著者らは、有益なコメントや原稿の批判的な読みのための博士ディアドラネルソンに感謝したいと思います。この作品は、アルバニー大学、ニューヨーク州立大学にNIHの助成DE019244、DE019197、DE021841とML​​に、F32DE02098001 SJSへ、そしてC06 RR015464によって賄われていた。

プロトコルは、 図1に示した4つの主要な手順が含まれています。すべての手順が完全に詳細に記載されています。アデノウイルスの構築およびウイルス精製は解剖上皮初歩の遺伝形質で使用するための臓器摘出の前に実行する必要があります。アデノウイルスを扱うときは、すべての標準的なBSL-2の安全上の予防措置に従うべきである。 1。マウス胚性顎下腺（SMG）の収穫と顕微解剖<ol><li>胎生13日目のマウス胚の頸椎脱臼や収穫列（E13、3-5上皮芽）制度の動物実験委員会によって承認され、次の手順に続いて、CO 2ナルコーシスを使用してタイムアウト妊娠雌マウス（非近交系の系統のCD-1またはICR）を、安楽死させる委員会。膣栓の発見の日は、E0として指定されています。始まったばかりクレフトを持つ単一の主芽と茎がある場合には唾液腺もE12の段階で収穫し、培養することができる開始します。この前のステージにサブマシンガンは、ここで示されたものとは異なる培養条件が必要です。 </li><li>フェノールレッド（Life Technologies社）および100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlストレプトマイシン（ペン連鎖球菌を欠いたDMEM /ハムF12培地（F12）25mlを充填した無菌の10cmの組織培養皿に胚の文字列を転送する、ライフテクノロジーズ）。 </li><li>滅菌メス（＃11ブレード）や鉗子（＃5、ファイン科学ツール、11252から20）を使用して、DMEM/F12 +ペン連鎖球菌の25ミリリットルを含む別々の10cm皿に嚢から胚を取り除く。 </li><li>ちょうど下顎下の斜めのカットで胚の頭部を切断。 </li><li>上顎下のカットを使用した透過光ベース（ニコンSMZ645または同等品）を装備するステレオ解剖顕微鏡下で頭から下顎を分離します。ガラスの余分な部分の上に直接ではなく、顕微鏡ベースのガラス成分に組織を置く。 </li><li> DMの3ミリリットルに下あごを収集無菌35mmの組織培養皿の中EM/F12 +ペン連鎖球菌。 </li><li>舌がスライスの底面にありますが、12時00時の位置に向かって指しているので、解剖顕微鏡ステージ上顎骨スライスを置きます。 </li><li>シザリング動きの2つの交差したピンセットの片側を使って、下顎のスライスの下1/3を削除し、破棄します。 </li><li>右（右利きの場合）にスライス90°回して、ピンセットではさみカットを使用して、途中でスライスに下顎骨スライスの先頭部分（舌を切断せずに）切る。 </li><li>離れて余分な組織をはがし、下にサブマシンガンを露出させるためにそれを削除します。舌の付け根付近各側に1つあるでしょう。 </li><li>舌でティッシュを押したままにする鉗子の1ペアを使用して、舌からSMGを離れていじめるために他の鉗子を使用しています。他の腺について、この手順を繰り返します。 </li><li>新しい無菌の35ミリメートル組織にDMEM/F12 +ペン連鎖球菌の3ミリリットルに顕微唾液腺を収集培養皿。注意：以前に2,8を説明するように、接続され小さい舌下腺（1芽）と共に大きく顎下腺は（3-5上皮芽）、4と実行手順4.1、4.3、および4.4のステップにスキップすることにより無傷で培養することができる。 </li></ol> 2。上皮性原基の分離をSMG <ol><li>場所5（またはそれ以上）のハンクス平衡塩溶液（HBSSはCa + +やMg + +のを欠いて 、200μlを含むガラス底、直径50mmのマイクロウェルディッシュ（マテック株式会社、P50G-1.5-14-F）の中に唾液腺Life Technologies社）を0.4％含有する（v / v）のディスパーゼ（Life Technologies社、カタログ番号17105から041）と、37℃で15分間インキュベート℃、 </li><li>インキュベーション後、200μlの滅菌ピペットチップを用いて、慎重に腺を乱すことなくディスパーゼソリューションを吸引します。直ちにディスパーゼを中和するために5パーセントを含むDMEM/F12培地200μlの（w / v）BSAを（DMEM/F12-BSA、0.22μmのフィルターで滅菌済み）を追加します。 </li> &lt;liは&gt;解剖顕微鏡下では、細かいヒント（＃5 Dumostar、ファイン科学ツール、11295から20）とピンセットを使って、優しく上皮をそのままにしておくように注意しながら、SMGの上皮芽やダクト周りから緩めの間充織を分離。 </li><li> DMEM/F12-BSAメディアやそっとでプリウェット滅菌200μlのピペットチップはDMEM/F12 +ペン連鎖球菌の200μlを含む新しい50mm径のマイクロウェル皿に上皮初歩を移します。滑らかなエッジを持つ高品質の200μlのピペットチップを使用しています。 </li><li>間葉片が含まれている皿の中で、舌下腺、デ​​タッチされた顎下腺のつぼみを含む、任意の非間葉組織を捨てる。 </li></ol> 3。上皮初歩のアデノウイルス感染<ol><li>得られた溶液の力価は1×10 8〜10 9 PFUsなるようにマイクロチューブにDMEM/F12 +ペン連鎖球菌に興味のあるアデノウイルスを希釈することにより、ウイルス感染の媒体の200μlを加える。ザ異なるウイルスに要する最適な力価は変わる場合があります。塩化セシウム（セシウム）に精製された最適な取り込み効率のためのウイルス調製物を使用することが重要です。 </li><li> 5上皮初歩を含む皿からメディアを取り出します。すぐにすべての回で基礎が濡れ保ち、感染メディアの200μlを添加する。ウイルスを処理し、汚染されたピペットチップの処分に必要な予防措置を取る。 10％漂白剤溶液を用いて、任意のウイルスに汚染された表面を消毒してください。 </li><li>くっつくのを防ぐし、それらがプレートの底に沈殿できるように鉗子で互いに離れ上皮初歩を移動します。室温で1時間ウイルスメディアの初歩をインキュベートする。彼らが近くに一緒に移動した場合のインキュベーションの間に、基礎を分離します。過度の揺れや動きが腺が一緒に凝集することができます。 </li><li>インキュベーション後、そっと、ウイルス含有培地を除去し、適切に廃棄し、rを混乱させないように注意しながらudiments。 DMEM/F12 +ペン連鎖球菌の200μlを添加する。この洗浄は、少なくとも2回以上繰り返すとDMEM/F12 +ペン連鎖球菌メディア200μlと交換してください。これらの洗浄は強く上皮に添付されていない任意のウイルスを除去し、間充織の感染を防ぐために重要です。 </li><li> DMEM/F12 200ml中で20分間、2％（v / v）のマトリゲル（BD Biosciences社、356231）を含有する上皮初歩をインキュベートする。我々は、マトリゲルでこの短いインキュベーションは、初期培養期間中に既存裂の退縮を最小限に抑えますが、マトリゲルへの暴露が望まれていない場合は、このステップを省くことができますを見つける。 </li></ol>再結合サブマシンガンの4。 エクスビボ文化<ol><li>ノッチ（小カット）の上に、プリウェット200μlのピペットチップを用いて、各原基を、一つずつ置く13ミリメートル、0.1μmの培地を200μl（浮かんNucleporeトラックエッチメンブレンフィルター（ワットマン）ガラス底マイクロウェルプレートに5初歩/フィルタ）。培地次のとおりです。DMEM/F12 +ペン連鎖球菌は、50μg/ mlのトランスフェリンおよび150μg/ mlのアスコルビン酸を含む、前述のように2,8は 。トランスフェリンは生存を刺激することが知られており、唾液腺や他の器官外植片9の分枝形態形成されています。アスコルビン酸の添加は、SMGは分岐を刺激することが示されている図10は、それが代謝経路（例えば、コラーゲン線維の形成11時プロリン水酸化など）の多くの水酸化反応における補因子として作用することが知られ、また、他の臓器の外植片におけるフィブロネクチンおよびラミニン産生を刺激される12。 </li><li>各上皮原基を追加した後、できるだけフィルターの上にできるだけ多くのメディアを取り出します。小さいメディアは初歩の配置を行い、はるかに容易に間充織間フィルターの上にあまりにも多くのメディアは、フィルタがシンクすることがあります。余分なメディアをピペットチップでまたは先端間のメディアを把持する鉗子を使用することによって、削除することができます。 </li><li>あちこち由来間葉片を置きメートル上に三から四腺および/または各上皮性原基の周りに。離れて初歩から間葉の動きを避けるために、腺を取り囲んでいる余分なメディアを取り出します。有益ではありませんが、あまり上皮原基の成長に有害であることができるより多くの腺由来間葉。 </li><li>必要に応じて、48 -72時間37℃加湿インキュベーター（95％空気/ 5％CO 2）内で再結合サブマシンガンをインキュベートする。 </li><li>明視野および/または蛍光0時間でのライブ腺の画像（必要な場合）、組換え後2時間およびに4Xまたは5X倍率の対物レンズを使用してデジタルカメラを装着し、倒立正立、またはステレオの光学顕微鏡でその後は24時間を取得するビューの1つのフレームに再結合された全体の腺をキャプチャします。唾液腺の画像は、明の設定や（完全に自動化された顕微鏡では不可能である）光路内の途中に配置され、適切な位相リングのいずれかを使用して最高のコントラストを示す。標準位相コントラストは、noです腺が厚いとコントラストを作成するので、トン必要。 </li><li>希望の時点では、再結合されたサブマシンガンが良いで細胞を維持することにより、内部細胞構造を維持するために5％（w / v）スクロースを（含む1X PBS中2％パラホルムアルデヒド（PFA）製の固定液で20分間固定することができます等浸透圧性の状態）。固定剤が完全に固定した後に削除された場合は4％PFA、2％とは違ってPFAは、GFPシグナルのかなりの量を保存します。腺を4℃の暗所で1×PBSで1週間まで保存することができる°Cのホールマウント免疫細胞化学と共焦点イメージングが実行されるまで、前述3,6,13-15報告した。理想的には、免疫細胞化学およびイメージングは​​、最高品質の画像を得るために固定した後すぐに実行する必要があります。腺はまた、ウエスタンブロット分析に続いて、SDS-PAGE用のRIPA緩衝液で溶解することができる。 </li></ol>

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	<li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+development.">Salivary gland development.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li><li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+organ+culture.">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19 (2008).</li><li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+gland+branching+morphogenesis.">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland.">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li><li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development:+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms.">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li><li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis:+investigating+growth+factor/matrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development.">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li><li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+and+tooth+morphogenesis:+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture.">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li><li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate.">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li><li>Bornstein, P., Traub, W., Neurath, H., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+collagen.">The chemistry and biology of collagen.</a> The Proteins. 4, 412-632 (1979).</li><li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin,+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture.">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity.">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li><li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis.">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li><li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds.">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li><li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development.">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li><li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis.">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li><li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis.">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis.">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis.">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li><li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells.">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li><li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands.">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li><li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands.">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ex vivoでの上皮間葉組換え技術は、1981年に初めて16で顎下唾液腺のために公開されていました。このプロトコルでは、再結合された腺のコンテキスト内で上皮細胞の遺伝子発現を操作するためにアデノウイルス感染を用いて、元のメソッドを拡張。感染している細胞の割合は、ウイルスプロモーターの性質、ウイルス力価およびウイルス純度に依存するのに対し、我々は、上皮...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まないDMEM /ハムF12培地</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 15070-163 </td><td> 10X株式</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 17105-041 </td><td> -20Cで単一使用アリコートを凍結</td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマ</td><td> A2934-100G </td><td>フラクションV、低エンドトキシン</td></tr><tr><td>アデノX-GFP </td><td> BD Biosciences社</td><td> 8138から1 </td><td>高力価（1×10 10 pfu / ml）をする必要があります。セシウム精製ウイルスは、このアッセイにおいて、カラム精製ウイルスよりも効果的です。 </td></tr><tr><td> 16％パラホルムアルデヒド</td><td&gt;電子顕微鏡学</td><td> 15710 </td><td> 5％スクロース（w / v）を含むPBS中2％に希釈</td></tr><tr><td> 1Xリン酸緩衝食塩水（PBS） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 70011-044 </td><td> 10Xストックから調製</td></tr><tr><td>ハンクス液</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 14175095 </td><td>全くカルシウムなし、マグネシウム、無フェノールレッド</td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td>シグマ</td><td> T8158 </td><td> 25ミリグラム/ DMEM/F12メディアにおけるミリリットル原液。 -20Cでシングルユースのアリコートを凍結</td></tr><tr><td> L-アスコルビン酸（ビタミンC） </td><td>シグマ</td><td> A4403 </td><td> -20CでDMEM/F12 media.Freezeシングルユースのアリコートで75 mg / mlの原液</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1。組み換えプロトコルをSMGに必要な試薬のリスト。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 10センチメートル滅菌したプラスチック製の皿</td><td>コー​​ニング</td><td> 430167 </td><td>非組織培養処理プレートを使用することもできます。 </td></tr><tr><td>透過光ベース付きステレオ解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> SMZ645 </td><td>顕微鏡を解剖し、あらゆるステレオ、透過光のベースを持っていることを使用することができます。 </td></tr><tr><td> 35ミリメートルの組織培養皿</td><td>ファルコン</td><td> 353001 </td><td>非組織培養処理プレートを使用することもできます。 </td></tr><tr><td>直径50mmのマイクロウェル皿</td><td>マテック株式会社</td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nucleporeトラックエッチメンブレンフィルター</td><td>ワットマン</td><td> 110405 </td><td>直径13mm、0.1mmの細孔径</td></tr><tr><td>広視野蛍光顕微鏡</td><td>カールツァイス、米国</td><td>アクシオオブザーバーZ1 </td><td>任意の蛍光顕微鏡（直立、Invertedまたはステレオ解剖顕微鏡）添付されたデジタルカメラで低倍率でGFPの発現をモニターするために使用することができます。 </td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> TCS SP5 </td><td>共焦点顕微鏡は、詳細なセル構造を参照してくださいする必要があります。任意の共焦点顕微鏡を使用することができます。 </td></tr><tr><td>時限妊娠雌マウス、ひずみのCD-1またはICR </td><td>チャールズリバー研究所</td><td></td><td>胚は13日（0日として指定されたプラグインの発見の日を含む）に収穫されます。 </td></tr><tr><td>メスの刃＃11 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10011から00 </td><td></td></tr><tr><td>スカルペルハンドル＃3 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10003から12 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子INOX合金、0.05ミリメートルX 0.02ミリメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11252から20 </td><td>胚から腺を収穫するための理想的な</td></tr><tr><td&gt;デュモン＃5鉗子dumostar合金、0.05ミリメートルX 0.01ミリメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11295から20 </td><td>ファインヒントは上皮から間葉を除去するために必要とされる。タングステン針を使用することもできます。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2機器組プロトコルをSMGで使用されます。 </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

分枝形態形成することは、多くの臓器の開発中に発生し、マウス胎児の顎下腺（SMG）は、分枝形態形成の研究のための古典的なモデルである。 -最終的に口腔1に、それぞれ、唾液を生産し、変更/輸送するために役立つ腺やダクトの複雑な分岐鎖のネットワークを生じさせるために、上皮芽とダクト形成のステップを反復開発SMGでは、このプロセスが含まれます3。細胞および分子イベントがコーディネートされている方法が、これらの細胞によって産生される間葉細胞、成長因子や細胞外マトリックスを含む上皮関連基底膜と間葉コンパートメントの側面は、、、、分岐メカニズムに不可欠な貧弱4を理解して残っている。分子メカニズムの研究では、上皮の形態形成の進歩の発達メカニズムの理解を推進し、可能レーゲナーへの洞察を提供ative医学的アプローチ。このような研究は、唾液上皮の遺伝子操作のための効果的な方法が不足しているため妨げられてきた。現在、アデノウイルス形質導入は 、in vivo 5 で成人腺上皮細胞を標的とするための最も効果的な方法を表しています。しかし、胚外植片に、緻密間葉と上皮細胞を取り巻く基底膜は、上皮細胞へのウイルスのアクセスを妨げている。間充織が削除された場合は、上皮はアデノウイルスを用いてトランスフェクトすることができ、および上皮初歩はマトリゲルまたはラミニン-111 6,7の存在下で分岐形態形成を再開することができます。間葉フリー上皮原基の成長はまた、可溶性増殖因子と追加の補充を必要とし、それをそのまま腺8で発生したような完全に分岐形態形成を再現していません。ここでは、トランスフェクトされたeの上皮細胞と文化のアデノウイルス形質導入を容易にする技術を説明関連した間充織とpithelium。胚のサブマシンガン、間葉の除去、およびGFP含有アデノウイルスによる上皮のウイルス感染の顕微解剖に続いて、我々はそのままSMG腺構造をrecapitulatingと分枝形態形成、上皮が自発的に感染していない間充織と再結合することを示している。蛍光タグ付きアデノウイルスコンストラクトが使用されている場合、遺伝的に修飾された上皮細胞集団は簡単に、標準的な蛍光顕微鏡法を使用して監視できます。ここで説明された組織の組換え方法は、現在、トランスジェニック動物の生成を必要としない複雑な3次元組織構築物内に野生型または変異型ベクターを用いた上皮細胞のトランスフェクションのための最も効果的かつアクセス可能な方法である。

主要な実験手順のフローを図1に概説されています。無傷のSMGは、隔離された原基上皮、およびそれに対応する間充織の例を図2に示す。ときに指示された時間のために培養されたex vivoで分岐形態形成を継続して受ける組み換えられたサブマシンガンの明視野像を図3に示す。上皮GFPを発現している48時間成長させ再結合腺が図4</str...

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

遺伝的に全体の内の上皮細胞を操作する技術<em&gt; ex vivoで</emウイルスの遺伝子導入を用いて&gt;培養胚マウス顎下腺（サブマシンガン）が記述されている。この方法では、自発的にアデノウイルスベクターを用いた上皮初歩の分離及び感染後再結合する上皮と間充織をSMGの生得的な能力を活用しています。

唾液腺器官培養の遺伝子改変と再結合

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.8K ビュー.  University at Albany, SUNY. 遺伝的に全体の内の上皮細胞を操作する技術 ex vivoで培養胚マウス顎下腺（サブマシンガン）が記述されている。この方法では、自発的にアデノウイルスベクターを用いた上皮初歩の分離及び感染後再結合する上皮と間充織をSMGの生得的な能力を活用しています。

ビデオ: Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

AEから中腸と唾液腺の解剖。ネッタイシマカ蚊

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

生物学

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2 - dGuo処理した胸腺器官培養の準備

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

マウス唾液腺幹細胞の単離

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

シアノゲートモジュラークローニングツールキットを用いたコンジュゲーションによるシアノバクテリアの遺伝子改変

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

アノフェレスガンビー蚊からの幼虫唾液腺の解剖と免疫染色

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...