SLは、DFG（大学院研究科845）から奨学金によって支えられている。この作品は、DFG（SFB 530/C1＆967用）からの補助金によってとHOMFORによってサポートされていました。

1。ストック溶液の調製<ol><li>カルシウムを含まない緩衝液（140mMのNaCl、5mMのKClを、1mMのMgCl 2、0.5mMのEGTA、10mMのHEPES - KOH、10 mMグルコース、液（pH 7.35））を用意。 </li><li>フラ-2可溶化は、1 mMのストック溶液を得るためにDMSOにいます。解決策は、均一光の黄色になるまでボルテックスを用いて混ぜる。光からカップを守る。フラ-2は、HeLa細胞からロードするための4μMの最終濃度に10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有する、1mlのダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）に原液午前希釈する。 </li><li>蒸留水（pH 7.0）で12.5 mMのピューロマイシンのストック溶液を調製。 -20℃で保存のアリコート500μMのピューロマイシンの最終濃度にカルシウムを含まない緩衝液で12.5 mMのピューロマイシンのストック溶液を希釈する。 </li><li> 1 mMのストック溶液を得るためにDMSOでタプシガルギンを溶かす。 </li><li> 20μlのクロロホルムで1 mg ophiobolinを可溶化し、その後、25μlのDMSOを混ぜる。クロロホルムが蒸発するまで、マイクロ遠心チューブは開いたまま。したがって、最終的なophiobolinの濃度は100 mMのです。 -20℃で保存のアリコート使用前に、最終濃度100μMにカルシウムを含まない緩衝液にストック溶液を希釈する。このように、生細胞イメージングのための最終DMSO濃度は0.1％を超えていない。 </li><li> -20℃で10mMのと店舗のアリコートの濃度にDMSOでトリフルオペラジンを溶かす使用前に10μMの最終濃度にカルシウムを含まない緩衝液にストック溶液を希釈する。したがって、生細胞イメージングのための最終DMSO濃度は、ophiobolin A用と同様に、0.1％を超えることはない。 </li><li> 20μMストック溶液を調製するためにRNaseフリー水でsiRNA（SEC61A1 siRNAは、SEC61A1 - UTRのsiRNAおよびコントロールsiRNAを）溶かす。ボルテックスを用いて混合し、目で可溶化を観察。 -20℃で保存50μlのアリコート</li></ol> 2。 HeLa細胞での遺伝子サイレンシング ERのCa 2 +流出の特定のタンパク質の寄与を調べるために、それぞれの遺伝子を効率的に二つの異なる種類のsiRNA（図1）で沈黙する必要があります。さらに、サイレンシングの効果は、それぞれの野生型遺伝子の発現によって克服されなければならない。一般的に我々は、目的の遺伝子のそれぞれのコーディングおよび非コーディング（UTR）地域、、に対して向けられるsiRNAを使用してください。 UTR -指示siRNAを採用することで補完するための便利な方法を提供します。 <ol><li> 25 mmのカバースリップ（1時間ポリ- L -リジン（1 mg / ml）を200μlで前処理した）6 cmの培養皿でシード5.2 × 10 5 HeLa細胞（ATCCない。CCL - 2） 10％ウシ胎児血清（FBS）と1％で、37ペニシリン/ストレプトマイシンとインキュベート℃、5％CO 2（最終容量3.9ミリリットル）の加湿環境でCを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）インチ</li><li> SEC61A1 siRNAは、SEC61A1 - UTRのsiRNA、または製造業者の指示（20 nMのsiRNAの最終濃度）に応じてHiPerFect Reagentのを使用して、ネガティブコントロールsiRNAを細胞にトランスフェクション。簡単に言えば、前に実際のトランスフェクションの手順に別個のマイクロ遠心チューブに新鮮なsiRNAを準備：OPTIMEMの80μlに溶解している各siRNAのを4μl（20μM）に20μlのHiPerFectトランスフェクション試薬を追加する。この混合物を穏やかにボルテックスし、10分間室温でインキュベートする。シード5.2 × 10 5 HeLa細胞（3.9 mL）に滴下したsiRNAミックスを（104μl）を添加。 </li><li> 24時間後、培地を変更（3.9 ml）と同じsiRNAのミックス（104μL）で2回目のために細胞をトランスフェクト。 </li><li>ウェスタンブロット分析によってサイレンシングを評価する。それが80％以上でなければなりません。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）とDMEMでそれらを収穫中の細胞培養皿から細胞を洗浄。伯爵自動セルカウンターを採用することにより細胞を数える。プロテアーゼ阻害剤カクテル（3μg/ mlのペプスタチン、3μgの/を補充細胞溶解緩衝液（10mMのNaCl、10mMトリス- HCl、pH8.0の、3 mMのMgCl 2、0.5％NP40）で細胞を溶解ロイペプチン、3μg/ mlのアンチパイン、3μg/ mlのChymastatin）とSDS -サンプルバッファーと混合（60mMのトリス- HCl、pH6.8で、2％SDS、10％グリセロール、5％β-メルカプトエタノール、0.01％ブロモフェノールブルー）10.000細胞/μlの最終濃度を得るために。熱サンプルを56℃15分間と、その後、断片のDNAへの20分間、いくつかのグラスビーズとボルテックスを追加するためのC。レムリ型SDS - PAGE（通常は分離ゲル用アクリルアミド15％）により、各サンプルの別の20μlを。転写バッファーで3時間または一晩（100mMのグリシン、12.5 mMトリス- HCl）のために一定の400mAで（&quot;ウェットブロット&quot;）エレクトロブロッティングによりPVDF膜上に分離したタンパク質を転送する。その後、その後、室温で30分間PBSで5％（w / v）の低脂肪粉乳とブロックとは、ウサギと抗β-アクチンからSec61αのC末端に対して向けられた一次抗体にブロットを公開マウスから抗体。 PBS - TritonX - 100（0.05％）とtでブロットを洗浄してくださいそれぞれ、5分間PBSでwice。 ECL Plexのヤギ抗ウサギIgG - Cy5標識またはECL Plexのヤギ抗マウスIgG - Cy3で共役とイメージクワントTLソフトウェア7.0との組み合わせで台風、トリオのイメージングシステムを用いて一次抗体を可視化する。 SEC61A1遺伝子の場合には、最大のサイレンシングの効果は、通常、最初のトランスフェクション後96時間を見られている。代表的な実験は、 図に示されています。 2。 </li></ol> 3。 HeLa細胞の相補性 SEC61A1サイレンシングの表現型を救出するためには、SEC61A1 cDNAををpcDNA3 -内部リボソーム侵入部位のマルチクローニングサイト（MCS）（IRES）- GFP -ベクトルサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、MCSを、含まれて挿入されたIRES、加えて緑fluoresecentタンパク質（GFP）をコードする配列。 <ol><li>第一のsiRNAトランスフェクション後48時間、両 ​​替二度目のための培地（3.9 ml）及び製造業者のプロトコール（トランスフェHDへのベクトルの最終的な比率である4μgのに応じてトランスフェHDを使用して空ベクターまたはプラスミドSEC61A1式のいずれかで細胞を形質転換16μlのトランスフェHDへのベクトル）。簡単に言えば、前の変換手順に別個のマイクロ遠心チューブに新鮮なプラスミドを準備する：OPTIMEMの80μlに溶解している各プラスミド4μgのために、16μlのトランスフェHD変換の試薬を追加する。 10分間室温で穏やかにボルテックスこのミックスとインキュベート。シード5.2への滴下プラスミド混合（0.1ml）を× 10 5 HeLa細胞を（3.9 ml）を追加。 </li><li>発現プラスミド、カルシウムイメージングと収穫前に蛍光顕微鏡法の対象と培養皿の48時間後。必要に応じて、より良い蛍光シグナルのためにPBSでDMEMに交換してください。冷却CCDカメラを装備した蛍光顕微鏡で蛍光画像を記録します。形質転換効率は明視野モードでカウントし、80％以上でなければならないの細胞でGFP蛍光を提示する細胞の数で割ることにより決定することができます。典型的な結果をFig。 3。 </li></ol> 4。生細胞のカルシウムイメージング<ol><li>測定前に、別々の3.5センチメートルの培養皿でトランスフェクトしたHeLa細胞でコーティングしたカバースリップを転送する。フラ-2は、25℃暗黒11,12のCで45分間1ミリリットルDMEMで午前4μMで細胞をロードします。 </li><li> IMIC金属チャンバーに25mmのカバーガラスを固定し、細胞を2回洗浄し、カルシウムを含まない緩衝液（各時間を300μl）でインキュベートする。 </li><li>交互に340nmおよび380nmで励起および510nm（：;エミッタ、70分の605 nmのビームスプリッター、565 nmのフィルターセット）で放出される蛍光を測定することにより、多色VとIMIC顕微鏡に関するデータの収集を開始。毎3秒20から50まで細胞/フレームが含まれているサンプル画像F340とF380のに対応する比率F340/F380として記録フラ-2信号、それぞれ、340および380nmで蛍光強度をバックグラウンドには、減算。 </li><li> 1分後に、カルシウムを含まない緩衝液で同じバッファを持つピューロマイシンで細胞を（500μM）と同様に取り扱う。また、小分子阻害剤（例えば、10μMのトリフルオペラジンまたは100μMophibolin Aなど）、またはカルシウムを含まない緩衝液で細胞を扱う。 </li><li>レシオメトリック測定の後、2または10分間行い（1μM）タプシガルギンを追加して、測定を継続しています。 </li><li>最終的には、cytoslicの[Ca 2 +]確立されたキャリブレーション法により比の測定から推定される。2は、Excel 2007と起源6.1でデータを分析。 </li></ol> 5。代表的な結果： これまでのところ、我々はSEC61A1遺伝子のサイレンシングはカルシウムに影響を及ぼすかどうかの質問（Ca 2 +）のER（図1）からの漏れを取り上げた。 SEC61A1遺伝子は 96時間HeLa細胞の2つの異なるsiRNAによるサイレンシングをした。ほとんど影響されない細胞増殖と生存率を黙らせる一方で、半透過性細胞のERへのタンパク質輸送はほぼ完全に阻害された。さらに、SEC61A1沈黙細胞が著しくERからのCa 2 +漏れを基準にして影響を受けました。遺伝子サイレンシングの効果はSEC61A1遺伝子の発現によって逆転した。したがって、すべての有核細胞の小胞体膜に存在するSec61複合体は、Ca 2 +ホメオスタシスの重要な役割を果たすことが期待できるのCa 2 +リークチャネルを形成する。しかし、ER膜のSec61複合体によって形成された制御されていないイオンの透過性を持つ大規模な、水で満たされた孔の存在は、真剣+ ERの内腔からサ ​​イトゾルへのCa 2の規制解除を妨げる、細胞内の重要な仕組みとシグナリング。我々は、バインドされたCaMのではなく、ナノモル親和性および配列特異性を持つのCa 2 + -フリーapocalmodulinいる哺乳類Sec61αの細胞質のN末端 ​​におけるカルモジュリン（CaM）結合モチーフを同定した。細胞レベルで、二つの異なるカルモジュリン拮抗薬は、Caを刺激<sup存在下ではなく、Sec61チャネル（4と5の図 ）の非存在下でERから&gt; 2 +放出。 Sec61チャネルがSec61αのIQモチーフに変異を含んでいることが存在していたときに、後者は観察されなかった。従って、 のCa 2 + -カルモジュリンはカルシウムを制限+ ER（ 図6）からの漏れをに関与している。 <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。フローチャート。詳細は本文を参照してください。 <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="図2"/> 図2効率を黙らせるためのデータ分析。サイレンシングはSec61αとβ-アクチン（ローディングコントロール）に対して向けられた抗体を用いたウェスタンブロット分析により評価した。一次抗体は、ECL Plexの二次抗体と蛍光イメージングを用いて可視化した。 <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。トランスフェクション効率のためのデータ分析。画像は、冷却CCDカメラを装備した蛍光顕微鏡で記録した。形質転換効率は明視野モードで計数した細胞でGFP蛍光を提示する細胞の数で割ることにより決定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="図4"/> コントロールまたはSEC61A1 - siRNAとCaMと拮抗ophiobolin A. HeLa細胞の有無の存在下でHeLa細胞の生細胞のカルシウムイメージングから図4。スクリーンショットはSEC61A1（B）またはに対するsiRNAで処理した示されるように96時間ネガティブコントロールsiRNA（）。これらの細胞はカルシウムインジケータフラ-2 AMをロードし、0.5mMのEGTAを含むCa 2 +の遊離緩衝液中でインキュベートし、その後、バッファ内のバッファまたはophiobolin Aは（Ophio）を添加し、インキュベーションが再開された。 10分後、Ca 2 +放出は、外部のCa 2 +の非存在下でタプシガルギン（TG）を適用することによって開始された+とインキュベーションを続けた。連続的なカルシウムイメージングからスクリーンショットは、指示された時間で撮影されました。 <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。生細胞のカルシウムイメージング実験のデータ解析。 図に示す一連の実験の（A）速度論と定量分析。 4A。 Cytoslicの[Ca 2 +]確立された校正方法2で比の測定から推定された。タプシガルギンの効果は、棒線図として示されています。 （BD）に細胞を48時間コントロールsiRNAまたはSEC61A1 - siRNAの指示で処理し、コントロールベクター（C）、またはプラスミドSEC61A1式（C）、または示されたプラスミド変異SEC61A1式（D）のどちらかで形質転換した。 48時間後、カルシウムイメージング実験は4と5Aを図のように実施された。細胞質ゾルのCa 2の変化の統計的分析+など示されているに示したような実験でタプシガルギン添加後の濃度。 P値が&lt;0.001は、対応のないt検定で有意差ありと定義され、3つのアスタリスク(***), NS、有意ではないで示されます。分析された細胞の数が示されている。平均値が与えられる、エラーバーは平均（SEM）の標準誤差を表しています。我々はこれらの例は、refから適応されたことに注意してください。 13。 <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="図6"/> 図6。これらのデータは、Sec61複合体から発生期のチェーンのリリースでは、確かにカルシウムの小胞体からの放出とSec61複合体の細胞質ゾルの口の周りにカルシウムのナノドメインの形成につながることを示している。このカルシウムはカルモジュリンとカルシウム - カルモジュリンによってバインドされていますSec61複合体を閉じます。&quot;

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	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling.">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+physiological+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells.">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li><li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores.">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li><li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation.">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li><li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum:+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes.">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li><li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry.">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li><li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocon+closure+to+Ca2++leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells.">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li><li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+form+ER+Ca2++leak+channels,+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer's+disease-linked+mutations.">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li><li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation.">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li><li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum.">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li><li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++signalling+by+Na+/Ca2++exchangers+in+mast+cells.">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li><li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC5+is+a+Ca2+-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2+-selective+ion+channels.">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li><li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

哺乳類細胞では、小胞体（ER）は、カルシウムシグナル伝達だけでなく、タンパク質生合成において重要な役割を果たしている。ここで、我々は、私たちは直接つの潜在的なのCa 2 +リークチャネルの役割に対処するため、その推定調節機構13を特徴付けることができる実験系を記載している。この実験系では、この受動的なのCa 2 +流出を制限するタンパク質とメカニズムを特徴づける様々な細胞型、IIのERからパッシブのCa 2 +流出の異なる小胞体膜タンパク質の寄与）を評価する）私に私たちのユニークな機会を与え、 ⅲ）関連するコンポーネントの病気リンクされている変異の影響を検討する。 我々は唯一の生存細胞を分析する必要があるとその全体的な生存率が80％以上でなければならないことに注意してください。したがって、細胞の生存率は、日常的に製造業者のプロトコールに従って核- ID緑/青の細胞の生存率の試薬を用いて評価されます。さらに、細胞質ゾルのCa 2の変化の統計的分析は、+濃度は必須です。したがって、実験では細胞の4つの別のバッチのために実施されなければならないし、少なくとも20細胞を二つカバースリップは、一回の実験の条件ごとに分析する必要があります。我々は、様々な実験はカバースリップ上で播種後、同時に実行しなければならないことに注意してください。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> DMEM +グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OPTIMEM +グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> PAA </td><td> P11 - 010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td>キアゲン</td><td> 301707 </td></tr><tr><td>トランスフェHD </td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 04709713 </td></tr><tr><td>核- IDブルー/グリーンの細胞生存率の試薬</td><td>エンツォ生命科学</td><td> ENZ - 53004 </td></tr><tr><td>フラ-2 AM </td><td>インビトロジェン</td><td> F - 1221 </td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>シグマ</td><td> P 7255 </td></tr><tr><td>タプシガルギン</td><td>インビトロジェン</td><td> T - 7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin </td><td>エンツォ生命科学</td><td> ALX - 270〜109 </td></tr><tr><td>トリフルオペラジン</td><td>シグマ</td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Countess ®自動化セルカウンター</td><td>インビトロジェン</td><td></td></tr><tr><td>台風-トリオイメージングシステム</td><td> GEヘルスケア</td><td></td></tr><tr><td> DS - 5McカメラとTE2000 - S顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td></tr><tr><td>多色VとIMIC顕微鏡</td><td>フォトニクスまで</td><td></td></tr></tbody></table>

live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms

哺乳類細胞では、小胞体（ER）が1シグナリング、カルシウムだけでなくタンパク質の生合成において重要な役割を果たしている。 ER膜のヘテロSec61複合体はERの内腔への新規合成ペプチドの水性パスを提供します。様々な研究室から最近の研究では、このヘテロ複合体はまた、一過性のCa 2 +リークチャネル2-8を形成する可能性が示唆された。この概念のための重要な観察 ​​は、ピューロマイシンは、+ ERからのCa 2の一時的な放出につながることによってリボソームとSec61複合体からの新生ポリペプチドのそのリリースでした。さらに、ER内腔タンパク質BIPがSec61複雑な9,10のレベルでのイオン透過性を防止するために関与していることがin vitroで観察されていた。私達は私達が直接潜在的なのCa 2 +リークチャネルとしてSec61複合体の役割に対処するため、その推定調節機構は11月13日特徴付けることができる実験系を確立しています。このシステムは、siRNAを介した遺伝子サイレンシングと生細胞のCa 2 +イメージング13を組み合わせたもの。細胞はSEC61A1遺伝子またはネガティブコントロールsiRNAを、それぞれ、符号化及び非翻訳領域（UTR）に対して向けられるのsiRNAで処理されています。相補性解析では、細胞は野生型SEC61A1遺伝子のsiRNAによる耐性発現を可能にするIRES - GFPベクターで同時トランスフェクトされています。その後、細胞は細胞質ゾルのCa 2同時に変更+蛍光顕微鏡を介して細胞数の濃度を監視するメトリックのCa 2 +インジケーターフラ-2を使用してロードされます。細胞質ゾルのCa 2の連続的な測定は、+また、ピューロマイシン、小分子阻害剤、およびCa 2タプシガルギン+漏れなど様々な薬剤の影響を評価することができます。この実験系では、この受動的なのCa 2 +流出を制限するタンパク質とメカニズムを特徴づける様々な細胞型、IIのERからパッシブのCa 2 +流出の異なる小胞体膜タンパク質の寄与）を評価する）私に私たちのユニークな機会を与え、 ⅲ）関連するコンポーネントの病気リンクされている変異の影響を検討する。

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Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

小胞体は、タンパク質の生合成とカルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている。私たちは、私たちはCa2 +のリークチャネルの役割に対処し、それらの推定調節機構を特徴づけることを可能にする実験系を確立しています。このシステムは、siRNAを介した遺伝子サイレンシングと生細胞のCa2 +イメージングを行います。

siRNAを介した遺伝子サイレンシングと組み合わせることで生細胞のカルシウムイメージングでは、CAを識別 2 + ER膜のリークチャネルとその調節機序

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

18.0K ビュー.  Saarland University. 小胞体は、タンパク質の生合成とカルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている。私たちは、私たちはCa2 +のリークチャネルの役割に対処し、それらの推定調節機構を特徴づけることを可能にする実験系を確立しています。このシステムは、siRNAを介した遺伝子サイレンシングと生細胞のCa2 +イメージングを行います。

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Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

生物学

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（TED）とERカルシウムの直接イメージング

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる<sup&gt; 2 +</sup孔形成毒素の傷の修復&gt;とスフィンゴミエリナーゼ

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects facilitated research in new facets of mosquito biology, including functional genetic studies in the primary African malaria vector Anopheles gambiae and the dengue and yellow fever vector Aedes aegypti. RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing has been used to target genes of interest in both of these disease vector mosquito species. Here, we describe a procedure for preparation of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are combined with food and ingested by larvae. This technically straightforward, high-throughput, and relatively inexpensive methodology, which is compatible with long double stranded RNA (dsRNA) or small interfering RNA (siRNA) molecules, has been used for the successful knockdown of a number of different genes in A. gambiae and A. aegypti larvae. Following larval feedings, knockdown, which is verified through qRT-PCR or in situ hybridization, can persist at least through the late pupal stage. This methodology may be applicable to a wide variety of mosquito and other insect species, including agricultural pests, as well as other non-model organisms. In addition to its utility in the research laboratory, in the future, chitosan, an inexpensive, non-toxic and biodegradable polymer, could potentially be utilized in the field.

Here we describe a procedure for inhibiting gene function in disease vector mosquitoes through the use of chitosan/interfering RNA nanoparticles that are ingested by larvae.

病気のベクトル蚊幼虫におけるキトサン/干渉RNAナノ粒子媒介遺伝子サイレンシング

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング<sup&gt; 2+</sup&gt;センサーキャッチャー<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.