研究は、健康補助AI - 52381、CA138623とケンタッキー肺癌研究会とジェームズグラハムブラウンがんセンターの施設支援の国立研究所によってサポートされています。

方法顕微鏡の説明ライブセルイメージング実験では、Eclipse TE300ニコン倒立顕微鏡に接続されたTE - FM落射蛍光システムを使用して実行。顕微鏡は、加熱ステージを装備。クールなスナップHQデジタルB / W CCD（ローパーサイエンティフィック）カメラとLAMDA 10月2日光学フィルターチェンジャー（サター機器の会社）は、顕微鏡に接続されている。励起および発光波長はフィルタホイールで制御し、ランバ10月2日フィルタホイールコントローラによって制御される、サターインスツルメンツ（株）露光時間500 msは、生細胞でのRFPまたはGFPを表示するには十分なはずです。ハードウェアの制御や画像の取得は、Metamorphソフトウェアによって制御されます。 EGFP / DsRedをデュアルダイクロイック、クロマテクノロジー、本研究のためのフィルタの選択は、フィルタはS480/20x、S525/40mとS565/25x、GFPとRFPのためS620/60m、それぞれを設定している。このフィルターホイールは、6つのフィルターセットを収容することができます。顕微鏡は、ジョイスティックとの事前PROSCANステージコントローラに添付されます。これらのすべてのハードウェアの添付ファイルは、Metamorphソフトウェアによって制御することができます。顕微鏡は、マイクロピペットを保持するためにマイクロマニピュレータで添付されます。 A.は、ロイコトリエンB 4演出樹状細胞の遊走を測定上記の顕微鏡の設定を使用して、我々はリアルタイムで樹状細胞の遊走を指示、以下のリガンドのためのメソッドを開発しました。二つのマニピュレーター（成茂）は、顕微鏡に接続されている。 LTB 4勾配に向かってマウス骨髄由来樹状細胞（BMDCs）の走化性を記録した。ここで、我々は、マイクロピペットへの配位子をロードすると、細胞の方向性のある移動を監視するために顕微鏡の加熱ステージ上の走化性の実験を設定する、マイクロピペットプラーを使用して、マイクロピペットを準備する方法を説明します。このメソッドは、移行だけでなく、生細胞の走化性の阻害剤の効果を誘導で明確な化学誘引物質の有効性をテストするために適用することができます。マウスからBMDCs 21の単離は、Joveの22を含むいくつかの刊行物に記載されています。 1。 BMDCsの準備<ol><li>カバースリップの下のフッ素皿にし、それらを先に実験の16時間成長させる上でプレートはBMDCs（10日間培養後）。 </li><li>少なくとも2回は、（プレートに1 × PBSを3mlを加えるとバッファーを吸引によって）の1X PBS 3mLで細胞を洗浄。 </li><li>プレートに1XPBS 2 mlを加え。セルは実験のための準備が整いました。 ℃のインキュベーター前の実験への37の細胞を保つ。 </li></ol>マイクロピペットをロードしたリガンドの調製： <ol start="4"><li>垂直マイクロピペットプラー（成茂インターナショナル米国社）上に、ガラスキャピラリーチューブ（6&quot;、カタログ番号625500、AMシステムズ、INCガラス標準、0.75ミリメートル× 0.4 mm）を修正。 </li><li> 52に温度を保つ℃、ガラスは鋭いエッジの先端を形成するために溶融し、離れてプルすることができます。 </li><li>マイクロピペットホルダーの上にピペットを修正。 </li><li> M - 900（成茂インターナショナル米国、Inc）を顕微鏡下で見て、マイクロフォージを使用して、マイクロピペットのギザギザを滑らかに。 </li><li>各実験のために少なくとも10-20ピペットを準備します。注：マイクロピペットは、世界の精密機器（μのTIP、T1801TW1F）から購入することができます。 </li><li> 1 mLのeffendorf管に配位子の所望の濃度（現在の実験では100 nM LTB 4の500μL）を取ると、溶液中のマイクロピペットの先端を維持し、解決策は、マイクロピペット（埋め戻し）に入力することができます。 </li><li>リガンドのとシリンジ（1ccのツベルクリン注射器）に1 mLをとり、ゆっくりと上からマイクロピペットへのマイクロフィル針を（MF 28G - 5、世界の精密機器）を使用してリガンドを埋める。 </li><li>ピペットと配位子で満たされている1 mLシリンジに取り付けられた針（21 G 11 / 2）のチューブにピペットにしっかりフィットするチューブを、取り付けます。 </li><li>今、注意深く顕微鏡のステージに、マイクロピペット充填した配位子を移動して、マイクロマニピュレータに固定する。 </li><li>配位子が徐々に先端から放出されていることを確認するために注射器から少し圧力を適用する。 </li><li>顕微鏡にメッキ未熟BMDCsを持参し、加熱されたプレート（37 ° C）の段階でそれらを保つ。 </li><li>フッ素皿のふたを取り外します。 </li><li>油浸60X対物レンズを使用してセルをフォーカス。 </li><li>慎重に、細胞の近傍に&quot;粗マニュアルマニピュレータMN - 188NE&quot;を使用してピペットをロードしたリガンドをダウンさせる。 </li><li> &quot;油圧ファインマイクロMN - 188 NE&quot;を使用してピペットフォーカス。 </li><li>配位子が皿に解放されていることを確認する注射器から少し圧力を適用する。 </li><li> Metamorphソフトウェアを使用して2時間ごとに15秒で（10ミリ秒の露出）に提出明るいで取得する画像取得のパラメータを設定します。 </li><li> PRのため30分ごとに監視し続ける配位子への移行のogression。 </li><li>細胞をピペットチップで混雑している場合は、実験の移行を継続するために板の先端の位置を変更する。 </li></ol> B.測定GPCR（BLT1）と細胞質タンパク質（β-アレスチン）の相互作用、生細胞における転 1。プラスミドDNAコンストラクトの調製 DNAプラスミド構築の詳細はJala ら （2005）18で説明された。 2。 RBL - 2H3細胞へのヒトBLT1 - RFPおよびβ-アレスチン- GFPのトランスフェクション<ol><li>増殖培地で単層培養として、95％空気の加湿雰囲気下でC 37℃、5％CO 2をラット好塩基球Leukomia（RBL - 2H3）細胞を（60から70パーセントコンフルエンス）維持する（DMEM、15％FBSを添加した、2 T75フラスコ中mMのL -グルタミン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシン）。 </li><li>トリプシン- EDTA（0.05％トリプシン、0.53 mMのEDTA）6 mLを用い、37℃で5分間インキュベートすることにより、ディッシュ/フラスコから細胞を剥離〜95％空気の加湿雰囲気下でC、5％CO 2。静かに細胞の剥離の程度を監視するためにフラスコを振る。 </li><li>トリプシン- EDTAの6 mLを入れたフラスコに増殖培地6 mLを追加し、複数回上下にピペッティングして混合して細胞を集める。 15 mLのファルコンチューブに細胞を移す。 </li><li>血球計算板を用いて細胞をカウントし、トランスフェクション媒体の200μLで3分間再懸濁します（DMEM、20％FBS、50mMのHEPES）のために480グラムrpmで15 mLの遠心チューブと遠心分離機で4 × 10 6個の細胞を取る。あなたが3トランスフェクションを実行する場合は、細胞数およびトランスフェクション培地の量を増やすことによって、それに応じて細胞とトランスフェクションのメディアを準備する。 </li><li>少なくとも1.5μg/μLの濃度でトランスフェクトされるプラスミドを準備します。我々は、QIAGENのマキシのDNAプラスミドキットを用いてプラスミドDNAを準備する。 0.4センチメートル電極ギャップを持つ無菌電気泳動のキュベット、（Bio - Rad社＃16552088）、に人間BLT1 - RFP（25μg）を、β- arrestin1 - GFPについては、個々のまたは両方のプラスミドをコードするDNA（15μg）を追加します。 </li><li>上記の再懸濁した細胞を200μLを取ると一緒にhBLT1 - RFPまたはβ- arrestin1 - GFPまたは両方のいずれかを含むキュベットに置き、1 mLの滅菌ピペットで軽く混ぜる。 </li><li> 10分間、室温で上記のキュベットにしておきます。 </li><li>電圧250 Vと容量500μFとジーンパルサーIIで細胞をエレクトロポ。 </li><li>エレクトロポレーション後、細胞を10分間室温で滞在ができます。 </li><li>定期的な増殖培地1 mLをとり、キュベットにエレクトロポレーションした細胞と混ぜる。 </li><li> 、5％のCOを、通常の増殖培地2 mLを含む、35 mmの組織のガラス底の培養皿（フッ素料理、世界の精密機器）にこの混合物300μLを配布し、37℃で1時間インキュベート° Cを95％空気の加湿雰囲気下で2。細胞は皿の底に付着することができます。 </li><li>定期的な増殖培地とのインキュベーションの1時間後にメディアを交換し、それらは37で成長できるように95℃％空気の加湿雰囲気下でC、5％CO 2インキュベーターを18〜24時間のために。 </li></ol> 3。ライブセルイメージング画像の取得<ol><li> 18から24時間後、10mMのHEPES、pHが7.55を（プレートと吸引のメディアに直接暖かいメディアの2 mlを加え2〜3回繰り返す）を含む暖かいフェノールレッドを含まないRPMI 2 mLで細胞を2〜3回洗浄する。 10mMのHEPESを含む暖かいフェノールレッドを含まないRPMIの1.8 mLを加え。 </li><li> hBLT1 - RFPおよび加熱顕微鏡のステージ上でβ- arrestin1 - GFP（37℃）でトランスフェクトしたRBL - 2H3細胞を、含んでいる場所30mmのガラスカバースリップ底培養皿。 </li><li> （私たちの顕微鏡システムで利用可能）60 X客観ニコンプランアポ60X/1.4開口数の油浸レンズを用いて600倍の倍率で、細胞の画像を収集する。 </li><li> 60 ×客観的なレンズの1つの油滴を入れて、プレートの底に触れることにより、通常の明視野透過光で細胞を集中する。 </li><li>トランスフェクトされたタンパク質の蛍光、蛍光フィルター（RFPフィルタ、あなたがβ- arrestin1を表示する場合は、受容体またはGFPを表示する場合）に、明視野（透過光）からスイッチを監視するには。 </li><li> RFPフィルタを使用して細胞表面上hBLT1 - RFPを発現し、イメージをキャプチャ明るく健康な細胞を、選択してください。 </li><li>その後、GFPフィルターにシフトし、β-アレスチン- GFPは細胞質で発現していることを確認し、イメージをキャプチャします。その後、擬似カラー、両方のイメージ、キャプチャ時間は蛍光の裏写りがRFPとGFPとの間に発生を取っていないことを確認するためのライブセルイメージを経過する前に。 </li><li>あなたの細胞の選択がなされると、ソフトウェア（このインスタンスでMetamorphソフトウェア）を使用して、目的に応じてパラメータを設定します。 </li><li>現在のデモでは、16ビットの画像は来たで取得されていますRAのビニング1に設定する60 X客観ニコンプランアポ60X/1.4開口数の油浸レンズと組み合わせたX 1。 </li><li> Metamorphソフトウェアによって制御されるこれらの使用してフィルタホイールの30秒の時間間隔（転座/相互作用が速すぎる場合は、1つは時間間隔を減らすことができる）で同時にRFPとGFPの蛍光色素の蛍光画像を収集する。 </li><li>カメラの露光時間は、RFPとGFPのために1000ミリ秒に設定。 （RFPとGFPの蛍光強度に応じて、特定の露光時間を設定します）。 </li><li>最初の0タイムポイントとして機能するリガンドを、追加せずに1分間の画像を収集する。 </li><li>プレート/または細胞の位置を乱すことなく、1分後のリガンドの200μL（10μMのストックから1μMの最終濃度まで）を追加します。 </li><li>蛍光イメージは、ファイル名の昇順でリガンドを添加した後60分間に収集し、TIFF画像として保存されます。 </li><li>すべてのこれらのファイルは、ソフトウェアを使用してタイムスタンプを持つ個々の/複合蛍光画像とスタックファイルとして作ることができます。 </li></ol>画像とタンパク質と局在の蛍光の定量化のプロセス<ol><li> RFPとGFP蛍光フィルター付きのプレーンメディア（無細胞）を使用して画像を取得し、背景画像として保存します。上記で得られた実際のデータの画像から減算するこれらの画像を使用してください。 </li><li> RFPとGFPの画像ごとに個別の画像のスタックを準備します。 </li><li> RFPとGFPの蛍光強度（BLT1およびβ-アレスチン転座）を測定するために様々な領域（表面対細胞質ゾル）を選択/定義</li><li>時間の関数としての量が蛍光強度をプロットします。このグラフは、与えられた分子の移動の動力学に関する情報を提供します。 </li></ol>代表的な結果 A.は、ロイコトリエンB 4演出樹状細胞の遊走を測定このプロトコールに記載されている方法は、ロイコトリエンB 4（図1と接続されているビデオ1）21に向かって樹状細胞の移動を決定するために使用された。我々は生きている細胞内の特定のリガンドに対する細胞の走化能力を決定するために同様の方法論を適用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="図1" /> 100nMのLTB 4に向かって樹状細胞の遊走派生図1。マウスの骨髄。 ビデオは1。LTB 4に向かってBMDCsの細胞遊走をライブ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Boddulrui_Video1.AVI">ビデオを見るにはここをクリック</a> 。 B.測定GPCR（BLT1）と細胞質タンパク質（β-アレスチン）の相互作用、生細胞における転この手順の完了時に、人はGPCRシグナル伝達イベントに次の情報を得ることができます。 <ol class="lroman"><li> GPCRとサイトゾルタンパク質と核の局在（図2）。 </li><li>リガンドは、細胞質タンパク質（この場合はβ-アレスチン）（図3）で表面GPCR（この場合はBLT1）の相互作用を誘導した。 </li><li>受容体の内在化と受容体（図4）（Jala ら、2005）18と一緒にインターナリゼーションに続く膜にβ-アレスチン転座の動力学。 </li><li>一つは、生細胞におけるリガンド依存性の受容体の活性化の状態を（ビデオ2添付）を決定し、受容体の活性化（Jala ら、2005）18に関与する重要なモチーフやプロセスを決定することができます。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。RBL - 2H3細胞にBLT1 - RFP（A）、β-アレスチン- GFP（B）、pNuc - CFP（C）の発現。パネルDに示すように、カラー合成画像<img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="図3" /> 図3受容体とβ-アレスチンのリガンド誘発転座。細胞の蛍光強度のラインスキャンが表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。受容体の内在化と1μMLTB 4の添加によりβ-アレスチン転の速度論。蛍光強度は、膜と細胞の細胞質ゾルの場所で時間の関数として測定した。 1μMのLTB 4の添加によりBLT1 - RFPおよびβ-アレスチン- GFPを発現する細胞のビデオ2ライブイメージングは。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Bodduluri_Video2.AVI">ビデオを見るにはここをクリック</a>

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	<li>Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors:+molecular+mechanisms+involved+in+receptor+activation+and+selectivity+of+G-protein+recognition.">G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition.</a> FASEB J. 11, 346-354 (1997).</li><li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors.">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beta-arrestins+in+the+regulation+of+seven-membrane-spanning+receptor+trafficking+and+signalling.">Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling.</a> Biochem J. 375, 503-515 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-arrest	or.">Beta-arrest	or.</a> Nature. 383, 447-450 (1996).</li><li>Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. 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R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotrienes+and+atherosclerosis:+new+roles+for+old+mediators.">Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators.</a> Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).</li><li>Heller, E. 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利害の衝突は宣言されません。

ライブセルイメージングが発生したときに、リアルタイムで特定のタンパク質の機能と相互作用を実証するために強力なツールです。この原稿で説明する方法は明らかにLTB 4は、樹状細胞の迅速な移行を誘導できることを示している。これらのメソッドは、唯一の多様な細胞型にLTB 4の機能の側面を展開していない、彼らは同じような方法が他のケモカインの様々に適用する?...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell lines:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CRL-2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Delbecco's modified Eagle&#x2019;s Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol red free RPMI or DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11835-030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES (1M)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Others:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>FD35-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>16552088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Instruments/software:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser II electroporater </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Universal Imaging</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vertical Micro-pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-Forge M-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hadraulic Micromanipulator MO-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coarse Manual Manipulator, MN-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA constructs:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (&beta;-arrestin1-GFP in present study).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

real-time imaging of leukotriene b4 mediated cell migration and blt1 interactions with &beta;-arrestin

G -タンパク質共役受容体（GPCR）は7回膜貫通型タンパク質ファミリーに属し、細胞内応答する細胞外シグナルの伝達を媒介する。 GPCRの制御などの走化性、細胞内カルシウムの放出、ヘテロ三量体G -タンパク質1から2を介してリガンド依存的に遺伝子の調節など、多様な生物学的機能。リガンドの結合は、そのようなサイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）、イノシトール三リン酸（IP3）とジアシルグリセロール（DG）などのセカンドメッセンジャーのレベルを調節するヘテロ三量体G -タンパク質の活性化につながる立体構造変化のシリーズを誘導する。受容体のリガンド結合の活性化との併用はまた脱感作、隔離および/または内在化を介したシグナル受容体を減衰させる一連のイベントを開始します。 GPCRの脱感作のプロセスは、G -タンパク質の受容体キナーゼ（GRKs）とβ-アレスチン3のその後の結合による受容体のリン酸化を介して行われます。 β-アレスチンは、細胞質タンパク質であり、受容体の内在化4-6容易にすることで、そこに（ほとんどの場合）リン酸化受容体に結合し、GPCRの活性化によって細胞膜に転位する。 とLTB 4受容体2（BLT2、低親和性受容体、ロイコトリエンB 4（LTB 4）GPCRの、LTB 4受容体1（高親和性受容体BLT1）を介してアラキドン酸経路と媒介する、その行動から派生した炎症誘発性脂質分子である）7-9。 LTB 4 - BLT1経路は、喘息、関節炎、アテローム性動脈硬化症10-17日 、など、いくつかの炎症性疾患において重要であることが示されている。現在の紙は、LTB 4誘発性白血球遊走およびβ-アレスチンと、顕微鏡イメージング技術の18から19を用いて生細胞における受容体の転座を持つBLT1の相互作用を監視するために開発した方法論を説明します。 C57BL / 6マウスから樹状細胞を骨髄由来は、前述の20〜21として単離し、培養した。これらの細胞は、LTB 4による細胞遊走を示すために、生細胞イメージング法で試験した。人間のBLT1は、C -末端に赤色蛍光タンパク質（BLT1 - RFP）を付けられ、β- arrestin1は、緑色蛍光タンパク質（β- ARR - GFP）で標識し、ラット好塩基球Leukomia（RBL - 2H3）細胞株に両方のプラスミドをトランスフェクトした18-19これらのタンパク質とローカリゼーション間の相互作用のカイネティクスは、ライブセルビデオ顕微鏡を用いてモニターした。現在の論文の方法論は、生細胞におけるGタンパク質共役型受容体の機能的応答を調べるために顕微鏡技術の使用を説明しています。現在の紙はまた、受容体の動態と細胞質蛋白質の相互作用を決定するために蛍光強度を定量化するMetamorphソフトウェアの使用を説明します。

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Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

本論文では、特定のリガンドへの白血球の走化性応答を決定し、生細胞イメージング技術を用いて細胞表面の受容体と細胞質のタンパク質間の相互作用を識別するための方法論を説明します。

ロイコトリエンBのリアルタイムイメージング 4介在細胞の移行とβ-アレスチンとBLT1の相互作用

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

12.7K ビュー.  University of Louisville. 本論文では、特定のリガンドへの白血球の走化性応答を決定し、生細胞イメージング技術を用いて細胞表面の受容体と細胞質のタンパク質間の相互作用を識別するための方法論を説明します。

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Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

免疫・感染学

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

使用して樹状細胞の移行の監視<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁気共鳴イメージング

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング<em&gt;のApc<sup&gt;最小/ +</sup</em&gt;腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

リアルタイム細胞解析を用いた宿主外でのインフルエンザウイルスの生存率のモニタリング

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

髄膜炎性大腸菌に感染した好中球における活性酸素種のリアルタイム定量

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...