我々は、フローサイトメトリーコアの使用の彼のサポートのために博士はビルのCashdollarを感謝したいと思います。

<ol><li>プロセスを開始する前に、以下の項目は、収集と準備に注意する必要があります。 <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li>アイス</li><li>単一のカラーコントロールを染色する染色細胞と12 × 75 mmの流管の15 mlコニカルチューブ。 </li><li>バッファを染色：リン酸塩が緩衝生理食塩水（PBS）+ 3％ウシ胎児血清（FCS） </li><li>ピペット</li><li> FCブロック（必要な場合）と染色抗体。抗体は、最適な染色のために滴定する必要があります。 </li><li>補償ビーズ</li><li>サスペンションの緩衝液：ハンクス平衡塩溶液（HBSS）+ 25 mMのHEPES + 3％FCS </li><li>トリパンブルーと血球計数器</li><li>セルストレーナー（40μmのナイロン） </li><li>コレクションチューブ：コレクションチューブの2種類が使用できます）12 × 75 mmのポリスチレンチューブ（300μlのFCSおよび25mM HEPESを含む）またはb）15 mlコニカルチューブ（1ミリリットルFCS + 25mMのHEPESを含む）。高い血中濃度とのリッチな培地は、ソートされた細胞の収集に使用することができます。 </li></ol></li><li>開始細胞集団の単一細胞懸濁液を生成する。 </li><li>オプション：補数の枯渇や磁気ソーティングなどの大量精製法により、目的の細胞集団を濃縮する。濃縮ステップの主な利点は、ソート時間を減らすことです。 </li><li>バッファを染色で細胞を1回洗浄する。 </li><li>上清を捨て、効率的な染色のために50 × 10 6に濃度のバッファーを染色で細胞を懸濁します。 </li><li>オプション：FcRの高レベルを発現する細胞は、適切なブロッキングメソッドを使用して受容体をブロックする。選択の方法は、氷上で10〜15分間FcγRと結合するモノクローナル抗体の使用である。これらの抗体は市販されている。 </li><li>目的の細胞集団を染色し、染色バッファーで2回洗浄に続いて暗所で氷上で20〜30分、インキュベートするための適切なモノクローナル抗体を（所定の濃度で）を追加します。オプション：このようなヨウ化プロピジウムなどの重要な染料で染色、死細胞を（5）識別に含めることができます。マルチカラー染色を使用する場合は、単一の色のコントロールが必要です。製造業者のプロトコルを使用して、単一のカラーコントロールを準備するために我々は、BDのCompBeadsを使用してください。 </li><li>直接標識抗体を使用していない場合、適切な二次抗体またはストレプトアビジンコンジュゲートを使用して手順7を繰り返します。 </li><li>洗浄後、培養液中に細胞を再懸濁し、トリパンブルーなどの生体染色色素を用いて細胞濃度を決定する。 </li><li> 15〜20細胞濃度を調整する× 10 6個 / ml。ソート中に測定器を詰まらせることができるフォームのクラスタ、その細胞集団のために、ストレーナを介して細胞にフィルタをかける。 </li><li>設定し、セルソーターを最適化する。フローサイトメーターのセットアップのプロセスは、製造と適切な訓練を受けた者のみが行うようにニーズに応じて変化する。 一般的な推奨事項は次のとおりです。 <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li>ソートされる細胞の種類に応じて、適切なノズルを選択してください。 </li><li>滅菌ソートの場合、楽器を滅菌する。 </li><li>レーザーが機能しているかどうかを確認するためにビーズで機器の品質管理を実行し、そしてそれは正確にソートされる。 </li><li>必要なコレクションのデバイスをインストールし、サイドストリームを設定します。 </li><li> （私たちのBD FACSアリア三レーザーを持っているし、9色まで検出することができる）使用できる蛍光ラベルを決定するために設定する測定器のレーザーと検出器を見てください。 </li><li>一度蛍光ラベルはセルソーターで使用されるか決定される、報酬は（以下で説明するように）行うことができます。 </li></ol></li><li>陰性対照サンプルと単一の陽性コントロールを使用して補償を行います。報酬は、2つの検出器間のスペクトルの重複を削除する必要があります。それは、その補償は証拠を欺くされていない注意することは適切であり、逆にどのように鮮やかな特定のマーカー染色、そして暗く、負の集団の間で貧しい人々の解像度につながる可能性が低い自家蛍光を持つ細胞の蛍光による影響を受けます。 最良の結果を得るには、実験的なデザインは、低発現を持っているか、既知の染色パターンを持っていないそのマーカーで明るい蛍光色素を使用して含める必要があります。細胞集団と高度に発現している間に良好な分離を提供するマーカーは、赤色または紫色レーザーで励起されたもののような二量体の蛍光色素で使用する必要があります。 <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li>補償は、マウス、ラット、またはラット/ハムスターからの免疫グロブリンのκ軽鎖に特異的な抗体に結合されているポリスチレン微粒子である補償のビーズ、で行うことができます。ビーズは、染色堅牢な信号を持っているし、実験試料と同じ蛍光体を持っている単一の染色されたコントロールを作成する簡単な方法を提供するのは簡単です。 </li><li>のために前方散乱光（FSC）と側方散乱（SSC）、および一つのヒストグラムを表示するには、変量プロットを含むテンプレートを設定する使用されるそれぞれの蛍光色素。 </li><li>陰性コントロールチューブを実行し、規模の利息の人口を配置する前方散乱光（FSC）と側方散乱（SSC）を調整します。 </li><li>ヒストグラムの一番左側の部分に負の人口または自己蛍光を配置する蛍光PMTの設定を調整します。 </li><li>陰性コントロールチューブを記録。 </li><li>単一の陽性対照チューブを実行し、各チューブのデータを記録する。 </li><li>ヒストグラム上のデータの正の部分と、ヒストグラムの負の部分に別の区間のゲートの周りに間隔のゲートを描きます。 </li><li>手動補正は、それがネガの中央値と等しくなるまで、中央値（中央値は対数スケールで平均よりも中央の傾向のよりよい推定値である）陽性のを調整することによって行われます。これは、実験に用いた蛍光色素のラベルのそれぞれに対して行う必要があります。 </li><li>中央値を調整するには、どちらかの上位または下位の各蛍光パラメータの一致のための中央値になるまでにできる限り近づけることのスペクトルオーバーラップ値を調整します。 </li><li>補償は、解析ソフトウェアで自動的に行うことができます。自動補正は、実験で使用されるすべての蛍光体の代数行列を計算するために補償のコントロールから記録されたデータを使用しています。これらの値は、原色の検出器への出血している非原色の貢献を引くために使用されます。 </li></ol></li><li>ソートする実験的なサンプルを記録し、関心の集団を定義するためにゲートのツールおよびサブセット化メソッドを使用します。 <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> FSC対SSCを表示し、ゲートに関心の人口をゲーティングツール、多角形、長方形、間隔または象限を使ってドットプロットで実験的なテンプレートを設定します。散布図は、細胞のタイプに区別される細胞の物理的なプロパティが表示されます。 </li><li>蛍光ゲーティングの戦略を決定する最良の方法は、蛍光マイナス1（FMO）コントロールを使用することです。 FMO制御管で実験に使用されるすべての試薬は、関心の一つを除いて含まれています。 FMOはぼんやりとステンド集団と幅広い負の集団を区別するのに役立ちます。 </li><li>実験的なチューブ内にゲートを配置する場所を決定するためにFMOのチューブから記録されたデータを使用してください。 </li></ol></li><li>ゲートが決定したら、ゲートが外部のコレクションチューブにソートを選択することができます。最大4つのゲート（または集団）が利用できる計装に応じて一度に並べ替えることができます。 </li><li>偏向板をオンにし、サンプルを並べ替え、4℃での実験試料チューブを実行します。 5 × 10 5 -1.5 × 10 6細胞を12 × 75 mmのチューブに並べ替えることができますし、1.5 × 10 6 - 4.5 × 10 6細胞を15 mlコニカルに並べ替えることができます。 </li><li>セルの必要数を取得したら、手動でソート停止。 </li><li>ソートされた細胞集団の純度を決定するために後のソートの解析を行います。 </li></ol>代表的な結果ここでは、マウス脾臓BおよびCD4 T細胞のソーティング（図1）の結果を示している。脾細胞をPEテキサスレッド標識抗マウスB220、FITC結合抗マウスTCRβおよびB細胞（B220 +TCRβ - ）とCD4 T細胞（CD4 +TCRβ+を識別するために、CD4抗マウスAlexafluor - 700 -共役で染色した）。並べ替えは、BD FACS Ariaの楽器を行った。 B細胞の純度をソートした後に&gt; 97％であり、CD4 T細胞の純度は&gt; 98％であった。 <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。脾臓B細胞とCD4 FACS後のT細胞の純度。マウス脾細胞を抗マウスB220、TCRβおよびCD4抗体で染色した。 B細胞のFACSは、B220 +TCRβ - 細胞（図1A、左のパネル、右下の象限）にゲートでBD FACSのアリアを用いて行った。ポストソートの解析は、B細胞（図1A、右側パネル）の純度を決定するために行われました。 B220染色は、y軸上にx軸とTCRβ染色で示されています。 CD4 T細胞のFACSは、TCRβ+ CD4 +細胞のゲーティングにより、同一のフローサイトメーター（図1B、左のパネル、右上の象限）を用いて行った。ポストソートの解析は、CD4 T細胞（図1B、右のパネル）の純度を決定するために行われました。 TCRβ染色は、x軸とy軸に染色CD4に表示されます。各象限におけるパーセント陽性細胞が示されています。 <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 FACS後の脾臓CD4 T細胞の純度。マウス脾臓T細胞は、パンニングによりB細胞の除去によって濃縮した。その後、細胞を抗マウスTCRβおよびCD4抗体（左パネル）で染色した。 FACSは、TCRβ+ CD4 +細胞にゲーティングによってBD FACSのアリアを使用して実施した（左パネル、右上quadrアリ）。ポストソートの分析は99％以上（右パネル）であったT細胞の純度を決定するために行われました。 TCRβ染色は、x軸とy軸に染色CD4に表示されます。各象限におけるパーセント陽性細胞が示されています。 - &gt;

<ol>
	<li>Herzenberg, L. A., De Rosa, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+and+the+FACS:+complementary+tools+for+immunobiology+and+medicine.">Monoclonal antibodies and the FACS: complementary tools for immunobiology and medicine.</a> Immunol Today. 21, 383-390 (2000).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow cytometry first principles. , 273-273 (2001).</li><li>Hewitt, Z., Forsyth, N. R., Waterfall, M., Wojtacha, D., Thomson, A. J., McWhir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+single+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cells.">Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 225-234 (2006).</li><li>Walker, A., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics.">Single-cell genomics.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 176-177 (2008).</li><li>Sorensen, T. U., Gram, G. J., Nielsen, S. D., Hansen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+sorting+of+GFP-transduced+live+cells+for+subsequent+culture+using+a+modified+FACS+vantage.">Safe sorting of GFP-transduced live cells for subsequent culture using a modified FACS vantage.</a> Cytometry. 37, 284-290 (1999).</li><li>Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In living color: Protocols in flow cytometry and cell sorting. , 800-800 (2000).</li><li>Karabinus, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+sorting+of+human+sperm:+MicroSort+clinical+trial+update.">Flow cytometric sorting of human sperm: MicroSort clinical trial update.</a> Theriogenology. 71, 74-79 (2009).</li><li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seventeen-colour+flow+cytometry:+unravelling+the+immune+system.">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).</li><li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+flow+cytometry+data:+a+guide+for+the+perplexed.">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7, 681-685 (2006).</li><li>Tung, J. W., Heydari, K., Tirouvanziam, R., Sahaf, B., Parks, D. R., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+flow+cytometry:+a+practical+approach.">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).</li></ol>

FACSは、ソートされた人口の非常に高い純度（95〜100％）を得ることができるの関心の細胞集団を、精製するための高度なテクニックです。したがって、この手法は、高純度の必須要件（例えば、マイクロアレイ解析）ここで、実験のために特に重要です。細胞集団が毎週発現される表面マーカー上またはときに二つ以上の集団が同じ表面マーカーの発現の異なるレベルを持つ精製する必要が基づいて精製する必要があるときにFACSは浄化の他の可能な方法に比べて特に有利である。たとえば、辺縁帯の精製B細胞（B220 + CD21 ハイ CD23 INT /低 ）と濾胞性B細胞（B220 + CD21 int型/低 ​​CD23 HI）CD21及びCD23の発現レベルに基づいて。 FACSの別の成長アプリケーションは、個々のセル（3,4）の分析を可能にする単一の細胞選別です。 FACSはまた、一般的に、緑色蛍光タンパク質タグタンパク質（5）のような遺伝的に発現される蛍光タンパク質を発現する細胞を選別するために使用されます。滅菌ソートが実行されている場合は細胞を培養することができます。しかし、細胞の生存率と収率はソート時に損なわれる可能性があります。生存率は、ソートのために細胞依存性、最適温度を使用して、それらが容量に達した直後にコレクションチューブを処理することによって改善することができます。回復は、ポリプロピレンのコレクションチューブを使用して断続的に血清リッチメディアと反転コレクションチューブにソートされた細胞を収集し、最適な温度でコレクションチューブを維持し、〜10分（http://cyto.mednet.ucla.eduために選別された細胞を遠心分離することによって増加することができます/ Protocol.htm）。 超高速選別機の開発は、臨床現場でのソートの流れの応用の可能性を拡張しました。 FACSの潜在的な臨床応用は、人間の精子と病気の早期検出を（6,7）ソート治療目的のヒト血液から血液幹細胞の精製、癌治療への応用、羊水穿刺の交換を、含まれています。 多色の染色に、抗体の選択は重要なステップであり、蛍光色素は、それぞれ特定の楽器のための検出システムに基づいて選択されています。セルソーターを販売し、レーザーの構成は、ユーザーのニーズに応じて変化する企業の数があります。従って1つは、単に互換性を確認せずに発表された研究で使用されているまったく同じ抗体を使用することはできません。最適な抗体の選択のために、一つは検査されているタンパク質の発現レベルを考慮する必要があります。薄暗い蛍光色素を高発現の表面マーカー（8）の染色に使用することができますが、一般的で、明るい可能な蛍光タグ抗体は、ぼんやりと表現される表面マーカーを染色するために使用する必要があります。さらに、抗体は、それらの発光スペクトルの間で重なるように選択されるべき最小限に抑えられます。多色の染色の場合、それはスペクトルの重なりがないことを蛍光色素を選択することは極めて困難である。このような状況では、補償が実行されます。 補償は、数学的に検出器（8-10）によって測定可能である、様々な蛍光色素の排出スペクトルとの間の蛍光の重複を排除する必要があります。つまり、一方の蛍光色素からの蛍光のオーバーラップは、別の蛍光色素の排出スペクトルから減算されます。補償の計算は、多色の染色（9、10）に使用される各蛍光色素のための未染色の制御と単一の陽性コントロールが必要です。補償は、細胞やビーズを用いて行うことができる。ビーズは、染色堅牢な信号を持っているし、実験試料と同じ蛍光物質を持っている単一の染色されたコントロールを作成する簡単な方法を提供するのは簡単です。興味の細胞表面の蛋白質が低レベルで発現され、関心の細胞集団が最初の出発細胞集団に制限された場合に、補償のビーズは、特に有利である。 抗体が選択されると、その活性は滴定分析を行うことによって最適化する必要があります。 FACSのマシンは非常に強力なレーザーを持っている場合、これは特に重要です。染色抗体の準最適濃度の使用は、総細胞集団から目的の細胞集団の貧しい人々に分離されることがあります。高い抗体濃度の使用は、抗原非特異的な染色のための機会を増加させる。したがって、抗体の滴定は、正の人口と最小のバックグラウンド染色（8）の最大の明るさを与える抗体濃度の選択が可能になります。 FACSは細胞の亜集団を精製するための標準技術です。これは、単一の細胞懸濁液が生成され、抗体が目的の細胞集団を同定するために利用できることができる任意のセル型を分離するのに使用できます。 FACSは、選択の方法であるとき、Highly純粋な細胞集団が必要です。

purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)

実験的および臨床研究は、しばしば高度に精製された細胞集団を必要とする。 FACSは、既知の表現型の細胞集団を精製するために最適な手法です。浄化の他の大部分のメソッドは、パン、補体の枯渇と磁気ビーズの分離などがあります。しかし、FACSには他の利用可能なメソッドに比べていくつかの利点があります。 FACSは、標的細胞集団は、差動のマーカーの密度に基づいて分離を必要と識別するマーカーの非常に低いレベルを表現するとき、または細胞集団際に、希望する人口の非常に高い純度が要求される好ましい方法である。さらに、FACSはそのような遺伝子組み換え蛍光タンパク質マーカーとして内部染色や細胞内タンパク質の発現に基づいて細胞を、単離するためにのみ利用可能な浄化技術です。 FACSは、大きさ、粒度及び蛍光に基づいて、個々の細胞の精製が可能になります。目的の細胞を精製するためには、まず、目的の細胞集団（1）上の特定の表面マーカーを認識する蛍光タグ付きモノクローナル抗体（mAb）で染色されています。未染色の細胞の負の選択も可能です。 FACS精製は能力と適切なソフトウェアをソートすると、フローサイトメーターを必要とします。 FACSの場合は、懸濁液中の細胞がレーザーの目の前に単一のセルを含む各液滴のストリームとして渡されます。蛍光検出システムは、細胞の所定蛍光パラメータに基づいて目的の細胞を検出します。楽器は、目的の細胞を含む液滴に電荷を適用し、静電偏向システムは、適切なコレクションチューブ（2）に帯電液滴のコレクションを容易にします。染色し、それによってソートの成功は、識別マーカーとモノクローナル抗体の選択の選択に大きく左右されます。ソートパラメータは、純度および収率の要件に応じて調整することができます。 FACSは、特殊な設備と人材育成を必要としますが、それは非常に細胞集団を精製単離するための最適な方法です。

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS at JoVE.com

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

細胞集団の生物学的、化学的分析を必要とする多くの科学的研究のために細胞は純度の高い状態になっている必要があります。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、純粋な細胞集団を取得するための優れた方法です。

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって特定の細胞集団の精製

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

purification-specific-cell-population-fluorescence-activated-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

72.5K ビュー.  BloodCenter of Wisconsin. 細胞集団の生物学的、化学的分析を必要とする多くの科学的研究のために細胞は純度の高い状態になっている必要があります。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、純粋な細胞集団を取得するための優れた方法です。

ビデオ: Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

補体の枯渇により特定の細胞集団の枯渇

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

免疫・感染学

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

の検出<em&gt;トリパノソーマ</em磁気活性化細胞選別し、フローサイトメトリーによって&gt;バリアント表面糖タンパク質の切り替え

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...