この作品は、H. Fölschへの健康（GM070736）の国立研究所からの助成金によって賄われていた。 SFアンリーは、A * STAR大学院奨学金の受賞によってサポートされていました、そしてRS姜氏は病の研修プログラムの細胞と分子基盤（GM8061）によってサポートされていました

1。プラスミドDNAの単離<ol><li>製造業者のプロトコルに従ってエンドトキシンフリーDNAを調製するためにシグマアルドリッチのエンドトキシンフリーmaxiprepキットを使用してください。それは確実にDNA調製物からのエンドトキシンを除去するので、このキットは、私たちのために動作します。細胞核にDNAを注入されているエンドトキシンは、細胞死につながる。 </li><li>単離されたDNA、渦とエッペンドルフ微量遠心機で13,000 rpmで1分間スピンして100μlのフェノール/ chlorofom /イソアミルアルコール（25:24:1）を追加します。新しいチューブに、上部の水相を移し、100μlのクロロホルム/イソアミルアルコール（24:1）、上記のような渦とスピンを追加します。新しいチューブにDNAを含む上層の水相を転送します。このステップは、マイクロインジェクションの針の目詰まりを防止するDNA、から任意のタンパク質を除去するために必要です。 </li><li> 300mMの2 X体積の100％エタノールの最終濃度に酢酸ナトリウム（pH6.0）を添加することによりDNAを沈殿させる。一晩-20℃でインキュベートする。エッペンドルフ微量遠心機で13,000 rpmで20分間DNAをスピン、70％エタノールで1回洗浄し、300μlのエンドトキシンフリー水（Sigma - Aldrich社）で再懸濁します。 </li><li> DNA濃度を決定する。典型的なDNA濃度は1〜5μg/μLの範囲である。 </li></ol> 2。 MDCK細胞の培養<ol><li> MDCK細胞を分割する。細胞とシード4 × 10 5細胞明確な12 mmのトランスウェルフィルター（0.4μmの孔径、コーニングコスター、3460）上を数える。モック噴射制御して、シード3つのフィルタをする必要がある2つの異なった変異Rabタンパク質が含まれている実験用。 </li><li> 2mMのL -グルタミン、0.1 37 mg / mlのペニシリン/ストレプトマイシン、7％（vol / vol）のウシ胎児血清（= MEMの増殖培地）℃、5％CO 2のMEM培地で培養したMDCK細胞。 </li><li>毎日基底外側チャンバー内のメディアを変更してください。それは動物の上皮細胞の状況を模倣するため、これは、分極処理を支援します。 </li><li>細胞が閉じた単層に成長しているかどうかを顕微鏡で2日後の播種チェック。あなたが単層内の任意の穴を検出できない場合、3日目にして実験を行う。穴が残っている場合、4日目にして実験を行う。 </li></ol> 3。マイクロインジェクションの手順と注入後のインキュベーション<ol><li>実験当日に39℃インキュベーターに5 mlのMEMの増殖培地に加えて、各フィルタと場所用の60 × 15mmの板で50mMのHEPESを準備。さらに、12ウェル1mlのMEMの増殖培地に加え、フィルタごとの50 mM HEPES、0.1 mg / mlのシクロヘキシミドとプレート、および31 ° Cのインキュベーターに場所の1つのウェルを設定します。 </li><li>あなたのマイクロインジェクション顕微鏡をオンにして、39にその加熱段階を設定して℃に我々は、加熱された段階で倒立顕微鏡（Axiovert 200、カールツァイスマイクロイメージング社）、10Xと32Xの目標、およびエッペンドルフFemtojet（Injectman NI2）を使用してください。最後に、窒素と空気のテーブルを供給する窒素ガスのタンクを開きます。 </li><li> 100μlの - 10の合計体積では0.2 mg / mlの最終濃度までろ過された水（0.2μmのフィルターを使用）でDNAを希釈する。その後、30分間13,000 rpmでエッペンドルフの遠心でDNAをスピン。新しいチューブの上部と場所を削除します。このステップでは、希釈したDNAをマイクロインジェクションの針への読み込み時に正確に&quot;クリーン&quot;DNAをロードできることを保証します。あなたのDNAは、現在マイクロインジェクションのための準備ができています。 </li><li>その培養皿の最初のフィルタアウトを取ることによってあなたの細胞を準備します。 5mlにフィルターホルダーや場所からフィルタアウトカット外科ブレード（羽根外科ブレード、ステンレス鋼、番号11）、、39℃の温かいMEMの増殖培地に加え、50mMのHEPES（60 × 15 mmのプレート）。あなたがそれを切り出すために使用される外科用ブレードで培養プレートにフィルターを圧迫。外科ブレードの穴は、フィルタの中央を囲むようにフィルターの上に置きます。顕微鏡の加熱ステージ上にして培養プレートを置きます。 </li><li>マイクロインジェクションの針（Femtotip II、エッペンドルフ、930000043）にあなたの希釈したDNA（この場合、プラスミドのエンコーディングVSVGts045 - GFPで=モック噴射制御）の2-3μlをロードし、針の保護カバーをねじり、それを床に落としてください。今針はその所有者にねじ込まれる準備ができています。そのためには、あなたのinjectmanのメニューキーを押すと、バルブがシャットダウンされていることを確認します。そのホルダーに針をネジ、それが破損につながる可能性があるのできつく針で台無しにしない注意してください。今、もう一度、メニューキーを押すと、応用P cは microinjeciton手順中に針に吸い込まれてからメディアを防ぐことができます。最後に、保存されてホーミングを消去するには、ジョイスティックをタップします。 </li><li>細胞に針を下げるには、10倍の目標を使用して液体上記光ビームに針をもたらす。今、細胞に焦点を当ててフォーカスホイール180を回して再びフォーカスを持ち出す°〜、と針を見つける。その後、徐々に（再び焦点に細胞をもたらすに向けた作業）再び焦点が合って持参し、焦点に針を移動させる、ために針をダウンさせる再びお客さま。針は、メディアの表面に接触するまで繰り返す、その時点であなたが表示されますすべてはハロである。あなたが32Xの客観的かつ細かい粗い設定に（焦点面からIE）の変化、細胞がフォーカスされている、しかし針はまだあいまいである点に到達したとき。 </li><li>針の先端と頂端膜に触れると核として約10μmを差し引くことにより、Z -制限を設定すると、頂端側細胞膜の下に約10μmを敷設している。 </li><li>は、z -制限を設定した後、右の射出圧力を見つける。 95 PSIで起動します。圧力が高すぎる場合、あなたの細胞が爆破される。あなたの圧力が低すぎる場合には、ままの白いドットが表示されますが、他に何も起こりません。成功注入を使用すると、セルサイズの変化を伴わない位相変化が表示されます。注射の場合は、可能な限り高速に焦点面から針のミクロンのカップルを引き出す。核上の針（すなわち、個々のセルの中央）とジョイスティックの注入ボタンを押すと目的が、ボタンを押したままにしないでください。 </li><li>あなたの細胞上にあるあなたの外科ブレードの穴の中で100〜500細胞を注入する。作業が終了したら、2時間培養皿および外科ブレード39℃インキュベーターに、インキュベートを使用してセルを配置この時間の間に、VSVGts045 - GFPは小胞体に発現し、分泌される。しかし、39℃で、VSVGts045 - GFPは、正しく折り畳まれないことができるため、ERを残すことはできません。一方、関心の低分子GTPアーゼは、共射出実験で細胞質に蓄積されることになります。 </li><li> 2時間後、31℃で2時間12ウェルプレートとインキュベートで1ミリリットルのMEM増殖培地に加え、50mMのHEPES、0.1 mg / mlのシクロヘキシミドにあなたの細胞を配置このチェイス期間中、VSVGts045 - GFPは、正しく折り畳まERのままにして細胞表面に配信される。 </li><li> （プラスミドエンコーディングVSVGts045 - GFPを注入し、例えばRab13Q67LをV5タグ付き）フィルタつ（プラスミドエンコーディングVSVGts045 - GFPを注入し、例えばRab13T22NをV5タグ付き）と3 3.10 - 手順3.1を繰り返します。それぞれの注入は、20程度かかります - 60分。セルを修正するまでしかし、それは温度シフトのインキュベーションと表面染色を通じて、すべてのフィルタと同じように扱って絶対に不可欠です。固定後は、同時にすべてのフィルタについては、染色プロトコールの残りを実行することができる。 </li></ol> 4。免疫蛍光分析のための表面染色 （注）は、VSVGts045 - GFPのGFPシグナルの漂白を避けるために、後続のすべての手順の間にアルミホイルで覆うことにより光から試料を保護する。 <ol><li>あなたが表面染色を実行したい場合は、、氷の上に金属板の上に培養皿で細胞を配置し、氷冷PBS 2 +（PBS [0.2 g /リットルのKCl、0.2 g / LのKH 2 PO 4と1Xあなたの細胞を洗う8グラム/リットルのNaCl、および2.17グラム/リットルのNa 2 HPO 4 × 7 H 2 O] +0.1 g / LのCaCl 2及び0.1グラム/リットルのMgCl 2 × 6 H 2 O）。その後、場所、この場合には、目的タンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体30μlのマウスモノクローナル抗体TK1（IgG 1の 、故トーマスクライスから得られる）、氷の上に金属板上に置かクリーンパラフィルム上に。ドロップの上に逆さまにあなたの細胞を使用してフィルタを配置し、フィルタの裏側に抗体の数滴を追加します。氷上で1時間インキュベートする。 </li><li> 12ウェルプレートに場所細胞は、氷冷PBS 2 3X洗浄+（またはRT暖かいPBS 2 +前の表面染色なし）、そして室温で15分間3％パラホルムアルデヒドで固定。 </li><li> PBS 2 +で細胞を1回洗浄し、+ 5分間PBS 2に残す。 </li><li> /透過化バッファ（BPB）（2％[重量/体積] BSA、0.4％[重量/体積] PBS 2のサポニン+）10％[体積/体積]ヤギ血清をブロッキングで細胞をインキュベートする。室温で1時間インキュベートする。 </li><li>この例では抗V5（マウスモノクローナル抗体IgG 2aは 、Invitrogen社）、BPBに1:200で、表現されるRabの低分子量GTPaseを検出する一次抗体を希釈する。 13,000 rpmで10分間エッペンドルフの遠心で希釈抗体をスピン。きれいなパラフィルム上に抗体溶液の代わりに30μlのはウェットチャンバー内に設置。逆さまに抗体のドロップ上にフィルタ上のセルを配置し、室温で1時間インキュベートする。 </li><li> 12ウェルプレートに戻って場所細胞（上右側）と室温でBPBを持つ30以上の分を5倍に洗う。 </li><li>このケースのヤギ抗マウスIgG 1アレクサ（表面に検出しVSVGため、Invitrogen社）594標識、およびCy5標識二次抗体は、この例のヤギでは、あなたのラブのGTPアーゼを認識する抗マウスIgG 2aに、適切な二次抗体を希釈するBPBに1:200、（ジャクソンのImmunoResearch）をCy5で標識し、上記のようにスピン。ダウン抗体のドロップダウンにフィルタ逆さでウェット室と場所細胞のクリーンパラフィルムの上に場所30μlの抗体溶液。室温で1時間インキュベートする。 </li><li>ステップ4.6を繰​​り返します。 </li><li>脱イオン水と位置Rに3Xフィルター上にディップ細胞microslidesへIGHTサイドアップ。細胞の上に10〜15μlをマウントする（10％蒸留水で[重量/容量] DABCO、50％[重量/体積]グリセロール）を追加します。トップと顔の組織を使用しての上に置いて18 × 18ミリメートルマイクロカバーガラスは静かに細胞にマイクロカバーガラスを押してください。マニキュアで密封する。 </li><li>共焦点顕微鏡で試料を分析する。我々は、63Xの水浸レンズを搭載したマイクロLSM 510、カールツァイスマイクロイメージング（株）を使用。 </li><li>数字の調製のために、Adobe PhotoshopやAdobe Illustratorなどのプログラムを使用して画像を調整して組み合わせる。 </li></ol> 5。代表的な結果低分子量GTPaseの共発現は、ソートをVSVGを妨害する方法の例については親切に心尖missorting 3,4、または表面の配信7の阻害のいずれかの公開された記事を参照してください。 <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。表面染色（赤、図1の）で判断してモック注入では、のみをコードするプラスミドVSVGts045 - GFPの注入、すなわち、タンパク質は十分に偏MDCK細胞の基底外側表面に配信されます。そのすべてではないVSVGts045 - GFPは° Cとして総タンパク質（緑色で、図1と図B）のための広範な細胞内シグナルによって証明される31日現在で追いかける時の側底膜に配信されるのに注意。十分に分極されていない細胞でVSVGts045 - GFPは、頂端膜（図1 B）にも配信されます。コントロール標本は図1のBの細胞のように見える場合、あなたのデータを信頼し、より良い偏細胞を用いた実験を繰り返すことはできません。スケールバーは5μmである。

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

成功するマイクロインジェクションの実験のための最も重要なステップは、DNAや細胞の極性の品質と純度です。極性細胞がなければ、あなたの噴射制御が既にVSVGをmistargetedことになり、実験は使用できません。 DNAは低品質のものである場合、DNAは、貧しい人々やすべてにおいて所望のタンパク質の無発現を導く注射針を詰まらせることができる。また、そのようなpRKVなどの高い発現レベル?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>加熱された段階で200顕微鏡をAxiovert </td><td>カールツァイス株式会社</td><td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td> Injectman NI2 Femtojetマイクロマニピュレーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td> Femtotips II（マイクロインジェクションの針） </td><td>エッペンドルフ</td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloaderヒント</td><td>エッペンドルフ</td><td> 930001007 </td></tr><tr><td>明確な12 mmのトランスウェルフィルターサポート</td><td>コー​​ニングコースター</td><td> 3460 </td></tr><tr><td>エンドトキシンフリープラスミドmaxiprepキット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

頂端部が&quot;無料&quot;の表面と側底膜に直面している生化学的及び機能的に異なる心尖部と側底部領域にそれらの形質膜分極上皮細胞は、基板と隣接セルに接触している。両方の膜ドメインは、拡散障壁を形成するタイトジャンクショ​​ン、で区切られています。このようなマディン-ダービーのような上皮細胞イヌ腎臓（MDCK）細胞はポリカーボネートフィルターに高密度で播種し、1 2、数日間培養する。アピカル-基底外側偏光は、培養に成功しrecapitulatedすることができます細胞極性の確立と維持は、RalA、Cdc42と、Rab8、Rab10とRab13 3 4 5 6 7などのRasスーパーファミリーの低分子量GTPaseの配列によって調節されている。不活性なGDP結合状態とアクティブなGTP結合状態の間にあるすべてのGTPアーゼのようなこれらのタンパク質は、サイクル。ヌクレオチド結合領域に特異的な変異は、このサイクル8で干渉する。例えば、Rab13T22Nは恒久的に、GDP -フォームとこのように呼ばれる&quot;ドミナントネガティブ&quot;にロックされてRab13Q67LはもはやGTPを加水分解しないことができる一方、その結果、&#39;支配的なアクティブな&quot;状態7にロックされます。その機能を解析するために細胞内でGTPアーゼの両方ドミナントネガティブと支配的なアクティブな対立遺伝子は、通常は内因性タンパク質9の機能を妨害するために高レベルで発現されています。短時間で過剰発現の高いレベルを達成するためにエレガントな方法は、フィルタはマイクロインジェクション法を用いてサポートしている上に成長させた偏細胞の核に直接関連するタンパク質をコードするプラスミドを導入することである。これはしばしば、特に心尖部または側底部にソートされている細胞膜受容体をコードするレポータープラスミドの同時注入と組み合わされます。頻繁に側底部にソート貨物を分析するために使用される貨物は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSVGts045）10の温度に敏感な対立遺伝子である。このタンパク質は39℃で正しく折り畳まれないことができると関心の調節タンパク質が細胞質ゾルで組み立てている間にこのように小胞体（ER）に保持されます。 31日までのシフト° Cその後VSVGts045は形質膜11にERや旅行を、適 ​​切に折り畳むままにすることができます。このチェイスは、一般的にクリーンな結果につながる、さらにタンパク質の合成を防ぐために、シクロヘキシミドの存在下で行われる。ここでは詳細に側底選別に関与する調節タンパク質の包括的な分析を可能にする温度変化を含む偏光セルとその後のインキュベーションにプラスミドをマイクロインジェクションの手順を説明します。

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Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

この記事では詳細はマイクロインジェクション法を用いて偏光上皮細胞における低分子量GTPaseの過剰発現と解析に関わる手順を。

偏上皮細胞へのプラスミドのマイクロインジェクションによる低分子量GTPaseの機能を解析する

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.3K ビュー.  Northwestern University. この記事では詳細はマイクロインジェクション法を用いて偏光上皮細胞における低分子量GTPaseの過剰発現と解析に関わる手順を。

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

生物学

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

トランスジェニックの世代<em&gt;ハイドラ</em&gt;胚マイクロインジェクションによる

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

ニワトリレンズ開発におけるタンパク質発現の研究

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

著者スポットライト:ニワトリ胚水晶体におけるRCAS(A)レトロウイルスのマイクロインジェクションによる水晶体の発生と機能の調査 

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

組換えRCAS(A)レトロウイルスのニワトリ胚水晶体へのマイクロインジェクション

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...