当研究室の研究は、NIHの学内研究プログラム、アルコール乱用やアルコール依存症の国民の協会によってサポートされています。

<html>注射のためのI.準備このセクションでは、神経細胞の核内にcDNAを注入する前に取られる必要のある準備の手順を説明します。神経細胞の分離手順については、この資料の範囲外ですが、それは個々の細胞に解離神経細胞を持っていると（これを達成するために役立つヒントのためのディスカッションを参照）35 mmの細胞培養皿の底面によく付着することが重要です。別のニューロンの様々な潜在的に使用することができるが、それらが便利にアクセス可能であり、神経細胞の多数を得るため、そのような上頚神経節（SCG）または背根神経節などの末梢神経節は解剖のために好ましい。 SCGニューロンを使用しての付加的な利点は、比較的均一な細胞の集団と十分に特徴付けられた1,2,3,4であることです。 注射のためのcDNAをプラスミドのA.の準備<ol><li> DNAの汚染あるいは破壊を防止するために、手袋は準備中に着用してください。 </li><li>関心のあるタンパク質をコードするDNAは、非常にと構成的に活性なサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下で、PCIなどの適切な哺乳動物発現ベクター、（プロメガ社、マディソン、WI）にサブクローン化されています。タンパク質にラベルが付いていない場合、例えばレポータープラスミド、エンコードEGFP（pEGFPを- N1、BD Biosciences社クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州）は、成功した注射や表現を確認するために共同注入されます。 DNAは高品質の分離カラムを用いて単離し（例えばQIAfilterミディプレップキット、キアゲン社、チャッツワース、カリフォルニア州）とさらにで微粒子を除去するためにPVDFフィルター（0.1μm以下、ミリポア、ベッドフォード、MA）で遠心フィルターユニットを用いて精製する注入処理中に注入ピペットを妨害できるプラスミドの調製、。プラスミドは、適切なDNAの記憶のバッファー（10 mMトリス、1mMのEDTA、pH8.0の例：TEバッファー）で約1μg/μlの濃度で-20℃で保存されています。 </li><li>マイクロインジェクションの直前に、プラスミドのcDNAをTEバッファーまたはH 2 O中の所望の最終濃度に希釈し、混合されています通常は、5〜10 ngの/レポーター遺伝子の液は注入​​された細胞を標識するのに十分であり、そしてDNAが高濃度で粘度が高いとインジェクションピペットを詰まらせることができるので、注入されるcDNAの合計濃度が200 ng /μLのを超えてはならない。注入（5〜10μlの）のためのcDNAの少量をパラフィルムの小片（裏紙の下側）の清浄表面上の解の滴を混合することによって調製される。 pipetorで数回上下にペッティングで一緒にソリューションの滴を混合し、混合時に気泡を導入することは避けてください。 </li><li> microloaderのピペットチップ（エッペンドルフ、ブリンクマンインスツルメンツ、ウェストベリー、ニューヨーク州）を使用して、特別に調製されたヘマトクリット管（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）のcDNA溶液を移す。ヘマトクリット管を（材料表）の準備の手順については、材料のセクションを参照してください。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにcDNA注射液を含むヘマトクリットチューブを置きます。 </li><li>室温（20〜24 ° C）底質粒子へのcDNA溶液でブロックすることがありますその時に、固定角度やスイングバケットローター（エッペンドルフ）を搭載したマイクロ遠心機で10 000 gで15〜30分間チューブを遠心マイクロインジェクションピペット。 cDNAの注射液を注入セッション中に室温で保存することができます。 </li></ol>インジェクションピペットのB.作製<ol><li>使い捨てガラスマイクロインジェクションピペットは（マイクロインジェクションピペット当たり10ドル）が便利ですが、高価である、（例えばFemtotips、エッペンドルフ）市販されている。インジェクションピペットは、プログラム可能なP - 97燃えるブラウンピペットプラー（サター器械公司、ノヴァト、カリフォルニア州）とfilamented、薄肉ホウケイ酸ガラス毛細管（世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州）を用いて実験室で製造することができる。このオプションは、コスト効率が高くなりますし、マイクロインジェクションピペットの形状とサイズの制御が可能になります。 </li><li>二段階のプログラムが狭いマイクロインジェクションピペットチップをプルするために使用されます。マイクロインジェクションピペットの開口部は光学顕微鏡下で検査するには狭すぎるので、インジェクションピペットの品質は、プログラムの設定が確定される前に少数の細胞を注入することにより直接評価する必要があります。 ;（プル2）640、130、65、200（プル1）600、115、15、250：以下、熱、プル、速度と時刻の設定のためのおおよその設定です。これらの設定は、ガラスの異なるバッチとし、引き手の加熱フィラメントの状態によって様々であり、必要に応じて調整する必要があります。詳細については5を参照してください。 </li><li>注射のセッション中に損害や問題の場合には、注入される神経細胞のディッシュあたり数（2-5）注射のピペットを引き出します。マイクロインジェクションピペットチップゴミの浸入を防ぐために蓋をした容器に注入ピペットを保管してください。 </li></ol> II。核内微量注入テント&quot;&gt;このセクションでは神経細胞の核へのcDNAを投入するプロセスには、基本的なマイクロインジェクションは、セットアッププロセスを可視化するために倒立位相差顕微鏡（例えばニコンDiaphot TMD、ニコン、メルヴィル、ニューヨーク州）、マイクロマニピュレーターを（含まれています例：ピペットからcDNA溶液を追放するために射出ピペットと圧力注入器（例えば、エッペンドルフFemtoJetエクスプレス）の動きを制御する。マニピュレータに圧力注入器を接続するエッペンドルフ5171）は、注射時に後者の二つのプロセスの同期が可能になります。その他オプションですが、強く推奨、コンポーネントがマウントされているビデオ監視システム（CCDカメラ、Cohu社、サンディエゴ、カリフォルニア州、黒と白のビデオモニター、ソニー株式会社、東京、日本）が含まれます。このシステムは、注射のための絶対条件ではない。ただし、黒と白のモニタは、細胞核のimproved可視化のために高いコントラストを提供し、長い注射セッション中に、より快適な視聴体験を提供しています。さらに、ハンドヘルドコントローラを操作するソフトウェアを実行しているラップトップコンピュータが、半利用でき​​る（詳細については説明を参照）注射のプロセスを自動化。 SCG神経細胞を注入するために理想的な時間は3-6時間後の解離です。この段階で、細胞がしっかりと皿の底に取り付けられた、球状であり、そして核は、単一または複数の核小体（図を含む、暗い膜と中央の丸い細胞小器官として、位相差顕微鏡下で、はっきりと見ることが1A）。 <ol><li>顕微鏡ステージの中央に解離ニューロンの皿を置きます。フォーカスを調整し、神経細胞の核がはっきり見えるように顕微鏡の位相差光学系を最適化する。 </li><li> microloaderのピペットチップを使用してマイクロインジェクションピペットに調製したcDNA溶液のピペットを2μl。これは遠心操作中に定住微粒子を巻き起こす可能性があるため、ヘマトクリット管の底部近くに解決策を策定することは避けてください。マイクロインジェクションピペットのフィラメントは、先端に解決策を描くのに役立ちますが、小さな気泡が消えない場合は、静かにそれらを取り除くために、ガラスの側面をフリックしてください。 </li><li>圧力インジェクタのキャピラリーホルダーにマイクロインジェクションピペットを挿入し、マイクロマニピュレータにホルダーを固定します。ホルダーは、45 °の角度で固定されています。 </li><li>皿にマイクロインジェクションピペットを下げます。ピペットで培養液に入ると、メニスカスは、光の屈折に影響を与えると神経細胞の画像品質を低下させるように形成されている。神経細胞の核が再びはっきりと見えるようになるまでこの問題を軽減するために、位相リングのタレットはわずかに相殺することができます。 </li><li>何らかの圧力噴射システムは、短時間マイクロインジェクションピペットの先端から最大空気圧を適用する&quot;クリーン&quot;機能を持っている。先端が詰まっているような場合開始する前に、注射時の破片のピペットを消去するには、この関数を使用します。この機能を使用中に払拭流体が画面上に表示されていない場合は、新しいインジェクションピペットで交換してください。 </li><li>中央視聴モニターのマイクロインジェクションピペットとニューロンの横と核小体と同じ焦点面で先端を合わせます。マイクロマニピュレータの下限z軸リミットとしてこの位置を設定します。この位置は、マイクロインジェクションピペットを注入中に進出する深さです。マイクロインジェクションピペットはニューロンの上部をクリアするので、今は約30μmのこの点、上記のヒントを置きます。 </li><li>エッペンドルフ5171マイクロマニピュレータの&quot;挿入&quot;モードは、核内注入を実行するには、以下の設定を使用して定義することができます。 注入機能がオンに設定され、 自由に動けなくする機能がオフに左をおいた。斜め注入パスは、（x -とz -軸に沿って）細胞の損傷の最小量を生成するため、 軸方向のモードは、注射のために使用する必要があります。 300μmの/ sの射出速度は十分であり、マイクロインジェクションピペットをセットz軸の上限に達すると圧力がビルドアップと同期させます。 </li><li>圧力注入器は、核内に注入されたcDNA溶液の量を制御します。 &quot;自動&quot;注入モードでは、DNAの配信は、接続されたマニピュレータによるリアルタイム制御と開始されます。 射出圧力 （Piは）100から200ヘクトパスカル（; 1ヘクトパスカル〜0.015 PSI HPA）;の間で設定する必要があります高い噴射圧は、注射の成功率や品質を改善しないと、マイクロインジェクションピペットチップのサイズやDNAの純度で他の問題を示している可能性があります。 0.3秒とピペットチップ内に培養液から粒子を吸蔵エントリを避けるために一定の正圧を供給する30 hPaの、、の補償の圧力 （PC）の注射の持続時間 （TI）を使用する必要があります。 </li><li>顕微鏡のXY軸ステージの制御を使用してマイクロインジェクションピペットの先端の下に注入されるニューロンを配置します。 Tの間の前後に着目して核の中心部に上記ピペットの先端を合わせます彼は先端および核小体。 </li><li>注入ボタンを（マイクロマニピュレータ上）を押して、核を注入する。射出工程では、マイクロインジェクションピペットおよびcDNA溶液の放出の動きは、マニピュレータによって制御されます。それは、目で成功した核内注射を確認することは困難ですが、比較的低粘度のcDNA溶液の注入（粘性原子力環境と比較して）は、多くの場合、位相差光学系の下に白い噴煙として表示され、注入の指標として用いることができる核内へ。時には、マイクロインジェクションピペットには核膜を貫通していないと、単に核をnudges。同じ位置での目の注射の試みは、核へのDNAの成功注入につながる可能性があります。細胞の腫脹は、通常、意図的でない細胞質注入を示している。また、重要な核の腫脹はよくすぐにその後の細胞死における神経細胞と通常の結果によって容認されていない、したがって、射出圧力および持続時間は、推奨値を超えないようにしてください。 </li><li>マイクロインジェクションピペットの下に次のニューロンを揃えるために顕微鏡のステージを再配置することによって神経細胞を注入し続ける。体系的に一晩インキュベーションインキュベーターにニューロンの皿を返す前に約50の核を注入するために料理をナビゲート。が正常に注入された神経細胞は、レポーター遺伝子の発現により翌日識別することができます。 </li></ol> III。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：上頸神経節（SCG）ニューロン。 ニューロンのSCGの位相コントラスト画像3時間後に解離（A）。この段階で、核はマイクロインジェクションピペットチップの配置を支援する目的を明確に表示されます。核は、単一の（左）または複数（右）暗い核小体を持つニューロンの中央に表示されます。 核（B）へのcDNA EGFPの注射を、次のニューロン16時間をSCG。左、位相コントラスト照明下で観察ニューロンをSCG。右、成功注入を示すと、一つのニューロンにEGFPの発現を生じる同じニューロンの落射蛍光像。 白いスケールバーは20μmである。 <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="図2" border="0" /> 図2：電流の全細胞記録異種発現したG -蛋白質を通じて、SCG神経細胞からK +（GIRK）チャンネルを整流内側に結合。 GIRK電流（I GIRK）は -140〜-60 mVの保持電位から+40 mV〜200ミリ秒の電圧ランプ（の挿入図）ノルエピネフリンによる内因性α2 -アドレナリン受容体の以下の活性化（NE、10μM）によって誘発された。スーパーインポーズのトレースは、同じニューロンからの録音であると示す前に（黒）とNE単独で（青）またはNEプラスの10mMのBa 2 +（赤）のどちらかの適用後。破線は、ゼロ電流レベルを示している。 私GIRK、含まれている外部の溶液（mMで）130のNaCl、5.4 KClを、10 HEPES、10のCaCl 2、0.8のMgCl 2、15グルコース、15ショ糖、および0.0003 TTXを記録するため、NaOHでpH7.4に調整。のMgCl 2、10 HEPES、4 MgATP、および0.3のNa 2 GTPのCaCl 2、2（mMで）135のKCl、11 EGTA、1が含まれている内部のレコーディングソリューションは、KOHでpH7.2に調整する。 現在の不足がuninjected SCGニューロンでNEの存在下で電圧ランプにより誘発される（）SCGニューロンは内因性のGIRKチャネルを発現していないことを示しています。 NE（B、左）にさらされるとプラスミドをコードするcDNAの成功注入機能GIRKチャネル11は、電圧ランプの間に大電流を生じさせる。 Gタンパク質共役受容体アゴニスト（NE）、内向き整流、および推定されるGIRKチャネルブロッカーによる電流のブロックは、Ba 2 +（B、右の赤のトレース）による活性化：電流がGIRKチャネルを流れる電流の典型的な特徴を持っている。オープンと黒丸は、私はそれぞれ、保持とピーク電流でGIRK表しています。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。

<ol>
	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

一般的な問題が発生したため、提案： 前述したように、成功した核注射は組織培養プレートに接着細胞を持つに依存します。注射の開始を延期する細胞解離の手順に従って、数時間は、神経細胞が皿の底に付着することができます。加えて、高分子量ポリ- L -リジン（シグマ、セントルイス、MO）皿の底面にニューロンのエイズの付着の0.1 mg / mlのあるコーティングの料理。 マイクロインジェクションピペットの閉塞は、DNAの高濃度を注入しようとする場合は特に、頻繁に問題になる可能性があります。プラスミドDNAを単離精製する高品質の分離カラムを使用して、と説明した追加の精製の手順を実行する（スピンフィルター、ヘマトクリット管で回転する）前に注入するの微粒子を除去することができます。注射時には、圧力インジェクタの&quot;クリーン&quot;機能が（0.2秒で十分です）を使用できますが、それでも問題が解決しない場合は、新しいインジェクションピペットを使用する必要があります。マイクロインジェクションピペットの大半は注射セッション中に目詰まりした場合、大きな開口部にマイクロインジェクションピペットチップを生成するためにガラスのピペットプラーの設定を変更することを検討。 核の注入時に発生するもう1つの問題は、組織培養皿の底面の凹凸です。この変動は、直接注射時のピペットを通過するが固定されている深さ以来核にインジェクションピペットチップのターゲティング精度に影響を与えます。したがって、このz軸の制限が同じ皿内注射の過程で調整する必要があります。核注入の兆候（核または細胞には白色噴煙が完全に失われていない）がないもの、または注入ピペットの先端に近いセルを​​圧縮する皿の底（に来る：調整が必要なときにそれは明らかであろうまたは偶数）皿の底にピペットチップをクラッシュ。ガラスクローニングシリンダー（外径10ミリメートル、カタログ番号2090から01010、Bellcoガラス、ヴァインランド、ニュージャージー州）より小さく、より狭い場所でそれらを制限するニューロンのメッキ時に使用することができるので移動させるのに必要な距離を最小限に抑える注射の間に注入ピペット。これらのクローニングシリンダーはmicroinjectionsを実行する前に削除されます。 手法の欠点： 核内microinjectionsは、技術的にオペレータによって忍耐と手先の器用さの高い学位を必要とする、要求している。この手法の能力は、他のスキルと同じように、練習が付属しています。したがって、実際の実験を試みる前に、単独でレポーター遺伝子の核内注射を練習することをお勧めします。さらに注入プロセスを支援するために、それはコンピュータプログラムにマイクロマニピュレータと圧力インジェクタの手順を統合することも可能です。このようなイゴールプロ（WaveMetrics社、オレゴン州レイクオスウィーゴ）などのプログラムはのための6,7,8を参照してマイクロインジェクションの設定を保存すると（注入プロセスを半自動化する多機能コントローラ（ShuttlePro、輪郭のデザイン、ウィンダム、NH）をプログラムするために利用することができます。詳細）。 核マイクロインジェクション法のもう一つの欠点は、低い成功率です。試行された核注射の約10〜20％はタンパク質発現につながる。 、この効率性が発現する細胞の多数を必要としないアプリケーションのための十分な可能性がある例のための電気生理学をしながら、様々な生化学的アッセイのためにこれが十分でない可能性があります。 技術のアプリケーション： その欠点にもかかわらず、DNAの核内マイクロインジェクションは、異種神経細胞でタンパク質を発現させるために非常に有用な技術である。 タンパク質発現の高レベルがあるため注射時の核、遺伝子の転写を調節する非常にアクティブなCMVプロモーター、および核内のプラスミドの長期安定性に放出されたプラスミドの多数の核microinjectionsで達成されています。 - 過剰発現タンパク質は、異種タンパク質の高レベルの内因性タンパク質を圧倒するために必要なドミナントネガティブの実験では特に便利です。核内注射のもう一つの利点は、複数の構成要素が注入されると核へのcDNA構築物の一貫性のある割合を提供する能力です。他のトランスフェクション法と、それは再現性よく同じ皿の中とトランスフェクションの間に別の細胞にそれぞれのDNA構築物の同比率を導入することが困難です。核へのcDNA溶液の直接注入は、変動のこのソースを排除し、発現したタンパク質の比率が効果的に滴定することができます。 従来のトランスフェクション法では低いため核9へのDNAの取り込みとreagトランスフェクションに関連付けられている化学物質の毒性の有糸分裂後の細胞に限られた有効性を持っているents 10。核microinjectionsは核内に機械的に遺伝物質を導入することにより、これらの問題を克服する。この手法はより複雑であるが、機能的な生物学的システムにおけるタンパク質の影響を研究する能力は、このテクニックの骨の折れる性質を補うよりも、内因性シグナル伝達経路で完了します。 動物のすべての実験手順は、動物実験のための健康のガイドラインの国立研究所に従って行った。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

初代神経細胞培養は、不死化細胞株に比べてより多くの生物学的に関連するシステムを表すため、蛋白質機能を研究する貴重なツールです。しかし、一次ニューロンの有糸分裂後の性質は、例えば、エレクトロまたは化学的媒介トランスフェクションなどの一般的な手順を使用して効果的な異種タンパク質の発現を防ぐことができます。従って、他の技術が効果的にこれらの非分裂細胞中のタンパク質を発現させるために採用されている必要があります。 この記事では、解離大人の交感神経ニューロンへのcDNA構築物の核内注射を行うために必要な手順を説明します。神経細胞の種類に適用されているこの技術は、正常に異種タンパク質の発現を誘導することができる。マイクロインジェクションの手順に不可欠な装置は、細胞、N 2（g）の圧力の配信システムに接続されているcDNA溶液で満たされたガラスの注入ピペット、およびマイクロマニピュレータを視覚化する倒立顕微鏡が含まれています。マニピュレータは、ピペットの先端からcDNA溶液を排出するために加圧N 2の短いパルスをマイクロインジェクションピペットの注入の動きを調整します。 この手法は、他の多くのトランスフェクション法に関連する毒性を持ち、一貫性のある比率で発現する複数のDNA構築物を有効にしていません。注入された細胞の数が少ないとよくそのような電気生理学的記録および光イメージングのような単一細胞の研究に適したマイクロインジェクションの手順を行いますが、細胞と高いトランスフェクション効率の大きい数を必要とする生化学的アッセイに理想的な場合があります。核内microinjectionsは機器と時間の投資が必要ですが、生理学的に適切な環境での異種タンパク質の高レベル発現を達成する能力は、この手法をタンパク質の機能を調査するために非常に有用なツールになります。

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

cDNAの直接核内注入は、有糸分裂後の細胞のための効果的なトランスフェクションの手法です。このメソッドは、単一または複数のcDNA構築物から異種タンパク質の発現の高いレベルを提供し、単一細胞アッセイの様々な生理学的に適切な環境で検討するタンパク質の機能を有効にします。

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

intranuclear-microinjection-dna-into-dissociated-adult-mammalian

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Biology

16.8K ビュー.  National Institutes of Health (NIH). cDNAの直接核内注入は、有糸分裂後の細胞のための効果的なトランスフェクションの手法です。このメソッドは、単一または複数のcDNA構築物から異種タンパク質の発現の高いレベルを提供し、単一細胞アッセイの様々な生理学的に適切な環境で検討するタンパク質の機能を有効にします。

ビデオ: Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

解離マウス皮質ニューロンの培養の準備

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

生物学

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

アダルトゼブラフィッシュへの腹腔内注射

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

偏上皮細胞へのプラスミドのマイクロインジェクションによる低分子量GTPaseの機能を解析する

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.