK細胞のすべてを（注4を参照）を使用して刺激3に進みます。 </li></ol>刺激3 <ol><li> （注3を参照）、細胞数に基づいてNKEMで照射K562 CL9 mIL21（1:1比）で再懸濁し、NK細胞。 </li></ol> 17と19日間<ol start="2"><li>セルの数を数える。 </li><li> （注3を参照）、細胞数に基づいて、新鮮なNKEMでメディアを変更します。 </li></ol> 21日目<ol start="4"><li>展開の三週間の終わりに培養中の細胞の数を数える。 </li><li>フルNK細胞の表現型の抗体のパネルのためのフローサイトメトリー解析のための1 × 10 6細胞を（表1を参照）回復する。 </li><li>将来の使用のためのバイアルあたり5 × 10 7細胞の最大密度で10％のDMSOを含むFBSで細胞を凍結する。 </li></ol> 3。 NK細胞の細胞傷害性アッセイ<ol><li> NKEMにおけるNK細胞と種のバイアル、PE前日に解凍回復を可能にするために細胞毒性アッセイをrforming。 </li><li>単一のターゲット細胞株を用いてそれぞれのNK細胞の細胞毒性アッセイの場合、6 × 10 5 NK細胞と3 × 5ターゲット細胞（注5を参照）が必要です。 </li><li> NKEMにカルセイン- AMを（在庫1 DMSOのmg / mL）に希釈することによりCAM -メディアを準備する（注6を参照）。 </li><li> （注7を参照）CAM -培地1 mL中に10 6の標的細胞を再懸濁します。 </li><li>時々振とうしながら、37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> 1 E：：図1に示すようにT比1 × 10 6細胞/ mLと、対応するU底96ウェルプレート〜10の3ウェルの各々にNK細胞懸濁液の200uLを追加で再懸濁し、NK細胞。 （注8を参照） </li><li> &quot;最大&quot;以外のすべての残りのウェルに完全なメディアの100uLを追加。 </li><li> &quot;最大&quot;に2％トリトンの100uL X - 100を追加。 </li><li> 5その後のEのためのNK細胞の連続希釈を行います。セルの100uLたびに転送することによってT比は、よく混ぜる。最後のウェル（：0.3125:1のT比E）から100uLを捨てる。 </li><li>カルセイン負荷の1時間後、1200rpmで5分間、遠心分離、二回NKEMで標的細胞を洗う。 （注9を参照） </li><li> 1 × 10 5細胞/ mLで標的細胞を再懸濁しますを再カウント。 </li><li> （1 × 10 4 /ウェル）を各ウェルに標的細胞を100μLを加える。細胞接触を開始するには100グラムで1分間遠心。 </li><li> 37℃、4時間、5％CO 2をインキュベートする。 </li><li>一様に放出カルセインを中断するために、100μLのピペッターでピペッティングにより穏やかに文化を混ぜ、細胞をペレットに5分間100グラムでプレートをスピンダウンして気泡をしないように注意しながら新しいプレートに上清100μLを移す。細い針を用いて形成する可能性のある気泡をポップ。 </li><li>蛍光プレートリーダー（励起フィルター485 nmの、発光フィルター530 nm）を用いてプレートをお読みください。ボトムリードが推奨されます。 </li><li> × 100。 - [/（テストリリース - 自発的放出）（自発的な放出は最大放出）]の式に従ってパーセント特異的溶解を計算する</li></ol> 4。 RosetteSepによるNK細胞の精製<ol><li> 50 mlチューブ（：PBMC 100:1 RBC）に、末梢血や拡張された細胞のそれに赤血球の100倍過剰してください。 </li><li>新鮮な赤血球を使用すると、次のステップに進むか赤血球がAlsever sソリューションに格納されている場合、赤血球の数をカウントし、2％FBS三回を加えたPBSと赤血球の適切な（100倍過剰）の量を洗って、1200rpmで遠心分離している場合10分ごとに時間のため。 </li><li>ステップ1.7または末梢血や拡張された細胞の5 × 10 7あたり1mLの最終容量にPBS + 2％FBSでステップ2.10から拡張された細胞由来のPBMCと赤血球を結合する。 </li><li>末梢血や拡張された細胞の1 × 10 6あたりRosetteSepヒトNK細胞の濃縮カクテルの1μLを追加。 </li><li>よく混和して、5分ごとに混合穏やかに室温で20分間インキュベートする。 </li><li>等しい優しくPBS + 2％FBSミックスのボリュームとをFicoll - Paqueの上にレイヤーを追加します。 </li><li> PBMC分離（セクションI）で説明をFicoll - Paque遠心分離の手順を繰り返します。 </li><li>精製後に回収したNK細胞をカウントし、NK細胞の純度（手順8）のためのフローサイトメトリーによってphenotpyingために5x105細胞を脇に置きます。 </li></ol> 5。ノート 注1。NK細胞は、末梢血から、またはRosetteSep精製NK細胞から直接拡張することができます。我々は同じような展開の効率化を指摘しているが、一部のドナーは、拡大する前にRosetteSepによって難易度の浄化、その結果非常に低いN​​K細胞数を持つことができます。 注2。我々は日常的にCD3陰性とCD16 -またはCD56陽性であるものとして、NK細胞を列挙し、拡張時の表現型解析のためにCD56 - FITC、CD16 - PE、およびCD3 - PE - Cy5標識を使用してください。 注3。各メディアの変化や刺激では、2.5 × 10 5 / mLの再懸濁し、細胞が膨張のピークの段階でmL当たり、または200万下のNK / PBMC細胞数を維持する。これは、栄養素の枯渇を防ぎ、最大の拡大と生存を達成するの​​に役立ちます。 注4。NK膨張率は、ドナーに依存しており、刺激の終了時に細胞の1または2の一部は実験的な必要性に応じて凍結させ、一部はさらに拡大することができます。我々は、後で拡張のために凍結細胞を使用して良好な成功を収めている。 注5。我々はNKEMと細胞毒性アッセイをセットアップするためのNKEMの4中に再懸濁さ4 × 10 5カルセイン- AM染色した標的細胞の700 ULSで再懸濁し、7 × 10 5 NK細胞の最小値を使用することをお勧め誤差の余地を可能にするためには。播種標的細胞用マルチチャンネルピ ​​ペットを使用している場合セル（最大6 mLの6 × 10 5〜）の高いボリュームが使用されているメディア流域のサイズに基づいて必要になることがあります。また、推奨されるNK細胞数は、Eのために特別です：T比が高く、Eを使用するため、プロトコルに示す：T比が増加するそれに応じmL当たりNK細胞数（40:1 Eの例：：T比の使用の4 × 10 6細胞/ mL） 注6。我々は、1:500、1:400以下の希釈液を使用して、選択肢の標的細胞株のための予備的カルセイン- AMのローディング滴定を行うことをお勧めします。 1:300、1:200と1:100最大と自発的な放出の間の最適な違いを実現する。 注7。標的として接着細胞株を使用して、最初の非酵素的細胞解離バッファーを用いて、単一の細胞懸濁液を準備する。 ADCCを実行する場合は、CAM -メディアにおける標的細胞の重複チューブを準備する。 注8 ADCCを実行する場合、10:1 Eに対応する3ウェルに同一のNK細胞を追加する：。ADCCのためのT。その他のドナーのために繰り返します。追加の標的細胞に対して、この手順を繰り返します。 注9。ADCC実験を行う場合、カルセイン負荷の45分後に、標的細胞に対するADCCを誘導する特異的抗体の10ugを追加。さらに15分後、1200rpmで5分間、遠心分離、二度完全培地で標的細胞を洗う。 1 × 10 5細胞/ mLで細胞を再懸濁し、プロトコル内の次のステップに進みます。 6。駐在結果<img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。展開がスキームどおりに実行されると、出発物質、1 × 10 9〜10 10細胞（ドナー依存ばらつき）に典型的なNK細胞の収量の範囲として5x106 PBMCを用いて、上記の。図は、NK細胞の倍に膨張を示す（N = 19）、元の製品に存在するNK細胞と比較し（中央値+ / - 四分位）。 <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。展開されたNK細胞はいくつかの例外（CD11b、CD160およびCD244）と展開されていない一次NK細胞に匹敵する様々なNK細胞受容体を発現する。 <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。バフィーコートから末梢血単核球の回収は、ドナーに依存しており、300x10 6から800x10 6の範囲にすることができます。末梢血単核細胞の18％ - NK細胞は2％を含むことができる。拡張セルのRosetteSep精製のため、40〜70％から当日純粋NKセル14の範囲の回復。拡張と浄化の推奨プロトコールに従うことにより、99％のNK細胞の純度が期待できる。 <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。拡張NK細胞は、神経芽細胞腫、AML、骨肉腫や悪性黒色腫（代表的なAMLの殺害は、パーセント特異的溶解として示される）を含む腫瘍細胞株の範囲に対して細胞毒性を示している。

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利害の衝突は宣言されません。

NK細胞の増殖と活性化のメディア（NKEM） <ul><li> 90パーセントRPMI 1640（Cellgro） </li><li> 10％ウシ胎児血清（ギブコ） </li><li> 1Xペニシリン/ストレプトマイシン（Cellgro） </li><li> 1 × L -グルタミン（Gibco社） <ul><li>使用前にメディアを滅菌フィルタします。 </li></ul></li><li> 50 U / mLのIL2（Proleukin、ノバルティスのワクチンおよび診断、株式会社） <ul><li> - 200 IU /μlのストックから希釈した。毎回使用する直前に、メディアの所望の量にIL2を追加。 </li></ul></li></ul> PBMCおよびNK Cellアイソレーション<ul><li>をFicoll - Paque（GEヘルスケア） </li><li> Alseverの溶液（シグマ） </li><li> RosetteSepヒトNK細胞の濃縮カクテル（Stemcellテクノロジーズ） </li></ul> NK細胞の細胞傷害性アッセイ<ul><li>カルセイン- AM（Invitrogen社） <ul><li>ストック溶液は、50μLのアリコートで凍結1mgの/ mLを、店舗にあります。細胞の染色のための必要な希釈を達成するためにNKEM媒体に溶解。 </li></ul></li></ul>抗体 NK細胞の表現型解析のために使用される抗体のリストを以下の表に記載されています。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td>抗体</td><td>テストごとのボリューム</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td></tr><tr><td>チューブ1 </td><td valign="top">アイソタイプFITC アイソタイプFITC アイソタイプFITC アイソタイプFITC FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社</td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td>チューブ2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE - Cy5標識 CD16アレクサ647 FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社</td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td>チューブ3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE - Cy5標識 NKG2D APC FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 R＆Dシステムズ ミルテニーバイオテク社 R＆Dシステムズ BD Pharmingen社 BD Pharmingen社</td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td>チューブ4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE - Cy5標識 CD27 APC FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社</td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td>チューブ5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266（DNAM - 1）PE CD3 PE - Cy5標識 CD160 Alexa647 FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td>チューブ6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244（2B4）PE CD3 PE - Cy5標識 CD197（CCR7）APC FACSバッファー 合計ボリューム</td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 BD Pharmingen社 eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells

ナチュラルキラー（NK）細胞は、感染性微生物や種々の腫瘍に対する免疫監視に重要な役割を果たしている。 NK細胞とin vitroで拡大する機能の利用が限られては、NK細胞免疫療法の開発が制限されています。ここでは、効率的に人工的な抗原提示細胞（aAPC）として、膜結合IL21の発現K562細胞を用いた機能性NK細胞のex vivoでの膨大な量を拡大する方法を説明します。 これまでNK細胞養子療法はT細胞やNK細胞のポジティブセレクションの枯渇が続くドナーの定常状態の白血球除去輸血により得られた細胞の製品を利用してきた。製品は通常一晩IL - 2で活性化し、次の1日目に投与される。ため、末梢血中のNK細胞の低周波から、NK細胞の比較的小さな数字は、臨床試験で配信されている。 in vitroで NK細胞を伝播することができないことは、最適な臨床転帰のために十分な細胞数を生成するための制限要因となっている。 NK細胞のいくつかの拡張（1〜2週間以上5〜10倍）が高用量IL - 2単独2を介して達成されている。自家T細胞の活性化は、地元のサイトカイン3のリリースによって、おそらくまた、NK細胞の増殖を媒介することができる。間葉系間質または人工的な抗原提示細胞（AAPCS）によるサポートは、末梢血と臍帯血4の両方からNK細胞の拡張をサポートすることができます。抗体でコーティングされたビーズで組み合わせてNKp46とCD2活性化は、現在21日間で約100倍に拡大、その結果、NK細胞の拡大（Miltenyi Biotec社、オーバーンカリフォルニア州）のために販売されている。 aAPC -拡張使用するか、活性化NK細胞の臨床試験が進められ、大幅な拡張なしにプライムと活性化NK細胞5に白血病細胞株CTV - 1を使用して、1つです。二審は21日6で平均490倍の拡大を達成するため、NK細胞の増殖のためにEBV - LCLを利用しています。三番目はK562ベースaAPCを利用して4 - 1BBL（CD137L）と21日の平均NK拡大277倍を達成した膜結合型IL - 15（MIL - 15）7、形質導入。 NK細胞はK562 - 41BBL - mIL15を使用して展開、がaAPCが展開されていないNK細胞と比較してin vitroおよび in vivo での高い細胞毒性であり、ADCCに参加、その増殖が老化テロメアの短縮8に起因することによって制限されます。さらに最近ではNK細胞の350倍の拡大は、K562表現MICA、4 - 1BBLとIL15 9を使用して報告した。 NK細胞の拡大の私達の方法はここに21日の中央値は21,000倍に拡大を達成する老化することなく、NK細胞の急速な増殖を生成する説明。

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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

ここでは、効率的に拡大し、精製ヒトNK細胞の数が多いし、その機能を評価する方法を説明します。

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

47.9K ビュー.  MD Anderson Cancer Center - University of Texas. ここでは、効率的に拡大し、精製ヒトNK細胞の数が多いし、その機能を評価する方法を説明します。

ビデオ: Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

ゾレドロネートを使用してヒト末梢血γδT細胞の拡大

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

免疫・感染学

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

抗原は、コンパクトな多分岐ポリグリセロールのグラフト膜によって機能赤血球を保護

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical testing, and cell-based therapies. In this study, a simple, novel protocol to isolate, activate, and expand T cells from PBMCs ex vivo is presented. This study utilizes functionalized buoyancy-activated cell sorting (BACS) technology to isolate and activate T cells. Briefly, the protocol involves the positive selection of CD3+ cells from leukopak-derived PBMCs, followed by a 48 h co-stimulation with pre-conjugated anti-CD28-bound streptavidin microbubbles (SAMBs) prior to transduction in 24-well plates. Functionalized microbubbles offer a unique opportunity to buoyantly activate cells, leading to proliferative phenotypes that allow for expansion with minimal exhaustion. This technique offers reduced exhaustion because the co-stimulatory microbubbles remain buoyant and return to the top of the culture medium, thus reducing the amount of time that the expanding cells are in contact with the co-stimulatory factors. The results indicate that the isolated and cultured T cells receive enough stimulation to activate and proliferate but not to an extent that leads to overactivation, which then leads to exhaustion, as demonstrated by the presence of excessive PD-1.

The objective of this study is to demonstrate the feasibility of flotation-based separation to isolate, activate, and expand primary human T cells.

マイクロバブルを用いたヒト末梢血単核細胞サンプルからの浮遊選鉱ベースのT細胞の単離、活性化、および増殖(英語)

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

機能性破骨細胞のヒト末梢血CD14+ 単球との鑑別

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...